Orientador: Jorg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T15:24:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nery_FlaviaCristina_D.pdf: 4972440 bytes, checksum: 86b749df91267d19e655449a4dfc3d0c (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Ki-1/57 é um antígeno humano de 57kDa reconhecido pelo anticorpo Ki-1, o qual também reconhece CD30. Ki-1/57 se encontra no núcleo e no citoplasma sendo fosforilado nos resíduos de serina e de treonina após a ativação das células. Quando Ki-1/57 foi isolado da linhagem L540 de células de linfoma de Hodgkin, ela co-imunoprecipitou com atividade quinase em resíduos de Ser/Thr. Além disso, foi relatado que Ki-1/57 interage com o ácido hialurônico e conseqüentemente foi denominada de ¿proteína intracelular que se liga a hialuronato 4¿ (IHABP4). Nós usamos o sistema de duplo híbrido em levedura e encontramos que Ki-1/57 interage especificamente com a proteína com domínios cromo-helicase e de ligação ao DNA 3 (CHD3), uma proteína nuclear envolvida em remodelagem da cromatina e regulação da transcrição, e com RACK1 (¿proteína adaptadora para quinase C ativada¿). A interação entre Ki-1/57 e seus ligantes foi confirmada por outros experimentos in vitro e in vivo. Interessantemente, a interação entre Ki-1/57 e RACK1 foi abolida após fosforilação da Ki-1/57 e observamos que o estímulo de células L540 e HeLa com 4 a -forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) resulta na saída de Ki-1/57 do núcleo. Ki-1/57 também demonstrou ser um substrato para proteína quinase C (PKC) quando ativada com PMA, e sua fosforilação foi confirmada in vitro e in vivo. Esses dados sugerem que Ki-1/57 está associada com a via de sinalização celular de RACK1/PKC e isto pode ser importante para a regulação de suas funções nucleares. Sua interação com CHD3 e com outras proteínas envolvidas na regulação transcricional, tais como: Topors, Daxx e Tip60, entre outras, sugere que Ki-1/57 pode ter uma função neste contexto funcional. RACK1 interage com p73, um parálogo de p53, inibindo sua ativação transcricional. Nós ainda encontramos que Ki-1/57 também interage com p53 não fosforilada e pode inibir sua ativação transcricional. A estrutura tridimensional da proteína Ki-1/57 é desconhecida, mas nossos estudos espectroscópicos mostraram que a proteína Ki-1/57 é predominantemente constituída por folhas b-pregueadas. Além disso, Ki-1/57(122-413) apagou o sinal do espectro de CD de RACK1 entre 229-300 nm, que é característico de proteínas ricas em triptofanos, e também diminuiu a intensidade de emissão de fluorescência de RACK1. Isso sugere que Ki-1/57 interage com os triptofanos na superfície de RACK1 / Abstract: Ki-1/57, the 57-kDa human protein antigen recognized by the CD30 antibody Ki-1, is a cytoplasmic and nuclear protein, which is phosphorylated on serine and threonine residues upon cell activation. When isolated from the Hodgkin¿s lymphoma analogous cell line L540 Ki-1/57 was co-immunoprecipitated with a Thr/Ser protein kinase activity. It has been also found to interact with hyaluronic acid and has therefore been termed intracellular hyaluronan binding protein 4 (IHABP4). We used the yeast-two-hybrid system to identify proteins interacting with Ki-1/57 and found that Ki-1/57 engages in specific interactions with the Chromatin-Helicase-DNA-binding domain protein 3 (CHD3), a nuclear protein involved in chromatin remodeling and transcription regulation, and with the adaptor protein Receptor of Activated Kinase-1 (RACK1). Next, we confirmed these interactions by in vitro and in vivo experiments. Interestingly, the interaction of Ki-1/57 with RACK1 is abolished upon activation of L540 cells with 4a-phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), which results in the phosphorylation of Ki-1/57 and its exit from the nucleus. We demonstrated that Ki-1/57 also co-precipitates with protein kinase C (PKC) when isolated from PMA activated L540 tumor cells and is a substrate for PKC phosphorylation in vitro and in vivo. These events associate Ki-1/57 with the RACK1/PKC pathway and may be important for the regulation of its nuclear functions. Its interaction with chromatin remodeling factors such as CHD3 and other proteins involved in transcriptional regulation including Topors, Daxx and Tip 60 may suggest that Ki-1/57 has also a function in this context and that this function is subject to regulatory events involving the PKC/RACK1 signaling pathway. RACK1 also interacts with the p53 paralogue p73. In that case, the physical binding of RACK1 to p73 can inhibit its transcription activation function. We found out that Ki-1/57 interacts with unphosphorylated p53 and that this binding inhibits p53 transcription activation function. The three-dimensional structure of Ki-1/57 is still unknown but our spectroscopic studies demonstrated that Ki-1/57 consists predominantly of b-sheets. Binding of Ki-1/57(122-413) to RACK1 abolishes its positive ellipticity at 229-300 nm, which is characteristic for tryptophan-rich proteins, and decreases its emission fluorescence. This suggests that surface tryptophans of RACK1 are involved in the interaction with Ki-1/57 / Doutorado / Genetica Humana e Medica / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Jörg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T16:47:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goncalves_KaliandradeAlmeida_D.pdf: 14162647 bytes, checksum: a062a24283fc9889ec54663e0b624c2f (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A proteína Ki-1/57 foi descoberta através da reação cruzada do anticorpo monoclonal Ki-1 em células do linfoma de Hodgkin. Estudos anteriores demonstraram que Ki-1/57 interage com a proteína RACK-1, sofre fosforilação por PKCs e metilação por PRMT1, uma arginino metiltransferase que modula diversas proteínas ligantes ao RNA. Estudos mostraram que Ki- 1/57 é capaz de controlar o splicing do pré-mRNA do gene viral E1A. Análises por SAXS, gel filtração analítica e ultracentrifugação analítica indicaram uma estrutura bastante alongada e flexível para a construção C-terminal 6xhis-(122-413)Ki-1/57. Ensaios de proteólise limitada também mostraram uma baixa composição de núcleos hidrofóbicos estáveis e compactos, sugerindo que a proteína é intrinsecamente desordenada, o que pode explicar o elevado número de diferentes proteínas parceiras que ela é capaz de interagir. Neste trabalho foi identificada a interação de Ki-1/57 com proteínas da Família do X frágil, e sua localização no Perfil Ribossomal, além de ser capaz de ativar a tradução quando conectada ao gene repórter da Luciferase. Outra observação importante é que Ki-1/57 é sumoilada in vitro e in vivo, sendo as lisinas alvos desta sumoilação identificadas, e a proteína não sumoilada é incapaz de atuar no splicing do pré-mRNA do gene viral E1A. Mais experimentos foram feitos no sentido de caracterizar a interação RACK-Ki-1/57. A interação entre as duas proteínas é forte, possuindo uma constante de dissociação de 0,7 ?M, seguindo uma estequiometria de 1:1 observada em experimentos de sedimentação em equilíbrio. Experimentos de ultracentrifugação analítica mostraram que a proteína RACK1 tem propriedades hidrodinâmicas similares ao seu modelo predito por homologia, e que em solução ela é encontrada em sua forma monomérica, possuindo uma leve tendência a agregação. A superexpressão de Ki-1/57 e CGI-55 provocou a alteração de 413 e 217 genes respectivamente, que em sua grande maioria foram regulados negativamente. A maioria dos genes, que foram inibidos pela superexpressão de Ki-1/57, estão envolvidos na proliferação celular, muitos sendo expressos em diferentes tumores. Os dados obtidos no teste do MTS confirmam que houve uma diminuição na proliferação celular em células superexpressando as proteínas Ki-1/57 e CGI-55. Com base nos resultados obtidos neste trabalho, novas funções da proteína Ki-1/57 foram descritas, tais como: a influência de Ki-1/57 na proliferação celular, na tradução proteica e o papel importante que a modificação pós traducional, como a sumoilação, representa para que a proteína Ki-1/57 desempenhe sua função / Abstract: The protein Ki-1/57 was discovered through cross reactivity of the monoclonal antibody Ki-1 in cells of Hodgkin lymphoma. Previously studies demonstrated that Ki-1/57 interacts with RACK-1 protein, undergoes phosphorylation by PKCs and methylation by PRMT1, an arginine methyltransferase that modulates several RNA binding proteins. Studies have shown that Ki- 1/57 is able to control the pre-mRNA splicing of the viral E1A gene. SAXS analysis, analytical gel filtration and analytical ultracentrifugation indicate a rather elongated and flexible structure to build C-terminal 6xhis-(122-413) Ki-1/57. Limited proteolysis assays also showed a low composition of stable and compact hydrophobic cores, suggesting that the protein is intrinsically unstructured, it could explain the wide array of protein partners with which it is able to interact. In this work we identified the interaction of Ki-1/57 proteins with Family fragile X, and its location on Ribosomal profile, besides being able to increase the translation when tethered to the reporter gene Luciferase. Another important observation is that Ki-1/57 is sumoylated in vitro and in vivo, the targets of this lysine sumoylated were identified, and the not somoylated protein is unable to act in the pre-mRNA splicing of E1A. More experiments were made to characterize the interaction of RACK1 with Ki-1/57. The interaction between the two proteins is strong, possessing a dissociation constant of 0.7 ?M and follows the stoichiometry of 1:1 as observed by sedimentation equilibrium experiments. Analytical ultracentrifugation experiments showed that human RACK1 has similar hydrodynamic properties to that predicted to homology model, and that in solution it is found in its monomeric form, with a slight tendency to aggregation. Overexpression of Ki-1/57 and CGI-55 caused changes in 413 and 217 genes respectively, which were mostly negative regulated. Most genes that were inhibited by overexpression of Ki-1/57 are involved in cell proliferation, and expressed in different types tumors. The MTS data obtained confirm a decrease in cell proliferation through overexpressing of Ki-1/57 and CGI-55 protein. Based on the results of this study new functions for Ki-1/57 protein have been described such as: the influence of Ki- 1/57 in cell proliferation, in protein translation and the important role that the post translational modification, such as sumoylation, represents so that the protein Ki-1/57 performs its function / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular