Alterações no receptor N-metil-D-aspartato(NMDAR) marcam o envelhecimento. Um dos efeitos desta via é a ativação da óxido nítrico sintase (NOS) e a produção GMP cíclico (GMPc), promovendo modulação da Na+,K+-ATPase. A proteína αKlotho tem função anti-envelhecimento, e os animais hipomórficos para klotho (kl-/-) são caracterizados por danos periféricos e no Sistema Nervoso Central (SNC). O objetivo deste trabalho é verificar possíveis alterações na via NMDAR-NOS-GMPc e na Na+,K+-ATPase no SNC de camundongos kl-/-. Os dados obtidos apontam para um aumento da fosforilação do NMDAR , atividade da NOS, e redução de GMPc em hipocampo. Em cerebelo ocorre uma redução na fosforilação do NMDAR, atividade da NOS, sem alterações nos níveis de GMPc. Diferenças na expressão das subunidades GluN2 do NMDAR ocorrem em ambas estruturas. Também, observamos uma redução na atividade da α2/α3-Na+,K+-ATPase em cerebelo, e alterações na expressão de α2 e α3 em hipocampo e de α2 em cerebelo. Os dados reforçam a participação destas vias nas alterações em SNC dos animais kl-/-. / Alterations in N-Methyl-D-Aspartate receptor (NMDAR) are typical features of aging. Nitric oxide synthase (NOS) activation and cyclic GMP (cGMP) production, promoting Na+,K+-ATPase modulation are key events in NMDAR signaling. αKlotho protein has anti-aging function, and mice carrying hypomorph allele for klotho gene (kl-/-) are characterized by systemic and central nervous system (CNS) damage. The aim of this work is to verify whether alterations in NMDAR-NOS-cGMP pathway and in Na+,K+-ATPase occur in the CNS of kl-/- mice. Present data point for an increase in NMDAR phosphorylation, NOS activity and reduction in cGMP levels. In cerebellum, a decrease in NMDAR phosphorylation and NOS activity occur, with no changes in cGMP levels. Both situations are followed by changes in GluN2 subunity expression. Furthermore, we saw a reduction in α2/α3-Na+,K+-ATPase activity in cerebellum, and alterations in α2 and α3 in hippocampus and in cerebellar α2. Data presented support these pathways participation in age related conditions, using kl-/- mice as a model to study CNS damage.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Lesões sistêmicas peri e pré-natais alteram o desenvolvimento do SNC, levando a problemas cognitivos e motores em crianças que podem perdurar por toda a vida. Um tipo particular de lesão é a hipóxia-isquemia (HI), caracterizada pela interrupção momentânea ou permanente do fluxo sanguíneo. Um dos mecanismos propostos para as lesões decorrentes da HI é a excitotoxicidade glutamatérgica. O uso de inibidores da neurotransmissão glutamatérgica tem sido estudados em diversos modelos de HI. Neste trabalho, avaliamos os efeitos morfofuncionais da administração de um antagonista não-competitivo do receptor de glutamato NMDA sobre o desenvolvimento do cerebelo. Ratas no 18 dia de gestação foram anestesiadas, os cornos uterinos expostos e as 4 artérias uterinas obstruídas por 45 minutos (Grupo H). Animais controle tiveram os úteros expostos, sem a obstrução (Grupo S). Após a cirurgia a gestação prosseguiu. Somente animais nascidos a termo foram utilizados. Um dia após o nascimento, metade de cada ninhada foi designada para receber MK801, 0,3mg/kg/dia, (grupos SM e HM) e a outra metade recebeu solução salina (grupos SS e HS), por 5 dias. Após anestesia e perfusão-fixação com paraformaldeído 4% aos 9, 23, 30 e 60 dias pós-natais, cortes parassagitais do cerebelo foram obtidos em criótomo e submetidos à imunohistoquímica para calbindina, GFAP, GLAST, PDGFRα e MBP. A partir de 45 dias de vida, os animais foram testados em vários de testes comportamentais: labirinto em cruz elevado (LCE), campo vazado (CV), ROTAROD, teste de caminhada sobre barras (ladder test) e teste do comprimento da passada (stride length). Aos 9 dias, a espessura da árvore dendrítica era menor nos animais SM, HS/HM, demonstrando efeitos deletérios tanto do MK801 quanto da HI. Menor número de células PDGFRα+ foi observado nos animais HS/HM, sem efeitos da administração de MK801. Aos 23 dias, maior número de células PDGFRα+ foi observado nos animais HM comparado aos outros 3 grupos, indicando efeito neuroprotetor do MK801. Nessa idade, menor número de fibras mielinizadas (MBP+) foi observada nos animais HS, e a administração de MK801 parece reverter estes efeitos. Aos 9 dias a distribuição de GLAST estava alterada nos animais HS, com os efeitos da HI parcialmente revertidos pelo MK801. Não foram observados efeitos da HI ou do MK801 sobre comportamentos relacionados a ansiedade pelo LCE, assim como na latência de queda no ROTAROD. HI piora a performance motora no ladder test. No teste do CV, não observamos efeitos da HI sobre a busca por novidade assim como sobre a atividade locomotora espontânea. No entanto, MK801 diminui comportamentos de autolimpeza e a atividade locomotora espontânea. Menor variação das passadas foi observada em decorrência da administração de MK801 no stride length, com nenhum efeito da HI. Nossos resultados demonstram que a inibição do receptor NMDA tem um efeito neuroprotetor sobre os progenitores de oligodendrócitos e mielinização, provavelmente pela manutenção da capacidade proliferativa por um período maior. A atividade do receptor NMDA exerce importante papel na diferenciação das células de Purkinje, assim como na distribuição do transportador GLAST, corroborando a importância deste receptor na gênese das lesões causadas pela HI. / Peri and prenatal systemic lesions alter CNS development leading to motor and cognitive problems in children that might persist throughout life. A particular kind of injury, the hypoxic ischemic (HI), is characterized by a permanent or temporary blockage of blood flow. One of the proposed mechanisms downstream from a HI event is called glutamatergic excitotoxicity. The administration of glutamate inhibitors has been studied in HI models for several years. In this work, we evaluated the effects of administration of a non-competitive antagonist of glutamate receptor, NMDA, on cerebellar development and behavioral tests of HI animals. Pregnant rats in the 18th gestational day were anesthetized, the uterine horns were exposed and the four uterine arteries were clamped for 45 minutes (group H). Sham controls had the uterine horns exposed, but no arteries were clamped (group S). Gestation proceeded after surgery. Only full term animals were used. One day after birth half the animals was assigned to receive either SALINE (groups SS and HS) or MK801 (groups SM and HM). Animals were anesthetized and perfused with 4% paraformaldehyde at 9, 23, 30 and 60 days of age. Parasagittal cerebellar sections were submitted to Calbindin, GFAP, GLAST, PDGFRα and MBP immunohistochemistry. Beginning at P45 animals were subjected to a battery of behavioral tests: elevated plus maze (EPM), hole board (HB), ROTAROD, ladder test and stride length. At P9 the dendritic tree of Purkinje cells were thinner in SM, HS/HM animals, indicating that both HI and MK801 are deleterious regarding this Purkinje cell differentiation. A lower number of PDGFRα+ cells was observed in HS/HM animals, with no effects of MK801 administration. At P23 a greater number of PDGFRα+ cells was found in HM animals when compared to the other 3 groups, demonstrating a neuroprotector effect of MK801. A lower number of myelinated fibers (MBP+) was observed in HS animals at P9, and MK801 administration reverse this effect. At P9, GLAST distribution was altered in HS animals, and MK801 partially reverse this altered distribution. No effects of HI and MK801 were observed in the EPM and ROTAROD tests. HI decreased motor performance of hind limbs in the ladder test, though no effect of MK801 was noted. In the HB test, we do not observe HI effects regarding the novelty seeking behavior and locomotor activity, otherwise the administration of MK801 decreased the number of grooming and locomotor activity. In the stride length test, we do not observed effects of HI although MK801 augmented the length variation of the fore limbs. Our results show that inhibition of NMDA receptors exerts a neuroprotector effect on oligodendrocyte progenitor cells and myelination, probably by temporarily inhibiting differentiation of those, providing more time to proliferate. NMDA activity exerts a crucial role in Purkinje cell differentiation as well as in GLAST distribution. Taken together our results lead us to conclude that NMDA receptor activity has an important role in the genesis of lesions caused by HI events.

Submitted by Rosivalda Pereira (mrs.pereira@ufma.br) on 2017-06-14T17:55:12Z No. of bitstreams: 1 RosaHelenaSilva.pdf: 2716670 bytes, checksum: 07dee1e77d704e91281c33c31e8c4938 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-14T17:55:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RosaHelenaSilva.pdf: 2716670 bytes, checksum: 07dee1e77d704e91281c33c31e8c4938 (MD5) Previous issue date: 2016-10-19 / Borreria verticillata (L.) G. Mey species known as broom vassourinha has antibacterial, antimalarial, hepatoprotective, antioxidative, analgesic and antiinflammatory activities; however, its antinociceptive action still demands more thorough investigation. The present study was to assess the antinociceptive activity of B. verticillata crude hydroalcoholic extract (EHBv) and the ethyl acetate fraction (FAc) by means of in vivo and in silico studies. In vivo assessment included the paw edema test, the writhing test, the formalin test and the tail flick test. Wistar rats and Swiss mice were divided into 6 groups and given the following treatments oral: 0.9% NaCl control group (CTL), 10 mg/kg memantine (MEM), 10 mg/kg indomethacin (INDO), 500 mg/kg EHBv (EHBv 500), 25 mg/kg FAC (FAc 25), 50 mg/kg and FAc (FAC 50). EHBv, FAc 25 and 50 treatments exhibited anti-edematous and peripheral antinociceptive effects. For in silico assessment, compounds found in FAc were subjected to molecular docking, and the leading compound was selected for molecular dynamics (MD) simulations. Ursolic acid exhibited better affinity parameters with the enzyme COX-2 and the NMDA receptor subunits GluN1a and GluN2B on molecular docking. In MD simulations, AU exhibited highly frequent interactions with residues Arg120 and Glu524 in the COX-2 active site and NMDA, whereby it might prevent COX-2 and NMDA receptor activation. Treatment with ursolic acid 10mg / Kg (AU) showed peripheral and central antinoceceptivo effect. The antinociceptive effect of B. verticillata might be predominantly attributed to peripheral actions, including the participation of anti-inflammatory components. Ursolic acid is the main active component and seems to be a promising source of COX-2 inhibitors and NMDA receptor antagonists / Borreria verticillata (L.) G. Mey espécie conhecida como vassourinha apresenta atividade antibacteriana, antimalárica, hepatoprotetora, antioxidante, analgésica e anti-inflamatória, entretanto sua atividade antinociceptiva é pouco estudada. O objetivo deste trabalho foi avaliar atividade antinociceptiva do extrato hidroalcoólico bruto (EHBv) e fração acetato de etila (FAc) de B. verticillata realizando estudos in vivo e in silico. Para avaliação in vivo, foram utilizados os testes do edema de pata, contorções abdominais, formalina e tail flick. Ratos Wistar e camundongos Swiss foram tratados via oral e divididos em 6 grupos: controle-NaCl 0.9%(CTL), memantina 10 mg/Kg (MEM), indometacina 10 mg/Kg (INDO), EHBv 500 mg/kg (EHBv 500), FAc 25 mg/Kg (FAc 25), FAc 50 mg/Kg (FAc 50). O tratamento com EHBv 500, FAc 25 e 50 apresentou efeito antiedematogênico e antinociceptivo periférico. Para avaliação in silico os compostos identificados na FAc foram submetidos a docagem molecular, o melhor composto foi selecionado para simulações de dinâmica e testado in vivo molecular. O ácido ursólico apresentou melhores parâmetros de afinidade com COX-2, GluN1a e GluN2B durante a docagem molecular. Nas simulações por dinâmica molecular, o ácido ursólico apresentou alta frequência de contatos com Arg120 e Glu524 do local ativo da COX- 2 e com o domínio LBD da Glun1a e GluN2B podendo com isso, impedir a ativação da COX-2 e do receptor NMDA. O tratamento com ácido ursólico 10mg/Kg (AU) apresentou efeito antinoceceptivo periférico e central. Sugere-se que o efeito antinociceptivo periférico de B. verticillata pode ser atribuído predominantemente à ação de compostos com ação anti-inflamatória. O ácido ursólico é o principal composto ativo, sendo um composto promissor para o desenvolvimento de fármacos inibidores da COX-2 e antagonistas dos receptores NMDA.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Spermidine (SPD) is an endogenous polyamine with polycationic structure present in the central nervous system of mammals. SPD regulates biological processes, such as Ca2+ influx by glutamatergic N-methyl-D-aspartate receptor (NMDA receptor), which has been associated with nitric oxide synthase (NOS) and cGMP/PKG pathway activation and a decrease of Na+,K+-ATPase activity in rats cerebral córtex synaptossomes. Decreased Na+,K+-ATPase activity, as well as decreased enzyme expression, directly impairs neurotransmitter signaling with deleterious consequences on learning and memory. The enzyme Na+,K+-ATPase establishes Na+ and K+ gradients across membranes of excitable cells and by this means maintains membrane potential and controls intracellular pH and volume. However, it has not been defined whether SPD modulates Na+,K+-ATPase activity in the hippocampus. In this study we investigated whether SPD alters Na+,K+-ATPase activity in slices of hippocampus from rats, and possible underlying mechanisms. Hippocampal slices and homogenates were incubated with SPD (0.05-10 μM) for 30 minutes. SPD (0.5 and 1 μM) decreased Na+,K+-ATPase activity in slices, but not in homogenates. MK-801 (100 μM), a non-competitive antagonist of NMDA receptor, arcaine (0.5 μM), an antagonist of the polyamine binding site at the NMDA receptor, and L-NAME (100 μM), a nitric oxide synthase inhibitor, prevented the inhibitory effect of SPD (0.5 μM). ODQ (10 μM), a guanylate cyclase inhibitor, and KT5823 (2 μM), a protein kinase G inhibitor, also prevented the inhibitory effect of SPD on Na+,K+-ATPase activity. SPD (0.5 and 1.0 μM) increased NO2 plus NO3 (NOx) levels in slices, MK-801 (100 μM) and arcaine (0.5 μM) prevented the effect of SPD (0.5 μM) on the NOx content. These results suggest that SPD-induced decrease of Na+,K+-ATPase activity involves NMDA/NOS/cGMP/PKG pathway. / A espermidina (SPD) é uma poliamina endógena com estrutura policatiônica presente no sistema nervoso central (SNC) de mamíferos. A SPD regula muitos processos biológicos, como o influxo de cálcio através dos receptores glutamatérgicos N-metil-D-aspartato (NMDA), o qual tem sido associado com a ativação da enzima óxido nítrico sintase (NOS) e da via de sinalização da guanosina mono fosfato cíclica/proteína quinase dependente de GMPc (GMPc/PKG). Sabe-se que uma diminuição da atividade da Na+,K+-ATPase, bem como a sua expressão, prejudica diretamente a sinalização de neurotransmissores, comprometendo tanto aprendizado e a memória. A enzima Na+,K+-ATPase estabelece os gradientes de Na+ e K+ através da membrana de células excitáveis e desta forma mantém o potencial de membrana e contribui para o controle do volume e do pH celular. No entanto, não está bem definido se a SPD modula a atividade da Na+,K+-ATPase no hipocampo de ratos. Neste estudo foi investigado se SPD altera a atividade da Na+,K+-ATPase em fatias de hipocampo de ratos, e o possível mecanismo envolvido neste processo. As fatias e o homogeneizado de hipocampo foram incubados com SPD (0,05-10 M) por 30 minutos. SPD (0,5 e 1 M) diminuíram a atividade da Na+,K+-ATPase em fatias, mas não no homogeneizado de hipocampo. MK-801 (100 μM), um antagonista não competitivo do receptor NMDA, arcaína (0,5 M), um antagonista do sítio de ligação das poliaminas no receptor NMDA, e L-NAME (100 μM), um inibidor da NOS, preveniram o efeito inibitório da SPD (0,5 M). ODQ (10 μM), um inibidor da enzima guanilato ciclase, e KT5823 (2 μM), um inibidor da proteína quinase dependente de GMPc, também preveniram o efeito inibitório da SPD sobre a atividade da Na+,K+-ATPase. SPD (0,5 e 1,0 μM) aumentaram os níveis de NO2 plus NO3 (NOx) nas fatias de hipocampo. MK-801 (100 μM) e arcaína (0,5 μM) preveniram o efeito da SPD (0,5 μM) sobre conteúdo de NOx. Estes resultados sugerem que a diminuição da atividade da Na+,K+-ATPase induzida pela SPD envolve a via de sinalização NMDA/NOS/GMPc/PKG.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Neuroinflammation is a neuropathological finding in a number of neurodegenerative diseases. Intraperitoneal injection of lipopolysaccharide (LPS) induces neuroinflammation and memory deficit. Spermine and spermidine are endogenous polyamines that physiologically modulate the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor in mammals by binding to the polyamine-binding site at the NMDA receptor. Since polyamines improve memory in cognitive tasks, we tested whether the post-training administration of spermine reverses the deficits of memory induced by LPS in the object recognition task in mice. While spermine (1 mg/kg, i.p.) increased, ifenprodil (10 mg/kg, i.p.), a noncompetitive GluN2B-containing NMDA receptor antagonist, decreased the discrimination score on novel object recognition task. Spermine, at dose that did not alter memory (0.3 mg/kg, i.p.), reversed the cognitive impairment induced by LPS (250 μg/kg, i.p.). Ifenprodil (0.3 mg/kg, i.p.) reversed the protective effect of spermine against LPS-induced memory deficits in the novel object recognition task. However, spermine failed to reverse the LPS-induced increased of cortical and hippocampal cytokines levels. The results indicate that spermine protects from LPS-induced memory deficits in mice by mechanisms other than decreasing LPS-induced cytokine production. / A inflamação periférica desencadeia a produção central de citocinas inflamatórias, gerando um quadro de neuroinflamação. Essa condição altera as transmissões no receptor N-Metil-D-Aspartato (NMDA) o que prejudica a memória e a plasticidade sináptica. A injeção de Lipopolissacarídeo (LPS) induz a neuroinflamação e prejudica a memória. A espermina e a espermidina são poliaminas endógenas que modulam fisiologicamente o receptor NMDA em mamíferos. Uma vez que as poliaminas melhoram a memória em tarefas cognitivas, investigamos se a administração pós-treino de espermina reverte o prejuízo de memória induzido por LPS sistêmico na tarefa de reconhecimento de objetos em camundongos. Enquanto a espermina (1 mg/kg, ip) aumentou, o ifenprodil (10 mg/kg, ip), antagonista não competitivo do receptor NMDA contendo GluN2B, diminuiu a discriminação na tarefa de reconhecimento de objetos. A espermina, em doses que não alteram a memória (0,3 mg/kg, ip), reverteu o dano cognitivo induzido por LPS (250 μg/kg, ip). O ifenprodil (0,3 mg/kg, ip) impediu o efeito protetor da espermina contra o prejuízo de memória induzido por LPS na tarefa de reconhecimento de objetos. No entanto, a espermina não reverteu o aumento dos níveis de citocinas pró-inflamatórias induzido por LPS no hipocampo e córtex cerebral. Os resultados do presente estudo indicam que a espermina protege a piora da memória induzida por LPS em camundongos. O mecanismo desta proteção envolve o sítio de ligação das poliaminas no receptor NMDA, e não envolve mecanismos anti-inflamatórios.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The morphine addiction is a chronic disease that involves biological, cognitive and behavioral changes developed after repeated and compulsive drug use. Even after long periods of abstinence relapses occur to users, especially when faced with situations that resemble the use thereof. The protocol of conditioned place preference (CPP) has been one of the most widely used experimental models to measure the positive reinforcing effects (conditioned place preference) and negative (conditioned place aversion) of several drugs, including morphine. Studies show that antagonists of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) block morphine-induced CPP, suggesting that this receptor is involved in the effects of morphine. Since polyamines act at the NMDA receptor, spermidine (SPD) positive allosteric modulating shape and arcaine acting as an antagonist of the polyamine site on this receiver, the purpose of this study the effect of polyamines on the preference induced conditioned place was to evaluate morphine. Adult male Swiss mice were pre-conditioned once a day for 15 minutes for two consecutive device in the CPP, the next day days were subjected twice daily for conditioning sessions with different drugs and protocols for four consecutive days. Twenty-four hours after the last conditioning session the animals were subjected to the test. The CPP score was calculated for the time spent in the compartment paired with the drug on test day, minus the time spent in the same compartment on the second day of the preconditioning. The results of this study showed that morphine (2.5-10 mg/kg, ip) induced CPP, but not aversion induced conditioned place aversion, the SPD (3-30 mg/kg, ip) and arcaine (0.3-3 mg/kg, ip) did not preferably nor induced conditioned place aversion. However, arcaine (3 mg/kg) administered 15 min before morphine (5 mg/kg) attenuated the pre-training acquisition of morphine-induced PCL. The arcaine (3 mg/kg) administered immediately after conditioning with morphine (5 mg/kg) blocked morphine induced PCL. Also, arcaine (3 mg/kg) administered 30 min pretest blocked morphine induced expression CPP. Furthermore, the effect of arcaine on attenuate the effect of morphine was prevented by the administration of SPD before conditioning, but was not reversed by postconditioning pre-test administration and SPD. These data indicate that arcaine blocks the rewarding effect of morphine and arcaine suggests that it could be a therapeutic target in the development of drugs to treat addiction to morphine. / A adicção a morfina consiste em uma doença crônica que envolve alterações biológicas, cognitivas e comportamentais desenvolvida após o uso repetido e compulsivo da droga. Mesmo após longos períodos de abstinência ocorrem recaídas aos usuários, principalmente quando se deparam com situações que lembram o uso da mesma. O protocolo de preferência condicionada por lugar (PCL) tem sido um dos modelos experimentais mais utilizados para mensurar os efeitos reforçadores positivos (preferência condicionada por lugar) e os negativos (aversão condicionada por lugar) de diversas drogas, incluindo a morfina. Estudos mostram que antagonistas do receptor N-Metil-D-Aspartato (NMDA) bloqueiam a PCL induzida por morfina, sugerindo que este receptor está envolvido nos efeitos da morfina. Uma vez que as poliaminas atuam no receptor NMDA, a espermidina (SPD) modulando de forma alostérica positiva e a arcaína agindo como antagonista do sítio das poliaminas neste receptor, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito das poliaminas sobre a preferência condicionada por lugar induzida por morfina. Camundongos Swiss machos foram pré-condicionados uma vez por dia, durante 15 minutos por dois dias consecutivos no aparelho de PCL, no dia seguinte, foram submetidos, duas vezes por dia às sessões de condicionamento, com diferentes drogas e protocolos durante quatro dias consecutivos. Vinte e quatro horas após a última sessão de condicionamento os animais foram submetidos ao teste. O escore de PCL foi calculado pelo tempo gasto no compartimento pareado com a droga no dia do teste, menos o tempo gasto no mesmo compartimento no segundo dia do pré-condicionamento. Os resultados deste estudo mostraram que a morfina (2,5-10 mg/kg, i.p.) induziu PCL, mas não aversão condicionada por lugar, a SPD (3-30 mg/kg, i.p.) e arcaína (0,3-3 mg/kg, i.p.) não induziram preferência e nem aversão condicionada por lugar. No entanto, a arcaína (3 mg/kg) administrada 15 minutos antes da morfina (5 mg/kg) no pré-treino atenuou a aquisição da PCL induzida por morfina. A arcaína (3 mg/kg) administrada imediatamente após o condicionamento com morfina (5 mg/kg) bloqueou PCL induzida por morfina. Ainda, arcaína (3 mg/kg) administrada 30 min pré-teste bloqueou a expressão PCL induzida por morfina. Além disso, o efeito da arcaína em atenuar o efeito da morfina foi prevenido pela administração de SPD antes do condicionamento, mas não foi revertido pela administração pós-condicionamento e pré-teste de SPD. Estes dados indicam que arcaína bloqueia o efeito de recompensa da morfina e sugere que a arcaína poderia ser um alvo terapêutico no desenvolvimento de drogas para tratar a adicção por morfina.

Spermine (SPM) is an aliphatic amine which contains four nucleophilic centers and is found in all eukaryotic cells, including nervous cells. It belongs to the group of polyamines, which are molecules associated with both neuroprotection and neurotoxicity. The aim of this study was to investigate the effects of spermine on some parameters of toxicity induced by striatal administration of quinolinic acid (QA), an experimental model of Huntington s disease in adult and male Wistar rats. The intrastriatal administration of QA (180 nmol/site) induced contralateral rotations and increase the number of contralateral body swings. The previous striatal administration of SPM caused mixed effects: at the dose of 0.1 nmol/site increased the number of contralateral rotations; but at 10 nmol/site it reduced both the number of rotations and the contralateral body swings induced by QA. The mechanism by which SPM decreases these motor alterations is probably through its interaction with the NMDA receptor, since the co-administration with arcaine (antagonist of polyamine binding sites on this receptor) reversed its protective effect. The increase of protein carbonyl content induced by QA (180 nmol/site) in striatum of rats was prevented by the administration of 10 nmol/site of SPM. Besides, the bilateral striatal injection of QA (180 nmol/site) impaired the performance in the recognition memory task. The post-training striatal administration of SPM (0.1 and 1 nmol/site) reversed the QA-induced cognitive deficit. It was also evaluated whether spermine prevented QA-induced neuromorphological alterations. QA caused striatal neuronal degeneration and reactive astrogliosis. SPM, at the dose that improved the cognitive performance (0.1 nmol/site), had no effect on striatal neuronal degeneration but reversed the intense astrocytic reaction induced by QA. These results suggest that SPM has neuroprotective properties, presenting a dose dependent pattern of polyamine, in this experimental model of Huntington disease. / A espermina (SPM) é uma amina alifática, contendo quatro centros nucleofílicos e é encontrada em todas as células eucarióticas, incluindo células nervosas. Ela pertence ao grupo das poliaminas, moléculas responsáveis tanto por efeitos neuroprotetores quanto neurotóxicos. O objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos da SPM sobre alguns parâmetros de toxicidade induzidos pela administração estriatal de ácido quinolínico (AQ), um modelo experimental da doença de Huntington em ratos Wistar machos adultos. A administração intraestriatal unilateral de AQ (180 nmol/sítio) induziu o aparecimento de rotações contralaterais e aumento do percentual de balanços corporais contralaterais. A prévia administração estriatal de SPM mostrou efeitos diversos: na dose de 0,1 nmol/sítio aumentou o número de rotações; porém na dose de 10 nmol/sítio ela diminuiu tanto o número de rotações quanto o percentual de balanços corporais contralaterais induzidos pelo AQ. O mecanismo pelo qual a SPM diminui estas alterações motoras é, provavelmente, devido à sua interação com o receptor NMDA, uma vez que sua co-administração com a arcaína (antagonista do sítio das poliaminas neste receptor) reverteu o efeito protetor da mesma. A administração de 10 nmol/sítio de SPM preveniu o aumento do conteúdo de proteína carbonil induzida pela injeção de AQ (180 nmol/sítio) no estriado de ratos. Além disso, foi observado prejuízo cognitivo na tarefa de reconhecimento de objetos após a injeção estriatal bilateral de AQ (180 nmol/sítio). A administração estriatal póstreino de SPM (0,1 e 1 nmol/sítio) reverteu este déficit cognitivo induzido pelo AQ. Para avaliação das alterações neuromorfológicas neste modelo foram observadas degeneração neuronal e reação astrocitária. O AQ aumentou significativamente a degeneração de neurônios estriatais e a astrogliose reativa. A SPM, na menor dose que melhorou o desempenho cognitivo (0,1 nmol/sítio), não teve efeito sobre a degeneração neuronal estriatal; no entanto, ela foi capaz de reverter a intensa reação astrocitária induzida pela injeção de AQ. Estes resultados sugerem que a SPM tem propriedades neuroprotetoras, que apresentam um padrão dependente da dose da poliamina, neste modelo experimental da doença de Huntington.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Lesões sistêmicas peri e pré-natais alteram o desenvolvimento do SNC, levando a problemas cognitivos e motores em crianças que podem perdurar por toda a vida. Um tipo particular de lesão é a hipóxia-isquemia (HI), caracterizada pela interrupção momentânea ou permanente do fluxo sanguíneo. Um dos mecanismos propostos para as lesões decorrentes da HI é a excitotoxicidade glutamatérgica. O uso de inibidores da neurotransmissão glutamatérgica tem sido estudados em diversos modelos de HI. Neste trabalho, avaliamos os efeitos morfofuncionais da administração de um antagonista não-competitivo do receptor de glutamato NMDA sobre o desenvolvimento do cerebelo. Ratas no 18 dia de gestação foram anestesiadas, os cornos uterinos expostos e as 4 artérias uterinas obstruídas por 45 minutos (Grupo H). Animais controle tiveram os úteros expostos, sem a obstrução (Grupo S). Após a cirurgia a gestação prosseguiu. Somente animais nascidos a termo foram utilizados. Um dia após o nascimento, metade de cada ninhada foi designada para receber MK801, 0,3mg/kg/dia, (grupos SM e HM) e a outra metade recebeu solução salina (grupos SS e HS), por 5 dias. Após anestesia e perfusão-fixação com paraformaldeído 4% aos 9, 23, 30 e 60 dias pós-natais, cortes parassagitais do cerebelo foram obtidos em criótomo e submetidos à imunohistoquímica para calbindina, GFAP, GLAST, PDGFRα e MBP. A partir de 45 dias de vida, os animais foram testados em vários de testes comportamentais: labirinto em cruz elevado (LCE), campo vazado (CV), ROTAROD, teste de caminhada sobre barras (ladder test) e teste do comprimento da passada (stride length). Aos 9 dias, a espessura da árvore dendrítica era menor nos animais SM, HS/HM, demonstrando efeitos deletérios tanto do MK801 quanto da HI. Menor número de células PDGFRα+ foi observado nos animais HS/HM, sem efeitos da administração de MK801. Aos 23 dias, maior número de células PDGFRα+ foi observado nos animais HM comparado aos outros 3 grupos, indicando efeito neuroprotetor do MK801. Nessa idade, menor número de fibras mielinizadas (MBP+) foi observada nos animais HS, e a administração de MK801 parece reverter estes efeitos. Aos 9 dias a distribuição de GLAST estava alterada nos animais HS, com os efeitos da HI parcialmente revertidos pelo MK801. Não foram observados efeitos da HI ou do MK801 sobre comportamentos relacionados a ansiedade pelo LCE, assim como na latência de queda no ROTAROD. HI piora a performance motora no ladder test. No teste do CV, não observamos efeitos da HI sobre a busca por novidade assim como sobre a atividade locomotora espontânea. No entanto, MK801 diminui comportamentos de autolimpeza e a atividade locomotora espontânea. Menor variação das passadas foi observada em decorrência da administração de MK801 no stride length, com nenhum efeito da HI. Nossos resultados demonstram que a inibição do receptor NMDA tem um efeito neuroprotetor sobre os progenitores de oligodendrócitos e mielinização, provavelmente pela manutenção da capacidade proliferativa por um período maior. A atividade do receptor NMDA exerce importante papel na diferenciação das células de Purkinje, assim como na distribuição do transportador GLAST, corroborando a importância deste receptor na gênese das lesões causadas pela HI. / Peri and prenatal systemic lesions alter CNS development leading to motor and cognitive problems in children that might persist throughout life. A particular kind of injury, the hypoxic ischemic (HI), is characterized by a permanent or temporary blockage of blood flow. One of the proposed mechanisms downstream from a HI event is called glutamatergic excitotoxicity. The administration of glutamate inhibitors has been studied in HI models for several years. In this work, we evaluated the effects of administration of a non-competitive antagonist of glutamate receptor, NMDA, on cerebellar development and behavioral tests of HI animals. Pregnant rats in the 18th gestational day were anesthetized, the uterine horns were exposed and the four uterine arteries were clamped for 45 minutes (group H). Sham controls had the uterine horns exposed, but no arteries were clamped (group S). Gestation proceeded after surgery. Only full term animals were used. One day after birth half the animals was assigned to receive either SALINE (groups SS and HS) or MK801 (groups SM and HM). Animals were anesthetized and perfused with 4% paraformaldehyde at 9, 23, 30 and 60 days of age. Parasagittal cerebellar sections were submitted to Calbindin, GFAP, GLAST, PDGFRα and MBP immunohistochemistry. Beginning at P45 animals were subjected to a battery of behavioral tests: elevated plus maze (EPM), hole board (HB), ROTAROD, ladder test and stride length. At P9 the dendritic tree of Purkinje cells were thinner in SM, HS/HM animals, indicating that both HI and MK801 are deleterious regarding this Purkinje cell differentiation. A lower number of PDGFRα+ cells was observed in HS/HM animals, with no effects of MK801 administration. At P23 a greater number of PDGFRα+ cells was found in HM animals when compared to the other 3 groups, demonstrating a neuroprotector effect of MK801. A lower number of myelinated fibers (MBP+) was observed in HS animals at P9, and MK801 administration reverse this effect. At P9, GLAST distribution was altered in HS animals, and MK801 partially reverse this altered distribution. No effects of HI and MK801 were observed in the EPM and ROTAROD tests. HI decreased motor performance of hind limbs in the ladder test, though no effect of MK801 was noted. In the HB test, we do not observe HI effects regarding the novelty seeking behavior and locomotor activity, otherwise the administration of MK801 decreased the number of grooming and locomotor activity. In the stride length test, we do not observed effects of HI although MK801 augmented the length variation of the fore limbs. Our results show that inhibition of NMDA receptors exerts a neuroprotector effect on oligodendrocyte progenitor cells and myelination, probably by temporarily inhibiting differentiation of those, providing more time to proliferate. NMDA activity exerts a crucial role in Purkinje cell differentiation as well as in GLAST distribution. Taken together our results lead us to conclude that NMDA receptor activity has an important role in the genesis of lesions caused by HI events.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The memory may be studied according with memory's phases, which is acquisition, consolidation and recall. Memories once consolidated, are no more susceptible to interventions, but when reactivated, some of these memories again become labile and vulnerable, and to persist need to have a new stabilization process called reconsolidation. Previous studies described that endogenous polyamines, spermine and spermidine, which bind and modulate the activity of NMDA receptors are involved in memory acquisition and consolidation. However there are no studies showing the effect of these drugs on memory reconsolidation. Accordingly, the aim of this study was investigate the effect of polyamines on fear memory reconsolidation in rats. Male Wistar rats were trained in a fear conditioning apparatus using a 0.4 mA footshock as unconditioned stimulus. Twenty four hours after training, animals were re-exposed to the apparatus in the absence of shock (reactivation session). Immediately after the reactivation session, SPD (1 30 mg/kg, i.p.), the antagonist of the polyamine binding site at the NMDA receptor, arcaine (0.1 10 mg/kg, i.p.) or spermidine plus arcaine were injected, and the animals were tested in the same apparatus 24 h later. Freezing scores at testing were considered a measure of memory. While SPD (3 and 10 mg/kg) improved, arcaine (1 and 10 mg/kg) impaired memory reconsolidation. These drugs had no effect on memory if they were administered in the absence of reactivation, or 6 h after reactivation session. Arcaine (0.1 mg/kg, i.p.) prevented SPD (3 mg/kg)-induced improvement of memory reconsolidation. Accordingly, SPD (1 mg/kg) prevented arcaine (10 mg/kg)-induced impairment of memory reconsolidation. The amnesic effect of arcaine was not reversed by arcaine administration prior to test, ruling out state dependence in this effect. These results suggest that systemic administration of polyamine binding site ligands modulate memory reconsolidation, however further studies are required to elucidate the mechanism by which polyamines modulate memory reconsolidation. / A memória pode ser estudada de acordo com as suas fases, que são a aquisição, a consolidação e a evocação. As memórias, uma vez consolidadas, não podem mais ser modificadas, porém quando reativadas, ou seja, quando recuperadas, muitas destas voltam a se tornar instáveis e vulneráveis e para que persistam precisam passar por um novo processo de estabilização, chamado reconsolidação. Têm sido descrito que as poliaminas endógenas, espermidina e espermina, que se ligam e modulam a atividade do receptor NMDA, estão envolvidas na aquisição e na consolidação da memória. Contudo, não há trabalhos mostrando o efeito destas substâncias na reconsolidação da memória. Desta forma, o objetivo deste estudo foi verificar o efeito das poliaminas na reconsolidação da memória de medo em ratos. Para isso, ratos machos adultos foram treinados na tarefa de medo condicionado contextual, onde receberam três choque de 0,4 mA, com intervalo de 40 seg entre cada choque e, 24 horas após, os animais foram recolocados no aparelho do treino por um período de 3 min, na ausência de choque, para reativar a memória. Após a reativação foi administrado, pela via intraperitoneal, salina, espermidina (1-30 mg/kg), arcaína (0,1-10 mg/kg) ou espermidina mais arcaína e vinte e quatro horas após, os animais foram testados, onde foi avaliado a imobilidade destes durante 6 min. Foram realizados experimentos controles para avaliar a especificidade das drogas no processo de reconsolidação. Além disso, foi avaliado se o possível efeito da arcaína na reconsolidação poderia ser explicado por dependência de estado. Assim, enquanto a espermidina (3 e 10 mg/kg) melhorou, a arcaína (1 e 10 mg/kg) piorou a reconsolidação da memória. Estas drogas não tiveram efeito sobre a memória quando foram administradas na ausência da reativação ou 6 horas após. A arcaína (0,1 mg/kg) preveniu a melhora da reconsolidação da memória induzida pela espermidina (3 mg/kg) e por sua vez, a espermidina (1 mg/kg) preveniu o prejuízo da reconsolidação da memória induzido pela arcaína (10 mg/kg). O efeito amnésico da arcaína não foi revertido pela administração da mesma dose de arcaína antes do teste, descartando a hipótese de dependência de estado para o efeito da arcaína na reconsolidação. Estes resultados sugerem que a administração sistêmica dos ligantes do sítio de ligação das poliaminas do receptor NMDA modulam a reconsolidação da memória, todavia são necessários mais estudos a fim de elucidar o mecanismo pelo qual as poliaminas modulam a reconsolidação da memória.

Succinate is a dicarboxylic acid that accumulates due to succinate dehydrogenase inhibition. This dicarboxylic acid has a biphasic effect on neural activity in vitro that seems to be mediated by N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors. The NMDA receptor is distributed throughout the central nervous system and mediates synaptic plasticity-related events, such as learning and memory. Although it has been described that succinate modulates NMDA conductance, it is not known if this organic acid modulates learning and me mory. Therefore, in the present study we investigated whether the immediate post-training systemic or intrahippocampal administration of succinate affects the memory of fear conditioning in rats. In addition, we investigated whether the NMDA and β-adrenergic receptors are involved in the facilitatory effect of succinate on memory. Systemic (0,00005, 0,0005, 0,005, 0,05 and 0,5 mg/kg i.p) or bilateral intra-hippocampal (0.21 pmol i.h.) immediate post-training administration of succinate biphasically facilitated contextual fear conditioning and had no effect on conditioning to tone. Systemic or intra-hippocampal administrations of MK-801 (0,001 mg/kg i.p. or 0,21 pmol i.h. respectively), a noncompetitive NMDA receptor antagonist, at a dose that had no effect per se, reversed the facilitatory effect of succinate on contextual fear conditioning. The systemic administration of propranolol (10 mg/kg i.p.), a β-adrenergic antagonist, at a dose that had no effect per se, also reversed the facilitatory effect of succinate on contextual fear conditioning. The administration of succinate (0,005 mg/kg i.p.) immediately after training and 15 minutes before the test did not affect the performance of the animals on fear conditioning. These results suggest that the facilitatory effect of succinate on the memory of fear conditioning involves NMDA and β-adrenergic receptors. The results also indicate that the facilitatory effect of succinate on memory is not related to state-dependence / O sucinato é um intermediário do ciclo de Kreks e também da cadeia respiratória, mas que também parece ter funções não relacionadas ao metabolismo energético. De fato, este ácido dicarboxílico tem efeito bifásico sobre a atividade neural in vitro, que parece ser mediado pelo receptor glutamatérgico N-metil-D-aspartato (NMDA). O receptor NMDA está presente em todo o sistema nervo central (SNC) e os processos mediados por este receptor incluem plasticidade sináptica e formação de circuitos neurais. Embora tenha sido descrito que o sucinato modula a atividade neural in vitro, não se sabe se este ácido orgânico modula processos fisiológicos ligados ao receptor NMDA, como o aprendizado e memória. Consequentemente, neste estudo foi investigado o efeito da administração sistêmica e intrahipocampal de sucinato, MK-801 e propranolol sobre a consolidação da memória em ratos, utilizando a tarefa de medo condicionado clássico. Posteriormente se investigou se os efeitos do sucinato sobre a memória envolvem dependência de estado. O teste do medo condicionado consistiu na apresentação de estímulos pareados, condicionado (tom 2000 Hz 90 dB/10 s) e incondicionado (choque 0.6 mA/1 s). O estado de imobilidade do animal foi utilizado como um indicativo de memória nas sessões de avaliação de memória ao contexto e ao tom. A administração sistêmica de sucinato nas doses de 0,00005, 0,0005, 0,005, 0,05 e 0,5 mg/kg i.p. imediatamente após o treino melhorou a memória. Contudo, a dose de 5 mg/kg de sucinato não alterou a memória dos animais, caracterizando um efeito bifásico sobre a memória. Essa melhora da memória induzida por sucinato (0,005 mg/kg i.p.) foi revertido pela administração pós-treino de um antagonista do receptor NMDA, MK-801 (0,001 mg/kg i.p.) e pela administração imediatamente após o treino de um bloqueador adrenérgico, propranolol (10 mg/kg i.p.). A administração de sucinato (0,005 mg/kg i.p.) imediatamente após o treino e 15 minutos antes do teste não afetou a performance dos animais, não caracterizando dependência de estado. Nos experimentos que visaram identificar se a administração central de sucinato alterava a memória, os animais foram canulados bilateralmente no hipocampo e após a recuperação cirúrgica, recebiam injeções bilaterais imediatamente após o treino, de sucinato (0,21 pmol i.h.) que melhorou a memória. A administração imediatamente após o treino de MK- 801 (0,22 nmol i.h.) foi capaz de reverter esse efeito facilitador do sucinato sobre a memória. Estes resultados sugerem que o efeito facilitador da memória induzida pela administração de sucinato é mediado pelo receptor NMDA e envolve de alguma maneira o sistema adrenérgico