La sclérose latérale amyotrophique est une maladie neurodégénérative associée à un dysfonctionnement métabolique. Des altérations du métabolisme des lipides, décrites chez les patients SLA et les animaux modèles, pourraient participer à la mise en place des premières étapes de la maladie. L’objectif de cette thèse était d’étudier le rôle de la stéaroyl-coenzyme A désaturase 1 (SCD1), une enzyme clé du métabolisme des lipides, dans la SLA. En étudiant le profil d’acides gras périphériques dans un modèle de souris SLA, les souris SOD1m, nous avons vu une diminution de l’activité de la SCD1 dès les stades précoces (subcliniques) de la maladie. Cette diminution pourrait expliquer, à elle seule, les altérations du métabolisme des lipides caractéristiques de la SLA. La répercussion de la perte de l’activité de la SCD1 sur l’axe moteur a été étudiée. Une délétion du gène ou une inhibition pharmacologique de la SCD1 améliore la récupération fonctionnelle après lésion du nerf sciatique chez la souris sauvage. Nous avons cherché à voir si la perte d’activité de la SCD1 trouvée chez les souris SOD1m est un mécanisme de protection mis en place pour lutter contre l’évolution de la SLA. Nous avons traité des souris SOD1m avec un inhibiteur de l’activité de la SCD1. Le traitement a conduit à une augmentation du métabolisme oxydatif, une préservation de l’intégrité neuromusculaire ainsi qu’une amélioration de la survie des motoneurones. Nousconcluons que l’inhibition de la SCD1 représente une cible thérapeutique prometteuse dans la SLA. / Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disease, associated with metabolic dysfunction. Alteration of lipid metabolism has been documented in ALS patients and animal models, and could participate to the first pathological steps of the disease. The objective of this thesis was to study the role of stearoyl-CoA desaturase 1 (SCD1), a key enzyme of lipid metabolism, in ALS. By studying the profile of peripheral fatty acids in an animal model of ALS, the SOD1 mice, we found that SCD1 activity was strongly reduced at early (sub-clinical) disease stage, and that this reduction could explain in itself the alteration of lipid metabolism characteristic of ALS. The impact of loss of SCD1 activity for the motor axis was then studied. Genetic deletion or pharmacological inhibition of SCD1 enhanced functional recovery after sciatic nerve injury in mice. Wefurther explored if the loss of SCD1 activity found in SOD1 mice is a protective mechanism elicited in response to ALS. We treated SOD1 mice with an inhibitor of SCD1 activity. The treatment resulted in exacerbated muscular oxidative metabolism,preservation of neuromuscular integrity and enhanced motor neuron survival. We conclude that inhibition of SCD1 represents a promising therapeutic target for ALS.

Les estuaires à mangroves sont des écosystèmes très dynamiques qui transportent du carbone provenant des eaux continentales et de la production côtière vers la plaine d’inondation, et exportent vers l’océan une partie de celui fixé par la végétation environnante. Les mangroves sont des écosystèmes très productifs et servent ainsi de zones de nurserie et d’alimentation pour de nombreuses espèces côtières qui y pénètrent lors de la marée montante et exportent lors de la marée descendante la matière qu’ils y ont ingérée. Cependant, les quantités et la qualité du carbone qui est échangé dans l’estuaire, ainsi que les transformations qui s’y opèrent, sont encore mal connues. Ce travail de thèse a pour objectif d’étudier le cycle du carbone dans l’estuaire traversant la mangrove de Can Gio, au sud du Vietnam, ainsi que les organismes macroscopiques connectant la mangrove au compartiment océanique par leurs déplacements ; ceci, afin de mieux comprendre le bilan de carbone de la mangrove de Can Gio, et plus largement, celui des mangroves tropicales. Les résultats présentés sont issus de 3 campagnes d’échantillonnage ; la première en saison sèche, uniquement le long de l’estuaire traversant la mangrove ; la deuxième en saison humide, le long de l’estuaire et dans un chenal de vidange ; et la dernière afin de simuler en laboratoire le devenir d’effluents crevetticoles une fois rejetés dans l’estuaire. Des suivis des masses d’eau ont été effectués en différentes zones du réseau hydrographique de la mangrove, à chaque fois au cours d’un cycle tidal complet (24 h), et diverses espèces macroscopiques ont été capturées dans le lit mineur et la zone intertidale. Cette étude s’intéresse à la fois aux formes minérales du carbone, notamment le CO2 qui joue un rôle clé dans la régulation du climat, à ses formes organiques, en particulier les acides gras qui sont utilisés comme traceurs de la matière organique dans les réseaux trophiques et qui possèdent de nombreuses fonctions métaboliques, et enfin à des spécificités du compartiment microbien, qui contribue au remaniement de ce carbone. / Mangrove estuaries are highly dynamic environments importing carbon originating from both the watershed and the coastal ocean to the adjacent floodplain, and exporting to the ocean a fraction of that photosynthesised by the surrounding vegetation. Mangroves are very productive ecosystems. Thus, they serve as a nursery for a wide variety of coastal species entering the ecosystem during flood, and exporting during ebb the carbon they consumed. However, the quantities and the quality of carbon exchanged within the estuary, along with the transformations occurring during the water transit, are still not fully understood. This work aims to examine the carbon cycle in the main estuarine channel of the Can Gio mangrove, located in southern Vietnam, along with macroscopic species connecting the mangrove ecosystem to the coastal ocean through their movements; this, in order to better understand the carbon budget of the Can Gio mangrove, and at a broader scale, of tropical mangroves. Results presented in this manuscript are originating from 3 sampling campaigns; the first performed during the dry season, along the main estuarine channel only; the second achieved during the wet season, along both the main estuarine channel and a mangrove tidal creek; and the last in order to simulate in controlled conditions the fate of shrimp pond effluents once released in the estuary. Water column parameters were surveyed at different sites located on the mangrove waterways, each during a complete tidal cycle (24 h), and various macroscopic species were sampled from both the intertidal zone and the water column. This study examines concomitantly mineral forms of carbon, particularly CO2, which plays a major role in climate mitigation; its organic forms, especially fatty acids, used as biomarkers in trophic webs studies and implied in diverse metabolic functions; and specificities of the microbial compartment, contributing to the cycling of this carbon.

Cette thèse porte sur la production d'acide lactique par conversion de la biomasse lignocellulosique catalysée par des acides de Lewis solides dans l'eau puis l'estérification d'acide lactique aqueux avec de l'éthanol. La conversion de la cellulose est étudiée en autoclave, en utilisant comme catalyseurs, de la zircone et de l'alumine contenant du W ou Sn (ZrW, AlSn) et différents hydroxydes métalliques. L'étude de la conversion de la cellulose en acide lactique en présence de ZrW non calcinée, ZrW calcinée, Zr(OH)4 et ZrO2, montre que la phase active du catalyseur est constituée de Zr4+, les centres acides de Lewis et de groupes hydroxyles. Les performances catalytiques des catalyseurs AlSn, préparés à partir de chlorure d'étain comme précurseur, dépendent fortement de la présence résiduelle de chlorure, ce qui favorise la formation d'acide lévulinique. Les hydroxydes de certains métaux de transition se sont révélés être des catalyseurs solides efficaces pour la conversion de la cellulose en acide lactique. Il a été observé que le rendement en acide lactique dépend de la concentration et de la basicité des groupes OH superficiels des hydroxydes de métaux de transition et de la présence de sites acides de Lewis. L'estérification de l'acide lactique, à différentes concentrations en l'eau, a été étudiée en présence d'Amberlyst 15, de charbon sulfoné et d'oxyde de graphène pour étudier l'activité et la tolérance à l'eau de catalyseurs solides acides à base de carbone. Il est montré, par calorimétrie d'adsorption d'ammoniac, que l'oxyde de graphène présente des sites superacides et qu'il conduit à la plus grande activité et tolérance à l'eau. L'augmentation de la teneur en eau montre un fort effet inhibiteur sur l'activité du charbon sulfoné alors que d'Amberlyst 15 et l'oxyde de graphène sont plus tolérants. Les catalyseurs ne sont pas stables dans des conditions d'estérification, en présence d'eau / This thesis reports the synthesis of lactic acid from lignocellulosic biomass catalyzed by solid Lewis acid catalysts in water and then esterification of aqueous lactic acid solutions with ethanol. The cellulose conversion was tested in autoclave, in hot water, using zirconia and alumina containing W or Sn (ZrW, AlSn) and different solid metal hydroxides. The conversion of cellulose to lactic acid using uncalcined ZrW, calcined ZrW, Zr(OH)4 and ZrO2 shows that the active surface of the catalyst consists of Zr4+ Lewis centers and OH groups. The catalytic performances of AlSn catalysts, prepared from Sn chloride as precursors, strongly depend on the residual amount of chloride which favors the formation of levulinic acid. Some hydroxides of transition metals were disclosed as efficient solid catalysts for the conversion of cellulose to lactic acid. The yield of lactic acid was observed to depend on the concentration and the basicity of the superficial OH groups and on the presence of Lewis acid sites. The esterification of lactic acid, at different concentrations in water, was studied using Amberlyst 15, sulfonated carbon and graphene oxide to evaluate the activities and water tolerance of carbon based solid catalysts. Graphene oxide, shown by calorimetry of NH3 adsorption to exhibit super-acid sites, leads the highest activity and water tolerance. Increasing amounts of water has a strong inhibiting effect on the activity of sulfonated carbon and less influence on activity of Amberlyst 15 and graphene oxide. However, all catalysts were not stable in esterification conditions, in presence of water

Les tumeurs sont, au moins en partie, des maladies de la régulation du cycle cellulaire. Le point de restriction (R) est un point fondamental du cycle cellulaire où les cascades de signalisation mitogéniques (y compris leurs perversions oncogènes) et l'état métabolique des cellules sont intégrés pour engager le cycle de division cellulaire. Les CDK4 et CDK6 sont les premières CDKs à être activées en réponse aux signaux de prolifération cellulaire.En initiant la phosphorylation inactivatrice de l'oncosuppresseur central pRb, les CDK4 / 6 liées aux cyclines D jouent un rôle essentiel dans le passage du point R et donc dans la décision de multiplication cellulaire, en particulier dans la plupart des cellules cancéreuses dans lesquelles l'activité de CDK4 est fortement dérégulée. Les médicaments inhibiteurs de CDK4 / 6 sont maintenant évalués dans la plupart des cancers dans de nombreux essais cliniques. Le plus avancé (Palbociclib-PD0332991) a été approuvé en 2015 par la FDA pour le traitement des cancers métastatiques du sein. Notre groupe a identifié la phosphorylation activatrice sur la Thr172 comme l'étape hautement régulée qui détermine l'activation de CDK4. La question de savoir si les phosphorylations de CDK4 et de CDK6 sont catalysées par la seule « CDK-activating kinase » (CAK, cycline H-CDK4-Mat1) reste incertaine. En utilisant des cellules de cancer colorectal (HCT116) exprimant une version de CDK7 spécifiquement inhibable (dite « analog sensitive »), nous avons participé à une étude qui démontre, d’une part, une implication cruciale de la CDK7 dans la phosphorylation / activation de CDK4 et CDK6 et, d’autre part, l'existence de kinase(s) activatrice(s) de la CDK4 différente(s) de la CDK7. De plus, cette étude a démontré que l'activité de la CDK7 était conditionnée, au moins en partie, par la liaison de p21 à la CDK4, laquelle augmentait en réponse à l'inhibition de CDK7. L’augmentation de cette liaison coïncidait avec la disparition de la phosphorylation la plus abondante de p21, que nous avons localisée (par des analyses d'électrophorèse bidimensionnelle) sur la Ser130 et que nous avons montré être catalysée par la CDK4 et la CDK2. De manière surprenante, la phosphorylation sur Ser130 de p21 était inhibée non seulement par l'inhibition de CDK7, mais également par la Roscovitine et le CR8 (inhibiteurs de CDK2) et le Palbociclib. Ensemble, ces observations suggèraient que l'inactivation de pRb et le passage de R sont contrôlés par des mécanismes de rétroaction positive dépendants de la CDK7 médiés par la phosphorylation de la p21 par la CDK4 et la CDK2 pour faciliter et maintenir l'activation de la CDK4. De plus, nos résultats confirmaient l’hypothèse de l'existence kinase(s) activatrice(s) de la CDK4 autre(s) que la CDK7. Notre groupe avait démontré précédemment que la régulation de la phosphorylation de la CDK4 ne s'applique pas à son homologue CDK6, ce qui s'expliquait par l'absence d'une proline critique dans le domaine phosphoaccepteur (QMALTPVVVT dans CDK4 vs QMALTSVVVT dans CDK6). Ces données iniquaient que la ou les kinase (s) responsable(s) de la phosphorylation sur Thr172 de CDK4 devrai(en)t être dirigée(s) par la proline 173 uniquement présente dans la CDK4 (« proline-directed kinase(s) »).L'objectif principal de cette thèse est l'identification de kinase(s) impliquée(s) dans cette phosphorylation. Nous avons donc sélectionné une liste restreinte de « proline-directed kinases » (PDK) requises pour la prolifération cellulaire. Parmi celles-ci, les JNK, qui sont des PDKs, sont des interacteurs de p21 et CDK4 et peuvent avoir un rôle oncogène. De manière importante, nous avons observé que les JNKs, mais pas la CAK / CDK7, phosphorylaient in vitro la p21 et la CDK4 liée aux cyclines D. Les JNKs phosphorylaient également p21 sur ses trois sites P-T/S (Thr57, Ser130, Ser98). En mutant ces sites (T57A, S130A, S98A, T57A / S130A), nous avons montré que la phosphorylation de p21 par les JNKs n'est pas nécessaire pour la phosphorylation et l'activation de la CDK4 liée à p21. Par conséquent, in vitro les JNKs peuvent activer les complexes CDK4 liés à la p21, en agissant d’une part comme des kinases phosphorylant directement la CDK4 dans les complexes de cycline D-CDK4 stabilisés par la liaison de p21 et d’autre part en phosphorylant indépendamment des résidus de p21 impliqués dans l'activation de CDK4 dépendante de la CAK. Pour démontrer la relevance in vivo du rôle des JNKs comme kinases activatrices de la CDK4, nous avons analysé l'effet de leur inhibition dans les lignées de cellules tumorales T98G et MCF-7, les cellules MEF et des cellules CHO transfectées: dans tous ces cas, l'inhibition des JNKs, y compris l'inhibition spécifique de l'activité de JNK2 par une approche de génétique chimique en collaboration avec le groupe de Roger Davis, a réduit l'entrée du cycle cellulaire, et la phosphorylation et l'activation des complexes de cycline D1-CDK4. De manière intéressante, l’activation des complexes de cycline D3-CDK4 n’était pas affectée par l’inhibition des JNKs, apparemment parce que ces complexes étaient principalement associés à la p27 plutôt qu’à la p21. Mis ensemble, ces différents résultats nous amènent à proposer un nouveau modèle dans lequel différentes kinases activatrices de la CDK4, y compris les JNKs (indépendamment des phosphorylations de p21) et la CAK/CDK7 (de manière dépendante des phosphorylations de p21), coopèrent pour initier et maintenir l'activation de la CDK4 et générer la décision du cycle cellulaire. Cette nouvelle compréhension pourrait révéler de nouveaux mécanismes ciblables dans une perspective thérapeutique anti-cancéreuse. / Tumors are, at least in part, diseases of cell cycle regulation. The restriction (R) point is a fundamental point of the cell cycle in which mitogenic signaling cascades (including their oncogenic perversions) and cell metabolic status are integrated to commit the cell division cycle. CDK4 and CDK6 are the first CDKs to be activated in response to cell proliferation signals. By initiating the inactivating phosphorylation of the central oncosuppressor pRb, cyclin D-bound CDK4/6 play an essential role at the passage through R and thus in the cell multiplication decision, especially in most cancer cells in which CDK4 activity is highly deregulated. CDK4/6 inhibitory drugs are now evaluated in many clinical trials against most cancers, and the most advanced (Palbociclib-PD0332991) was approved in 2015 by FDA for treatment of metastatic breast cancers. Our group has identified the activating Thr172 phosphorylation as the highly regulated step that determines CDK4 activation. Whether CDK4 and CDK6 phosphorylations are catalyzed by the sole CAK (cyclin H-CDK7-Mat1) remains unclear. In analogue-sensitive CDK7 (as/as) mutant HCT116 cells in which CDK7 can be specifically inhibited, we participated to a study demonstrating a crucial CDK7 involvement in phosphorylation/activation of CDK4 and CDK6 and existence of non-CDK7 CDK4 activating kinase(s). Moreover, this study demonstrated that CDK7 activity was conditioned, at least in part, by p21 binding to CDK4, which increased in response to CDK7 inhibition. This coincided with disappearance of the most abundant phosphorylation of p21, which was localized (by 2D-gel electrophoresis analyses) at Ser130 and found to be catalyzed by both CDK4 and CDK2. Surprisingly, Ser130 p21 phosphorylation was not inhibited only by CDK7 inhibition, but also by Roscovitine and CR8 (CDK2 inhibitors) and Palbociclib. All together, these observations suggested that pRb inactivation and R passage are controlled by CDK7-dependent positive feedbacks mediated by p21 phosphorylation by CDK4 and CDK2 to sustain CDK4 activation. Importantly, these results confirm the hypothesis of a non-CDK7 CDK4 activating kinase(s). Our group has previously demonstrated that the regulation of CDK4 phosphorylation does not apply to its homologue CDK6, which was explained by the lack of a critical proline in the phospho-acceptor domain (QMALTPVVVT in CDK4 vs QMALTSVVVT in CDK6). These data have indicated that the activity of kinase(s) responsible for Thr172 phosphorylation of CDK4 should be directed by the unique proline 173 of CDK4 (proline-directed kinase(s)). The primary objective of this thesis is the identification of kinase(s) involved in this phosphorylation. We thus selected a shortlist of proline-directed kinases (PDKs) required for cell proliferation. Among them JNKs, which are PDKs, are interactors of p21 and CDK4 and can have an oncogenic role. Importantly, we observed that JNKs, but not CAK/CDK7, did phosphorylate CDK4 in vitro in their complexes with cyclins D stabilized by p21 binding. JNKs also phosphorylated p21 in the three P-T/S phosphorylation sites (Thr57, Ser130, Ser98). Mutating p21 phosphorylation sites (T57A,S130A,S98A,T57A/S130A) we also demonstrated that in vitro, the phosphorylation of p21 by JNKs is not required for the phosphorylation and activation of p21-bound CDK4. Therefore, in vitro JNKs might activate p21-bound CDK4 complexes by acting as a direct CDK4-activating kinases for cyclin D-CDK4 complexes stabilized by p21 binding and also by independently phosphorylating p21 residues involved in CAK-dependent activation of CDK4. To demonstrate the relevance of the role of JNKs as possible CDK4-activating kinases in vivo we analyzed the effect of their inhibition in T98G and MCF-7 tumor cell lines, MEFs and transfected CHO cells: in all these cases, inhibition of JNKs, including specific inhibition of JNK2 activity by a chemical genetic approach in collaboration with Roger Davis group, reduced the cell cycle entry and phosphorylation and activation of cyclin D1-CDK4 complexes. Interestingly, the activation of cyclin D3-CDK4 complexes was not affected by the JNK inhibition, apparently because these complexes were mainly associated with p27 instead of p21. Putting together all these results, we propose a new model in which different CDK4-activating kinases, including JNKs (independently of p21 phosphorylation) and CAK/CDK7 (dependently on p21 phosphorylation), cooperate to initiate and maintain the activation of CDK4 and generate the cell cycle decision. This new understanding may reveal new druggable mechanisms and anti-cancer therapeutic targets. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Suite à des observations cliniques minutieuses réalisées, en particulier, dans le service de Néphrologie de l’hôpital Érasme à Bruxelles, la néphrotoxicité et l’oncogénicité des acides aristolochiques contenus dans les plantes médicinales utilisées en médecine traditionnelle chinoise ont été démontrées. La néphrotoxicité se traduisait par une néphrite interstitielle fibrosante chronique conduisant à l’insuffisance rénale terminale. Ces constatations ont amené à développer, au laboratoire de Néphrologie Expérimentale de la Faculté de la Médecine de l’ULB, un modèle expérimental de la fibrose rénale interstitielle chez le rat, par l’injection sous-cutanée des acides aristolochiques. L’objet du présent travail est d’utiliser ce modèle pour caractériser l’atteinte tubulo-interstitielle et identifier les mécanismes qui vont de l’intoxication de la cellule tubulaire à la fibrose interstitielle chronique. Nous avons ainsi particulièrement étudié :la nécrose et l’apoptose des cellules épithéliales tubulaires, la transition épithélio-mésenchymale des cellules épithéliales tubulaires proximales, l’atrophie tubulaire, le rôle de l’infiltrat inflammatoire interstitiel et des cytokines pro-inflammatoires et pro-fibrosantes. L’introduction inscrira d’abord notre travail dans le cadre général de l’insuffisance rénale chronique et soulignera, dans ce domaine, l’importance du secteur tubulo-interstitiel, pour ensuite retracer l’histoire de la néphropathie aux acides aristolochiques. Nos matériels, méthodes et résultats sont fournis par des copies de trois publications. Ces résultats sont ensuite transversalement discutés, mécanisme par mécanisme. La discussion met l’accent sur l’apport spécifique de nos travaux concernant chacun des mécanismes étudiés. Nous terminerons par l’évocation de quelques perspectives que ce travail est susceptible d’ouvrir. RESUMÉLa néphropathie aux acides aristolochiques (NAA), initialement appelée néphropathie aux herbes chinoises, se caractérise par une progression rapide de l’insuffisance rénale chronique vers le stade terminal. Cette évolution a été attribuée aux lésions tubulo-interstitielles caractéristiques :fibrose interstitielle pauci-cellulaire et atrophie tubulaire sévères. Cependant, les mécanismes impliqués dans l’évolution péjorative de la NAA n’ont pas été élucidés. Divers paramètres biologiques et histologiques ont donc été explorés au cours de la NAA dans le modèle expérimental développé chez le rat Wistar mâle. Le protocole expérimental a consisté à administrer à deux groupes de rats Wistar mâles âgés de 4 semaines des injections sous-cutanées quotidiennes de 10 mg/kg d'AA (rats AA) ou d’un volume correspondant du solvant (témoins) pendant 35 jours. A l’opposé des témoins (structure et fonction rénales normales), une phase d’insuffisance rénale aiguë et transitoire, secondaire à une nécrose tubulaire a été démontrée chez les rats intoxiqués par les AA aux jours 4 et 5. Un infiltrat de cellules mononucléées a été observé dès le 3ème jour jusqu’au jour 35. A partir du jour 10, une atrophie tubulaire et une fibrose interstitielle progressive ont été objectivées. Chez les rats exposés aux AA, la perte du phénotype épithélial par les cellules épithéliales tubulaires proximales (CETP) (disparition de l’expression baso-latérale de la N-cadhérine) a été observée dès le jour 2, en parallèle à l’acquisition du phénotype mésenchymateux (expression de la vimentine). Aucune migration de CETP « dédifférenciées » vers l’interstitium n’a été objectivée malgré la rupture de la membrane basale tubulaire. L’accumulation de myofibroblastes, exprimant l’« alpha smooth muscle actin» était évidente au sein de l’épithélium tubulaire en dégénérescence et dans l’interstitium riche en collagène de type I et III autour des tubes atrophiques. L’apoptose de CETP (expression de la forme active de la caspase-3) était présente dès le jour 5. Au-delà du 10e jour, un défaut de la régénération de CETP a été démontré. Une augmentation significative de l’excrétion urinaire du « Monocyte Chemoattractant Protein-1 » et du « Transforming Growth Factor-β» (TGF-β) a été mesurée durant la phase chronique. Les amas de monocytes/macrophages (Mn/Mφ) et de lymphocytes T CD45RC+, CD3+, CD4+ et CD8+ étaient présents dans l’interstitium des stries médullaires et la partie externe de la médullaire externe (segment S3 des tubes proximaux). L’activation et la prolifération des Mn/Mφ ont été confirmées respectivement par double immunomarquage ED1/complexe majeur d’histocompatibilité de classe II et ED1/Ki-67. La cytotoxicité des cellules CD8+ a été d émontrée par des lésions de tubulite. Une sous-population de lymphocytes T CD8+CD103+a été retrouvée. L’expression du TGF-β et de la protéine nucléaire phosphorylée smad 2/3 était augmentée dans les cellules inflammatoires et les CETP. Ce travail démontre :1) la présence d’une insuffisance rénale aiguë transitoire suite une nécrose tubulaire aiguë méconnue; 2) une induction précoce de la transition épithélio-mésenchymale, un échec de la régénération et une apoptose des CETP étant à l’origine de l’atrophie tubulaire; 3) une inflammation interstitielle précoce et persistante (Mn/Mφ activés, lymphocytes T cytotoxiques CD8+ et sous-population de lymphocytes T CD8+C103+); 4) l’implication du TGF-β dans la fibrogenèse par la voie de signalisation intracellulaire de smad 2/3.En conclusion, au cours de la NAA expérimentale, une intense réaction inflammatoire associée à une sécrétion de TGF-β et à une activation des fibroblastes résidents représentent les mécanismes-clés conduisant à une atrophie tubulaire définitive et à une fibrose interstitielle chronique à partir d’une intoxication tubulaire majeure. Ces observations offrent des perspectives thérapeutiques prometteuses pour la prévention de la fibrose rénale interstitielle et, par voie de conséquence, de la progression des maladies rénales chroniques. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les probiotiques sont des microorganismes vivants qui, lorsqu’ils sont ingérés en quantité adéquate, peuvent exercer des propriétés bénéfiques sur la santé de l’hôte. Les souches de Bacillus utilisées en tant que probiotiques ne sont pas colonisatrices du tractus intestinal, mais sont des résidents transitoires du microbiote. Ce travail fait l’investigation in vitro de l’association, qualifiée de synbiotique, entre une souche probiotique de Bacillus subtilis et une source carbonée prébiotique, composé alimentaire peu digéré par les enzymes intestinales mais utilisable par les bactéries dans l’intestin. L’étude de cette association met en évidence la capacité de la souche à utiliser les isomaltooligosaccharides (IMOS) prébiotiques comme unique substrat carboné. L’effet positif de ce substrat sur la tolérance à la bile de la souche a été démontré in vitro. Les résultats d’une analyse protéomique faisant l’étude des enzymes clés impliquées dans le métabolisme des IMOS, ainsi que d’autres biomarqueurs d’intérêt probiotique, sont en cours d’exploitation. Ce travail préliminaire d’investigation de l’association synbiotique entre les IMOS prébiotiques et la souche probiotique B. subtilis, aboutira à des essais in vivo. Les effets bénéfiques des probiotiques du genre Bacillus, notamment au niveau de la modulation du système immunitaire, résultent de l’interaction entre les molécules de la surface bactérienne et les cellules de l’intestin. Les mécanismes moléculaires à l’origine de l’immunomodulation sont mal connus, alors que leur compréhension est nécessaire à l’optimisation de l’utilisation du probiotique. Un deuxième volet de ce travail concerne la comparaison des structures d’entités moléculaires de surface de trois Bacilli probiotiques, les acides lipotéichoïques (LTAs), et leurs activités immunologiques respectives. Une étude structurale des LTAs par des méthodes biochimiques et par RMN a permis de mettre en évidence la diversité structurale au sein du même genre Bacillus. Le rôle clé de la D-alanine dans l’activité biologique de ces antigènes bactériens a été démontré. / Probiotics are live microorganisms, which when administered in adequate amounts confer a health benefit on the host. Bacillus probiotic strains are not able to colonize the gut, and are considered as transient residents of the microbiota. Prebiotic are non-digestible food ingredients that could stimulate growth of bacteria in the gut. This work investigates the in vitro effect of a prebiotic isomaltooligosaccharide (IMOS) on the growth of a probiotic strain Bacillus subtilis. This study highlights the ability of the strain to use IMOS as unique carbon source. A comparative proteomic analysis investigates the main enzymes implicated in the prebiotic metabolism, and biomarkers possibly involved in probiotic effects. This preliminary work, which studies the synbiotic association between a probiotic and a prebiotic, will lead to in vivo assays. Beneficial effects of probiotic Bacilli, mainly modulation of intestinal immune system, result from interaction between bacterial cell-wall molecules and intestinal cells. The molecular origin of immunomodulatory mechanisms are poorly understood, while understanding is needed to optimize the use of probiotics. A second part of this work consists in comparing the structure of a molecular cell-wall component named lipoteichoic acids (LTA) from three Bacillus probiotic, a molecular cell-wall component of Gram positive bacteria, and their immunological activity. A structural study, using biochemical determinations and NMR spectroscopic analysis, highlights the structural diversity between LTAs from different Bacillus species. The key role of D-alanine substituents in the biological activity of these bacterial antigens has been demonstrated.

Cell surface transport proteins play a crucial role in all cells, from unicellular organisms to mammals, by conferring to the plasma membrane selective permeability to a wide range of ions and small molecules. The activity of these proteins is very often regulated by controlling their amount at the plasma membrane where they are removed by means of selective endocytosis in response to signals and changes in the environment.<p>One of the membrane proteins of the yeast Saccharomyces cerevisiae whose regulation has been extensively studied is the general amino acid permease. Previous studies on Gap1 and other yeast permeases revealed that ubiquitin plays a key role in the membrane trafficking of these proteins by providing a signal that triggers their internalization in endocytic vesicles and that promote their sorting into intra-endosomal vesicles for subsequent delivery into the lumen of the vacuole, the lysosome of yeast. <p>In the first part of this work, we report the isolation of 64 mutant forms of the Gap1 protein and their exploitation in a systematic functional study of the predicted intracellular regions of the permease. The phenotypic analysis of these mutants revealed an important role of certain amino acid sequences in the (i) transport of the permease through the secretory pathway (ii) intrinsic activity of the permease at the plasma membrane (iii) stability of the protein at the cell surface (iv) sorting of the protein into intra-endosomal vesicles. Further investigation of some of these mutants allowed us to unravel an original mechanism for the degradation of the permease that is independent of its ubiquitylation.<p>In the second part of the work, we used yet other Gap1 mutants to study the signals and pathways inducing the ubiquitylation and endocytosis of the permease. Also, we further investigated the molecular mechanisms inducing Gap1 ubiquitylation. <p>All these results together allow us to better understand the mechanisms controlling the ubiquitin dependent down-regulation of plasma membrane proteins. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le carisbamate est la 1ère molécule à avoir un effet modificateur de l’épileptogenèse, dont environ 50% des animaux traités développent des crises d’absence, au lieu des crises limbiques normalement observées dans le modèle de la pilocarpine. Le principal objectif de cette thèse a été celui d’étudier les altérations qui se produisent par le traitement par le carisbamate. Pour cela nous avons effectué une cartographie de l’activité cérébrale, avec un immunomarquage de la protéine c-Fos, et nous avons vérifié les concentrations des monoamines et acides aminés dans l’hippocampe, le thalamus et dans le cortex piriforme par HPLC, 4h après le début du status epilepticus (SE). Enfin, nous avons vérifié le profil d’expression protéique dans l’hippocampe, 2 mois après le SE par électrophorèse bidimensionnelle.Les résultats indiquent que le carisbamate augmente l’activité des noyaux MD et LD du thalamus. Les résultats suggèrent aussi que la dopamine, la noradrenaline, le GABA et la sérotonine peuvent participer à la significative neuroprotection et à l’effet modificateur de l’épileptogenèse du carisbamate. L’étude de protéomique suggère également une réduction globale du métabolisme énergétique cellulaire chez les rats traité par le carisbamate qui développent des crises d’absence. / The carisbamate is the 1st molecule showing an epileptogenesis modifying effect, that about 50% of treated animals develops absence instead limbic seizures, commonly seen in the pilocarpine model. The aim of this thesis was to study the changes that follows carisbamate treatment. Therefore, we made a brain activity cartography, by labelling c-Fos protein, and we quantified the concentrations of amino acids and monoamines in hippocampus, thalamus and piriform cortex, 4h after the status epilepticus (SE). Moreover, we studied the protein expression profile in the hippocampus, 2 month after SE, by two-dimensional electrophoresis.The results points towards an increased activity of MD and LD thalamic nuclei in carisbamate treated rats. Furthermore, dopamine, noradrenaline, GABA and serotonin appears to play a role in neuroprotection and in the epileptogenesis modifying effect of carisbamate. The proteomic study revealed a global reduction of cellular energetic metabolism of carisbamate treated rats that develops absence seizures.

Le glutamate est le principal neurotransmetteur excitateur du système nerveux central. Il est responsable de la majorité des transmissions synaptiques. En revanche, cet acide aminé naturel est aussi impliqué dans de nombreuses neuropathologies notamment en cas de surconcentration au niveau des synapses. Les récepteurs métabotropiques du glutamate, capables de moduler la transmission synaptique, constituent des cibles thérapeutiques prometteuses. Ces récepteurs sont divisés en trois groupes et notre laboratoire s’est focalisé sur ceux du groupe III et particulièrement le sous-type 4 qui présente des caractéristiques intéressantes dans le traitement symptomatique de la douleur et de la maladie de Parkinson. Le manque d’outils pharmacologiques de ce récepteur nous a poussé à synthétiser de nouveaux agonistes orthostériques à partir du composé référence, le LSP4-2022. Cette molécule est issue de nombreuses optimisations chimiques du (S)-PCEP provenant lui d’un screening virtuel. Durant ces trois années de doctorat, nous avons pu peaufiner la relation structure-activité autour du LSP4-2022 en synthétisant des nouveaux analogues fluorés et hétérocycliques. En parallèle, une seconde étude nous a permis d’attribuer la configuration des deux diastéréomères constituants tous les composés testés à ce jour / Glutamate is the major excitatory neurotransmitter in the central nervous system. It is responsible of the majority of synaptic transmissions. In contrast, this natural amino acid is also involved in numerous neuropathologies and particularly in case of glutamate overconcentration in the synapse. Metabotropic glutamate receptors, that can modulate synaptic transmission, thus constitute promising therapeutic targets. These receptors are divided in three groups and our laboratory has been focused in group III and especially subtypes 4 which own interested properties in symptomatic treatment of pain and Parkinson Disease. The lack of pharmacological tools targeting this receptor prompts us to synthesize novel orthosteric agonist from the hit compound LSP4-2022. This molecule was obtained after several chemical optimizations from (S)-PCEP discovered from virtual screening. During my Ph.D., we could refine the structure-activity relationship of LSP4-2022 synthesizing new fluorinated and heterocyclic derivatives. Besides, a second study was carried out to identify the configuration of the two diastereomers which form tested compounds

La survenue de lésions hépatiques représente une cause majeure de retrait des médicaments au cours de leur développement et après leur mise sur le marché. La manifestation la plus fréquente des effets secondaires liés aux médicaments est lacholestase qui résulte d’un blocage de la sécrétion biliaire. Ils peuvent être prévisibles, généralement dépendants de la dose, ou dans certains cas n’être observés que chez un nombre restreint de patients traités, par exemple avec la chlorpromazine (CPZ), un neuroleptique. Il s’agit alors d’une hépatotoxicité idiosyncratique. Notre travail a eu pour but d’induire une cholestase avec ce médicament et d’étudier les mécanismes impliqués, en présence ou non d’un stress inflammatoire en utilisant comme modèle expérimental les cellules hépatiques différenciées HepaRG dérivées d’un cholangio-hépatocarcinome humain. Nous avons tout d’abord validé ce modèle en montrant que les principaux transporteurs d’influx et d’efflux canaliculaires et basolatéraux sont bien localizes dans les domaines membranaires appropriés, et que les canalicules biliaires sont fonctionnels et fermés comme dans les hépatocytes humains cultivés en sandwich, le modèle de référence. Le traitement par CPZ à une concentration élevée (50μM) entraine après 15min la génération d’un stress oxydant associé à une altération du potentiel membranaire mitochondrial et de la distribution péricanaliculaire des microfilaments de F-actine et à une inhibition de l’efflux canaliculaire de l’acide taurocholique. Après 24h, on observe notamment une inhibition de l’expression des deux principaux transporteurs canaliculaires, BSEP et MDR3, du transporter d’influx NTCP et une surexpression du transporteur basolatéral MRP4. Ces effets suggèrent une réponse compensatrice des cellules face à l’accumulation intracellulaire des acides biliaires. L’inflammation est considérée comme un facteur de susceptibilité dans l’hépatotoxicité idiosyncratique. Nous avons recherché si dans un context inflammatoire induit par l’IL-6 et l’IL-1β, les effets cytotoxiques et cholestatiques de CPZ sont aggravés. Après un prétraitement de 24h par les deux cytokines proinflammatoires, les cellules HepaRG, ont été co-exposées à 20μM CPZ pendant 1 à 5 jours. Bien que les cytokines aient induit un stress inflammatoire et inhibé le métabolisme de la CPZ et les transcrits de CYP3A4 et CYP1A2, deux principaux CYPs impliqués dans le métabolisme de ce médicament, la modulation des effets cytotoxiques et cholestatiques de la CPZ observés est restée limitée, y compris après 5 jours. Une cytotoxicité accrue de 20% et une amplification de l’inhibition des transcrits et de l’activité de NTCP ainsi que la dérégulation de l’expression d’autres gènes liés à la cholestase, ont été constatées suite au co-traitement à CPZ et aux cytokines. Au total, nos résultats montrent qu’il est possible d’induire une cholestase in vitro à partir des cellules HepaRG et que la cholestase induite par CPZ a pour origine l’induction d’un stress oxydant. Ils montrent en outre que l’étude de certains facteurs de susceptibilité peut être envisagée. / Drug-induced liver injury is the major cause of drug withdrawal during development and marketing process. The most common manifestation of adverse drug reactions is cholestasis, which results from alteration of bile flow. Adverse drug reactions are usually classified either as dose-dependent and reproducible (intrinsic) or unpredictable (idiosyncratic) occurring only in certain susceptible patients as observed with chlorpromazine (CPZ), a neuroleptic drug. Our work aimed to induce cholestasis with this drug and to study the mechanisms involved in the presence or absence of an inflammatory stress using differentiated HepaRG liver cells derived from a human cholangio-hepatocarcinoma as an experimental model. We firstly validated this cell model by demonstrating that the major canalicular and basolateral influx and efflux transporters are localized to the appropriate membrane domains, and that the bile canaliculi are functional and closed as in sandwichcultured human hepatocytes, the reference model. Treatment with CPZ at a high concentration (50μM) induces, as early as 15min, generation of oxidative stress which is associated with altered mitochondrial membrane potential, disruption of the pericanalicular F-actin cytoskeleton distribution and inhibition of canalicular efflux of taurocholic acid. After 24-hour treatment with CPZ, mRNA expression of the two main canalicular bile transporters, BSEP and MDR3, and of the main influx transporter, NTCP, was decreased. By contrast, expression of MRP4 mRNA, a basolateral transporter, was increased. These latter events likely represent hepatoprotective responses which aim to reduce intrahepatic accumulation of toxic BA. Inflammation is considered as a factor of susceptibility to idiosyncratic hepatotoxicity. We investigated whether in an inflammatory stress induced by IL-6 and IL-1β, cytotoxic and cholestatic effects of CPZ are exacerbated. After a 24 hour pre-treatment by either pro-inflammatory cytokines, HepaRG cells were co-exposed to 20μM CPZ for 1 to 5 days. Although cytokines have induced inflammatory stress and inhibited the metabolism of CPZ and transcripts of CYP3A4 and CYP1A2, two main CYPs involved in the metabolism of this drug, the modulation of cytotoxic and cholestatic effects of CPZ was limited, even after 5 daily treatments. Increased cytotoxicity by 20 %, amplification of NTCP mRNA and activity inhibition and deregulation of the expression of other genes associated with cholestasis, were observed in CPZ- and cytokine-co-treated cells. Altogether, our results show that it is possible to induce in vitro cholestasis using HepaRG cells and that CPZ-induced cholestasis depends on the generation of oxidative stress. They also show that the certain susceptibility factors may be investigated.