Le but de notre travail était d'étudier comment des interactions impliquant des acides nucléiques pouvaient réguler le cycle viral du virus de l'hépatite C (VHC). L'ARN génomique du VHC est très structuré au niveau de ses extrémités 5' et 3'. La tige-boucle 5BSL3.2 a été décrite comme interagissant avec la SLIIId, la Seq9110 et la SL2 par génétique inverse et expériences de complémentation de mutations. La résonance plasmonique de surface (SPR) a été utilisée afin de caractériser ces interactions. Cela nous a conduit à développer des méthodes permettant d’étendre l'utilisation de la SPR. Nous avons pu observer, in vitro, une interaction entre la 5BSL3.2 et miR-122, un microARN fortement exprimé dans les hépatocytes. Nos résultats ont également montré que la SL2 était une séquence ARN pouvant former au moins deux conformations. L'une étant capable d'interagir avec la 5BSL3.2 et l'autre pouvant s'auto-associer. L'étude de cette dimérisation sur modèle cellulaire a montré qu'elle était impliquée dans les mécanismes de la réplication virale. Le développement d'une méthode d'analyse des complexes ternaires a permis la caractérisation simultanée du complexe formé entre la boucle interne de la 5BSL3.2 et ses partenaires (Seq9110 et SLIIId) ainsi que du complexe formé entre la boucle apicale et ses partenaires (SL2 et miR-122). Ces résultats ont montré que les deux sites de liaison de la 5BSL3.2 étaient structurellement indépendants. Ces interactions pourraient donc coexister dans un contexte physiologique. Les résultats montrent que la SLIIId et la Seq9110 sont en compétition pour interagir avec la boucle interne de la 5BSL3.2 tandis que la tige-boucle SL2 et miR-122 sont en compétition pour interagir avec la boucle apicale de la 5BSL3.2. La 5BSL3.2 est donc un motif ARN structuré pouvant agir comme une plaque tournante, capable d'interagir avec d'autres régions de l'ARN génomique tandis que la SL2 a montré que les deux interactions qu'elle pouvait former, mutuellement exclusives, étaient importantes pour la prolifération virale. Les mécanismes de compétition observés pourraient être impliqués dans la commutation entre les différentes étapes du cycle viral. / We are interested in understanding how interactions involving nucleic acids regulate the life cycle of the Hepatitis C virus (HCV). The HCV genomic RNA is highly structured at the 5' and 3' ends. The stem-loop 5BSL3.2 was described to interact with the SLIIId, the Seq9110 and the SL2 by reverse genetics and complementation mutation experiments. Surface plasmon resonance (SPR) was used to characterize these interactions. This led us to develop methods to expand the use of this technique. We described in vitro evidences for an interaction between 5BSL3.2 and miR-122, a microRNA highly expressed in hepatocytes. As shown by our results, SL2 is a highly dynamic RNA motif that fluctuates between at least two conformations: one is able to hybridize with 5BSL3.2 and the other one is capable of self-associating. The study of this dimerization in living cells has shown an implication of this phenomenon in viral replication processes. The development of a ternary complex analysis method allowed the characterization of the Seq9110 (or SLIIId) and SL2 (or miR-122) interacting with 5BSL3.2. Our results shown that the two binding sites of 5BSL3.2, the apical and internal loops, are structurally independent, suggesting that these interactions may coexist in a physiological context. SLIIId and Seq9110 were shown to compete to interact with 5BSL3.2 internal loop while SL2 and miR-122 were shown to compete to interact with 5BSL3.2 apical loop. In conclusion, 5BSL3.2 is a structured RNA motif that could act as a molecular hub capable of interacting with other genomic RNA regions while the two interactions of the SL2, mutually exclusives, were shown to be crucial for viral proliferation. The competition mechanisms observed could be involved in the commutation between viral cycle steps.

Les premier et second transferts de brin sont deux étapes essentielles de la transcription inverse du génome du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). De nombreuses études in vitro suggèrent que les transferts nécessitent l’action de la protéine de nucléocapside du VIH-1 (NC). Le premier transfert, se produisant de l’extrémité 5’ vers l’extrémité 3’ de l’ARN génomique du VIH-1, repose en grande partie sur un appariement ADN-ARN impliquant la région r de l’ADN strong-stop (ADNss) et la région R située à l’extrémité 3’ de l’ARN viral (ARN 3’UTR). Les structures, interactions et dynamiques qui gouvernent cet appariement sont mal connues. Jusqu’à notre étude, la formation de l’hybride ADN-ARN n’avait été étudiée in vitro qu’avec des courts acides nucléiques qui ne reflètent que partiellement les structures formées par l’ADNss et l’ARN 3’UTR dans le virus en cours de réplication. L’objectif principal de ma thèse a été de caractériser in vitro les mécanismes moléculaires qui gouvernent l’hybridation de l’ADNss avec l’ARN 3’UTR. Pour atteindre cet objectif, j’ai utilisé des méthodes de la biologie moléculaire et j’ai analysé la structure secondaire de l’ADNss entier avec trois sondes de structure (DNase I, mung bean nuclease et permanganate de potassium) : i) en l’absence de NC ; ii) en présence de NC ; iii) en présence de l’ARN 3’UTR.Les résultats obtenus nous ont permis d’être les premiers à déterminer in vitro la structure secondaire de l’ADNss entier du VIH-1 et à identifier dans celui-ci quatre sites sur lesquels se fixe préférentiellement la NC. A notre connaissance, les structures secondaires des ADNss d’autres rétrovirus n’ont pas été déterminées. Nos données structurales sont en faveur d’une structure secondaire de l’ADNss du VIH-1 constituée de trois tiges-boucles (u5, cpoly(A) et cTAR) et trois régions simple-brin en l’absence ou présence de NC. Notre analyse phylogénétique suggère que la structure secondaire de l’ADNss et les sites forts NC sont conservés parmi les différents groupes du VIH-1. Nos résultats suggèrent aussi qu’une partie de la région u5 de l’ADNss établit des interactions très faibles et probablement transitoires avec une partie de la région U3 de l’ARN 3’UTR en l’absence de NC. En réalisant des cinétiques d’hybridation et en utilisant deux ADNss mutés, nous avons montré que l’hybridation ADNss-ARN 3’UTR nécessite l’activité de la NC et que ce processus ne repose pas sur une seule voie d’initiation. Nos résultats supportent un modèle dans lequel la première étape est la fixation de la NC au niveau des quatre sites, ce qui va déclencher l’ouverture de la structure tridimensionnelle de l’ADNss et favoriser ainsi l’accessibilité de la région r ; la seconde étape étant la déstabilisation par la NC des structures secondaires ; la troisième étape étant l’appariement par la NC des régions complémentaires r et R. L’ensemble des résultats obtenus permet à mon équipe d’accueil d’initier de nouvelles études in vitro et ex vivo. / An essential step of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) reverse transcription is the first trand transfer that requires base pairing of the R region at the 3’- end of the genomic RNA with the complementary r region at the 3’-end of minus strand strong-stop DNA (ssDNA). HIV-1 nucleocapsid protein (NC) facilitates this annealing process. Determination of the ssDNA structure is needed to understand the molecular basis of NC-mediated genomic RNA-ssDNA annealing. For this purpose, we investigated ssDNA using structural probes (nucleases and potassium permanganate). This study is the first to determine the secondary structure of the fulllength HIV-1 ssDNA in the absence or presence of NC.Our probing data obtained in the absence of NC, suggest weak contacts between the u5 region of ssDNA and the U3 region the genomic RNA. The probing data and phylogenetic analysis support the folding of ssDNA into three stem-loop structures and the presence of four high-affinity binding sites for NC. Using the gel retardation assay, we analyzed the interaction of NC with each site. Taken together, our results support a model for the NC-mediated annealing process in which the preferential binding of NC to four sites triggers unfolding of the threedimensional structure of ssDNA, thus facilitating interaction of the r sequence of ssDNA with the R sequence of the genomic RNA. In addition, using gel retardation assays and ssDNA mutants, we show that the annealing of ssDNA to the 3’- end of the genomic RNA requires NC activity and does not rely on a single pathway (zipper intermediate or kissing complex).

Ce mémoire de maîtrise présente les travaux liés au développement d’une technologie permettant de faciliter la conceptualisation des nouveaux outils de biologie moléculaire. Cette nouvelle technique est centrée sur la détection d’acides nucléiques et a été développée dans un contexte de diagnostic des maladies infectieuses. Ce mémoire est centré sur deux principales techniques : la PCR en temps réel (rtPCR) et l’hybridation sur biopuce. Notre technologie permet la réalisation de ces deux réactions biochimiques complexes dans une même chambre réactionnelle et dans un seul et même tampon, ceci à l’aide d’un oligonucléotide structuré. Le premier chapitre décrit les différentes techniques de rtPCR et les différents paramètres d’hybridation sur biopuce. Les principes directeurs de la recherche sont présentés dans le deuxième chapitre. Le troisième chapitre comporte le manuscrit démontrant la faisabilité de notre nouvelle technologie. Finalement, le quatrième chapitre discute des perspectives du projet.

Titre de l'écran-titre (visionné le 29 mai 2023) / Contexte : Peu d'études ont évalué l'efficacité du vaccin Comirnaty 10 μg selon les sous-variants d'Omicron ou selon l'intervalle entre les deux doses chez les enfants. Cette étude a estimé l'efficacité du Comirnaty 10 μg contre l'infection par Omicron chez des enfants de 5 à 11 ans au Québec. Méthode : Cette étude cas-témoin test négatif a évalué l'efficacité vaccinale (EV) contre une infection confirmée par le SRAS-CoV-2, selon le délai depuis la dernière dose vaccinale, l'intervalle entre les deux doses et la période de prédominance de sous-variants Omicron. Les tests d'amplification de l'acide nucléique (TAAN) réalisés entre le 9 janvier et le 20 août 2022 chez des enfants de 5-11 ans vivant dans la communauté sans infection documentée antérieure ont été inclus dans l'étude. Résultats : Un total de 32 684 TAAN ont été inclus dans l'analyse globale. L'EV avec deux doses a diminué de 41 % (IC 95 %, 33-48 %) à 5 % (IC 95 %, -6-15 %) contre toute infection et de 68 % (IC 95 %, 61-74 %) à 32 % (IC 95 %, 19-43 %) contre l'infection symptomatique, 14-55 et 56-240 jours après la vaccination, respectivement. L'EV contre toute infection est passée de 11 % (IC 95 %, -1-22 %) avec un intervalle entre les doses de 21-55 jours à 54 % (IC 95 %, 34-70 %) pour un intervalle de 84 jours ou plus. Au cours des périodes BA.1, BA.2 et BA.4/5, l'EV avec deux doses contre toute infection symptomatique a baissé de 70 % (IC 95 %, 63-76 %) à 31 % (IC 95 %, 12-46 %) et à 3 % (IC 95 %, -51-37 %). Conclusion : Un intervalle plus long entre les deux doses a amélioré l'efficacité contre toute infection, tandis que l'efficacité de deux doses de vaccin avait tendance à diminuer avec le délai depuis la dernière dose et à travers les périodes BA.1, BA.2 et BA.4/5. / Background: Few studies evaluated specific Omicron subvariants Comirnaty 10 μg vaccine effectiveness (VE) or estimated VE by dosing interval in children. We estimated Comirnaty 10 μg VE against Omicron infection in 5-11 years-old children in Quebec. Method: This test-negative case-control study was conducted to assess VE against confirmed SARS-CoV-2 infection, by time since last vaccine dose, interval between two doses and Omicron subvariant predominance period. Nucleic Acid Amplification Tests (NAATs) performed between January 9 and August 20, 2022, in community-dwelling and non-previously infected children aged 5-11 years old were included. Results: A total of 32,684 NAATs were included in the overall analysis. Two-dose-VE decreased from 41 % (95 % CI, 33-48 %) to 5 % (95 % CI, -6-15 %) against any infection, and from 68 % (95 % CI, 61-74 %) to 32 % (95 % CI, 19-43 %) against symptomatic infection, 14-55 and 56-240 days after vaccination, respectively. VE against any infection increased from 11 % (95 % CI, -1-22 %) with a 21-55-days one-to-two-dose-interval to 54 % (95 % CI, 34-70 %) for an interval of 84 days or more. Over the BA.1, BA.2 and BA.4/5 periods, two-dose-VE against symptomatic infection dropped from 70 % (95 % CI, 63-76 %) to 31 % (95 % CI, 12-46 %) and to 3 % (95 % CI, -51-37 %). Conclusion: Longer interval between two doses improved VE against any infection whereas two-doses of BNT162b2 effectiveness tended to decrease over time since the last dose and over the BA.1, BA.2 and BA.4/5 periods.

Cette thèse décrit deux thèmes principaux: 1) la conception, la synthèse, et l'évaluation biophysique des nucléosides tricycliques, et 2) la synthèse de nagilactone B, un produit naturel norditerpenoïde dilactone de la famille de produits naturels “podolactone”. Le premier chapitre décrit la stratégie de design rationnel des nucléosides nommé “restriction conformationnelle double” basée sur les études de modélisation structurales des duplex ADN–ARN modifiés. Cette stratégie implique un blocage du cycle furanose dans une configuration de type N- ou S, et une restriction de la rotation torsionelle autour de l’angle γ. La première contrainte a été incorporée avec un pont méthylène entre l’oxygène en position 2′ et le carbone 4′ du nucléoside. Cette stratégie a été inspirée par les acides nucléiques bloqués (ou “locked nucleic acid”, LNA). La deuxième contrainte a été réalisée en ajoutant un carbocycle supplémentaire dans l'échafaud de l’acide nucléique bloqué. Les défis synthétiques de la formation des nucléotides modifiés à partir des carbohydrates sont décrits ainsi que les améliorations aux stabilités thermiques qu’ils apportent aux duplex oligonucléïques dont ils font partie. Chapitres deux et trois décrivent le développement de deux voies synthétiques complémentaires pour la formation du noyau de nagilactone B. Ce produit naturel a des implications pour le syndrome de Hutchinson–Gilford, à cause de son habilité de jouer le rôle de modulateur de l’épissage d’ARN pré-messager de lamine A. Ce produit naturel contient sept stereocentres différents, dont deux quaternaires et deux comprenant un syn-1,2-diol, ainsi que des lactones à cinq ou six membres, où le cycle à six ressemble à un groupement α-pyrone. La synthèse a débuté avec la cétone de Wieland-Miescher qui a permis d’adresser les défis structurels ainsi qu’explorer les fonctionnalisations des cycles A, B et D du noyau de nagilactone B. / The present thesis comprises two major themes: 1) the design, synthesis, and biophysical evaluation of conformationally restricted tricyclic nucleosides for antisense applications, and 2) strategic approaches for synthesizing the core of nagilactone B, a norditerpenoid dilactone from the podolactone family of natural products. Guided by structural studies of modified DNA–RNA duplexes, Chapter One focuses on a proposed dual-conformational-restriction strategy, in which two modes of conformational restriction are incorporated into a single nucleotide modification: 1) locking the furanose ring in an N- or S-type configuration and 2) restricting rotation around backbone torsion angle γ. The first constraint was incorporated by way of a 2′,4′-anhydro bridge that is found in the scaffold of locked nucleic acid (LNA), while the second was realized by annealing an additional carbocyclic ring to the modified nucleoside. The synthetic challenges associated with preparing these highly constrained molecules from carbohydrate-derived starting materials are described, in addition to the corresponding improvements in duplex thermal stability they provide to oligonucleotide sequences containing them. Chapters Two and Three describe complementary approaches for the synthesis of the core of nagilactone B, a natural product with implications for Hutchinson–Gilford progeria syndrome, as a consequence of its ability to act as a modulator of splicing events leading to lamin A. This natural product contains seven stereogenic centers overall, including a syn-1,2-diol moiety, a γ-lactone, and a pair of quaternary stereocenters, which are complemented by the presence of an α-pyrone moiety. To address the synthesis of these structural features, the utility of the Wieland–Miescher ketone was explored with an emphasis on synthesizing rings A, B, and D of the core of nagilactone B.

Cette thèse a premièrement permis le développement d’une méthode de détection non-enzymatique de l’ADN. Les techniques enzymatiques couramment utilisées, comme la Polymerase Chain Reaction (PCR), échouent souvent dans l’analyse d’échantillons anciens ou transformés. L’ADN subit en effet de nombreuses dégradations post mortem, parmi lesquelles certaines bloquent les enzymes ADN-polymérases. Notre méthode combine hybridation et détection par SERRS (Surface Enhanced Resonant Raman Scattering), permettant la détection et la quantification de séquences d’ADN dégradées réfractaires à l’analyse par PCR. De nouvelles perspectives s’ouvrent donc en paléogénétique. Cette thèse aborde également le rôle des surfaces minérales dans l’origine des acides nucléiques. Les surfaces minérales pourraient avoir piégé et concentré les briques élémentaires de ces biopolymères, contribuant ainsi à leur construction. Les travaux existants se sont concentrés sur des minéraux comme la montmorillonite, qui n’était cependant pas abondante à l’Hadéen/Archéeen. La minéralogie de la Terre primitive aurait plutôt été dominée par les phyllosilicates ferromagnésiens. Nous avons étudié l’adsorption de nucléotides sur des minéraux plus cohérents avec le contexte géologique, en variant les paramètres environnementaux. Ce travail permet de préciser le mécanisme d’adsorption des nucléotides sur les surfaces minérales, ainsi que les conditions de l’origine du matériel génétique. / The first goal of this thesis was the development of a non-enzymatic DNA detection method. Current enzymatic techniques such as Polymerase Chain Reaction (PCR) often fail in analyzing ancient or processed samples. Indeed DNA undergoes numerous post-mortem degradations, among which some are known to block the bypass of DNA-polymerases. Our method combines hybridization and SERRS (Surface Enhanced Resonant Raman Scattering) spectroscopy, and allows the detection and quantification of degraded DNA sequences that are refractory to PCR analysis. This novel detection method therefore opens new perspectives, especially in paleogenetics. This thesis also aims at studying the role of mineral surfaces in the origin of nucleic acids. Mineral surfaces might have trapped and concentrated the elementary bricks of those biopolymers, thus contributing in their formation. Previous work has focused on minerals such as montmorillonite, although it might not have been abundant during the Hadean/Archean. The primitive Earth’s mineralogy would have been preferentially dominated by Fe-Mg rich phyllosilicates. We have therefore studied the adsorption of nucleotides on minerals we think are relevant to the geological context, and have varied the environmental conditions. This work allows characterizing the adsorption mechanism of nucleotides on mineral surfaces, as well as environmental conditions of the origin of genetic material.

La qPCR est actuellement la technique de référence en matière de quantification d'ADN. Elle peut être définie comme une amplification exponentielle, cyclique et ciblée de la séquence d'ADN cible. Le caractère exponentiel de la qPCR est à la fois à l'origine de la sensibilité de la méthode mais aussi d'une potentielle variabilité inter-échantillons. Cette variabilité est compensée par le caractère cyclique de la méthode qui entraine une synchronisation de la réaction pour tous les échantillons à chaque cycle. L'amplification ciblée de la séquence choisie traduit quand à elle la spécificité de la méthode. Néanmoins, cette dernière propriété de la PCR reste la moins vérifiée. La spécificité de la qPCR est indiscutable lorsque la cible à détecter se trouve en quantité suffisante (>100 copies environ). En revanche, pour des quantités plus faibles ou en présence d'inhibiteurs, la spécificité diminue ou disparaît (limites de détection et de quantification). Cette perte de spécificité retentit de façon significative sur la précision et la reproductibilité du dosage à réaliser. Cependant, si l'hybridation non spécifique est inéluctable dans ces conditions, l'amplification non spécifique consécutive peut être limitée, voire supprimée au moyen d'amorces de PCR soit plus spécifiques, soit moins susceptibles de générer des différences inter-échantillons. La RT-qPCR, grâce à une étape initiale de transcription inverse (conversion d'un ARN en un ADN complémentaire) permet la quantification des ARN. Cependant, la transcription inverse reste moins reproductible que la PCR, générant des différences inter-échantillons délétères en diagnostic comme en recherche. Au cours de ces travaux, je propose des méthodes originales améliorant de façon significative différentes étapes de ces techniques. Premièrement, je propose une amélioration de la standardisation de l'étape de transcription inverse capable de diminuer de façon significative la variabilité inter-échantillons ; l'utilisation d'un volume constant d'extrait d'ARN pour chaque échantillon améliore considérablement la précision de la quantification d'ARN messagers. Deuxièmement, je propose une modification des amorces par incorporation de résidus d'acides nucléiques bloqués (LNA) ; cette modification permet d'augmenter la spécificité des amorces aux limites de la détection. Enfin, je propose une méthode simple et économique permettant la mesure directe de la température de fusion (Tm) dans les conditions réelles de la PCR. Ce paramètre, considéré comme capital pour la réalisation des dosages par qPCR, est généralement obtenu par des méthodes prédictives peu précises. De plus, cette méthode doit permettre de déterminer précisément les paramètres thermodynamiques des amorces (∆G, ∆H et ∆S) et ainsi avoir accès d'une part au pourcentage réel d'amorces hybridées en fonction de la température et d'autre part d'identifier la susceptibilité des amorces aux inhibiteurs.

UPF1 (Up-Frameshift 1) est une hélicase multifonctionnelle conservée chez tous les eucaryotes. Elle est essentielle à la voie de surveillance du NMD (Nonsense Mediated mRNA Decay), qui dégrade des ARNm portant un codon stop prématuré. UPF1 est l’archétype d’une famille d’hélicases qui partagent des corps similaires mais sont impliquées dans des voies cellulaires variées. Cependant, les relations structure-fonction et les caractéristiques biophysiques intrinsèques de ces moteurs moléculaires restent à ce jour peu connues. In vitro, le coeur hélicase d’UPF1 est hautement processif, il traverse des milliers de bases sur l’ARN ou l’ADN et déroule des doubles brins. Dans ce travail, nous avons cherché les facteurs clés régissant cette remarquable processivité en combinant des techniques de biochimie et de biophysique. En particulier, nous avons utilisé des pinces magnétiques pour étudier en temps réel des hélicases à l’échelle de la molécule unique. Contrairement à UPF1, l’hélicase IGHMBP2 de la famille UPF1-like n’est pas processive ; la processivité n’est donc pas un trait conservé au sein de la famille. Grâce à une étude fine de la structure 3D des deux hélicases, nous avons conçu divers mutants que nous avons utilisés pour identifier les éléments structuraux qui modulent la processivité. Notre approche révèle qu’UPF1 a une prise très ferme sur les acides nucléiques, garantissant de longs temps de résidence et d’action qui dictent sa haute processivité. Grâce à la variété de comportements des mutants, nous avons construit un modèle mécanistique expliquant le lien entre énergie d’interaction et processivité. Nous démontrons aussi que la processivité d’UPF1 est requise pour un processus de NMD efficace in vivo. Nous avons utilisé les mêmes outils biochimiques et biophysiques pour étudier une isoforme naturelle d’UPF1 humaine se déplaçant plus vite que l’isoforme majeure, et pour comparer la régulation d’UPF1 humaine et de levure par leurs domaines flanquants. Nous avons également caractérisé l'interaction d’UPF1 de levure avec de nouveaux partenaires. Nos travaux montrent comment la combinaison d'outils biochimiques, biophysiques, structuraux etin vivo offre des aperçus inattendus quant au mode de fonctionnement des moteurs moléculaires. / UPF1 (Up-Frameshift 1) is a multifunctional helicase that unwinds nucleic acids and is conserved throughout the eukaryote kingdom. UPF1 is required for the Nonsense Mediated mRNA Decay (NMD) surveillance pathway, which degrades mRNAs carrying premature termination codons, among other substrates. UPF1 is the archetype of a family of 11 helicases sharing similar cores but involved in various cellular pathways. However, the structure-function relationship and intrinsic biophysical properties of these molecular engines remain poorly described. In vitro, the UPF1 helicase core is highly processive, it travels along thousands of RNA or DNA bases and unwinds double-strands. In this work, we looked for key factors governing this remarkable processivity. We combined biochemical and biophysical techniques. In particular, we used magnetic tweezers to study helicases in real time at a single molecule scale. In contrast to UPF1, the related IGHMBP2 is not processive, thus processivity is not a shared family trait. Based on the 3D structures of both proteins, we designed various mutants and used them to identify structural elements that modulate processivity. Our approach reveals that UPF1 has a very firm grip on nucleic acids, guaranteeing long binding lifetimes and action times that dictate its high processivity. Thanks to the variety in mutant behaviors, we built a novel mechanistic model linking binding energy to processivity. Furthermore, we show that UPF1 processivity is required for an efficient NMD in vivo. In addition, we used the same biochemical and biophysical tools to investigate a natural human UPF1 isoform moving faster than the major isoform, and to compare the regulation of human andyeast UPF1 by their flanking domains. We also characterized the interaction of yeast UPF1 with new NMD partners. Our work shows how a combination of biochemical, biophysical, structural and in vivo tools can offer unexpected insights into the operating mode of molecular motors.

Mimer les processus biologiques par des méthodes s'affranchissant de la nécessité d'activation enzymatique est un défi pour la communauté des chimistes. Parmi ces processus nous nous sommes intéressés à la ligation et la polymérisation d'acides nucléiques. Les procédés chimiques existants nécessitent généralement l'emploi d'un activateur et conduisent en majorité à des jonctions internucléosidiques irréversibles, incompatibles avec les systèmes vivants. Pour réaliser la ligation et la polymérisation réversibles d'ADN en l'absence d'activation chimique ou enzymatique, nous avons utilisé des oligonucléotides modifiés par une fonction acide boronique qui a la propriété de se lier de manière covalente et réversible avec des fonctions cis 1,2 diol.Un analogue de la thymidine fonctionnalisé par un acide boronique a ainsi été synthétisé et incorporé à l'extrémité 5' d'un oligonucléotide. En présence d'une matrice et d'un partenaire 3' diol, une jonction boronate peut alors être obtenue. L'influence de la nature des fonctions à l'extrémité 3' du partenaire a été étudiée afin de déterminer les paramètres gouvernant la ligation et a notamment conduit à la formation d'une jonction oxazaborolidine en présence d'un partenaire aminoalcool. Par ailleurs, cette méthodologie a été appliquée à des processus visant à mimer la polymérisation par la formation de multiples jonctions boronates entre des oligonucléotides bifonctionnalisés par un acide boronique et un diol. Enfin l'auto polymérisation d'un duplexe en l'absence de matrice a été évaluée. / Mimicry of biological processes by non enzymatic ways is a challenge for chemists. Among those processes, we have been focusing on the ligation and polymerization of nucleic acids. Reported chemical methods usually require an activator and lead mostly to irreversible internucleosidic linkage which are incompatible with living systems. To perform DNA ligation and polymerization under enzyme free and activator free conditions, we used modified oligonucleotides bearing a boronic acid function able to bind covalently and reversibly cis 1,2 diols.Thus, a thymidine analog functionalized by a boronic acid was synthesized and introduced at the 5' end of an oligonucleotide. In the presence of a template and a 3 end diol partner, a boronate junction can be obtained. Influence of the nature of functions at the 3' end of the partner have been studied to indentify the parameters governing the ligation and allowed the formation of an internucleosidic oxazaborolidine linkage with an aminoalcohol partner. In addition, this methodology has been applied to polymerization mimicking processes by the formation of multiple boronate junctions between bifunctionnal oligonucleotides bearing a boronic acid and a diol. Finally we evaluated the auto polymerization of a duplex in the absence of template.

La qPCR est actuellement la technique de référence en matière de quantification d'ADN. Elle peut être définie comme une amplification exponentielle, cyclique et ciblée de la séquence d'ADN cible. Le caractère exponentiel de la qPCR est à la fois à l'origine de la sensibilité de la méthode mais aussi d'une potentielle variabilité inter-échantillons. Cette variabilité est compensée par le caractère cyclique de la méthode qui entraine une synchronisation de la réaction pour tous les échantillons à chaque cycle. L'amplification ciblée de la séquence choisie traduit quand à elle la spécificité de la méthode. Néanmoins, cette dernière propriété de la PCR reste la moins vérifiée. La spécificité de la qPCR est indiscutable lorsque la cible à détecter se trouve en quantité suffisante (>100 copies environ). En revanche, pour des quantités plus faibles ou en présence d'inhibiteurs, la spécificité diminue ou disparaît (limites de détection et de quantification). Cette perte de spécificité retentit de façon significative sur la précision et la reproductibilité du dosage à réaliser. Cependant, si l'hybridation non spécifique est inéluctable dans ces conditions, l'amplification non spécifique consécutive peut être limitée, voire supprimée au moyen d'amorces de PCR soit plus spécifiques, soit moins susceptibles de générer des différences inter-échantillons. La RT-qPCR, grâce à une étape initiale de transcription inverse (conversion d'un ARN en un ADN complémentaire) permet la quantification des ARN. Cependant, la transcription inverse reste moins reproductible que la PCR, générant des différences inter-échantillons délétères en diagnostic comme en recherche. Au cours de ces travaux, je propose des méthodes originales améliorant de façon significative différentes étapes de ces techniques. Premièrement, je propose une amélioration de la standardisation de l'étape de transcription inverse capable de diminuer de façon significative la variabilité inter-échantillons ; l'utilisation d'un volume constant d'extrait d'ARN pour chaque échantillon améliore considérablement la précision de la quantification d'ARN messagers. Deuxièmement, je propose une modification des amorces par incorporation de résidus d'acides nucléiques bloqués (LNA) ; cette modification permet d'augmenter la spécificité des amorces aux limites de la détection. Enfin, je propose une méthode simple et économique permettant la mesure directe de la température de fusion (Tm) dans les conditions réelles de la PCR. Ce paramètre, considéré comme capital pour la réalisation des dosages par qPCR, est généralement obtenu par des méthodes prédictives peu précises. De plus, cette méthode doit permettre de déterminer précisément les paramètres thermodynamiques des amorces (∆G, ∆H et ∆S) et ainsi avoir accès d'une part au pourcentage réel d'amorces hybridées en fonction de la température et d'autre part d'identifier la susceptibilité des amorces aux inhibiteurs. / QPCR is currently the gold standard for DNA quantification of DNA. It can be defined as an exponential, cyclic and targeted amplification of a known DNA sequence. The exponential character of qPCR is both the cause of the sensitivity of the method but also a potential variability between samples. This variability is offset by the cyclical nature of the method that causes a synchronization of the reaction for all samples in each cycle. The targeted amplification of the selected sequence translates the specificity of the method. Nevertheless, this last property of PCR remains the least tested. The specificity of qPCR is unquestionable when the target to detect is sufficient (> 100 copies). However, for smaller quantities or in the presence of inhibitors, the specificity decreases or disappears (limits of detection and quantification). This loss of specificity will have a significant effect upon the accuracy and reproducibility of the assay to be performed. However, if non-specific hybridizations are unavoidable in these conditions, consecutive nonspecific amplification may be limited or eliminated using more specific PCR primers or less likely to produce inter-sample differences. RT-qPCR allows RNA quantification because of an initial step of reverse transcription (conversion of an RNA into a complementary DNA). However, reverse transcription is less reproducible than PCR, generating harmful inter-sample differences both in diagnosis and in the research field. In this work, I propose innovative methods improving significantly different steps of these techniques. First, I propose an improved standardization of the reverse transcription step that can significantly reduce the variability between samples; using a constant volume of RNA extract for each sample substantially improves mRNA quantification accuracy. Second, I propose a primers modification by incorporating Locked Nucleic Acid residues (LNA); this modification increases the specificity of the primers to the limits of detection. Finally, I propose a simple and economical method for direct measurement of the melting temperature (Tm) in real PCR conditions. This essential parameter in the achievement of qPCR assays is generally obtained by predictive methods with low accuracy. Furthermore, this method should determine the thermodynamic parameters of the oligonucleotide sequence (∆G, ∆H and ∆S), on the one hand allowing access to the actual percentage of annealed primers according to the temperature and on the other hand, to identify the primers susceptibility in the presence of inhibitors.