Thesis (Ph. D.)--University of Wisconsin--Madison, 1966. / Typescript. Vita. eContent provider-neutral record in process. Description based on print version record. Includes bibliographical references.

Thesis (Ph. D.)--University of Wisconsin--Madison, 1975. / Typescript. Vita. Description based on print version record. Includes bibliographical references.

Thesis (M.S.)--University of Wisconsin--Madison, 1968. / eContent provider-neutral record in process. Description based on print version record. Includes bibliographical references.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:10:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Wesley de Almeida Brito.pdf: 6161747 bytes, checksum: 6249a08f73180f831c2df168246efa67 (MD5) Previous issue date: 2009-11-18 / Paracoccidioides brasiliensis is a thermal-dimorphic fungus, the causative agent of Paracoccidioidomycosis (PCM), an important endemic mycosis in Latin America. A protein species preferentially expressed in yeast cells with a molecular mass of 80kDa and isoeletric point (pI) of 7.79 was isolated from the proteome of P. brasiliensis and characterized as an aconitase (E.C. 4.2.1.3). Aconitase is an enzyme that catalyzes the isomerization of citrate to isocitrate in both the Krebs cycle (KC) and the glyoxylate cycle (GC). We report the cloning and characterization of the cDNA encoding the aconitase of P. brasiliensis (PbACO). The cDNA showed a 2337 bp open reading frame (ORF) and encoded a predicted protein with 779 amino acids. A polyclonal antibody against the purified recombinant PbACO was obtained in order to analyze the subcellular localization of the molecule in P. brasiliensis. The protein is present in the extracellular fluid, cell wall, mitochondria, cytosol and peroxisomes of yeast cells as demonstrated by western blot and immunocytochemistry analysis. The expression analysis of the Pbaco gene was performed through quantitative real time RT-PCR and results demonstrated increasing expression during differentiation from mycelium to yeast cells. Real time RT-PCR assays was also used to evaluate the Pbaco expression when the fungus grows on media with acetate and ethanol as sole carbon sources and in different iron levels. The results demonstrated that Pbaco transcript is over expressed in acetate and ethanol as sole carbon sources and in highiron conditions. / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termodimórfico, agente causador de uma importante micose sistêmica na América Latina, a paracoccidioidomicose (PCM). Uma proteína apresentando massa molecular de 80kDa e ponto isoelétrico (pI) de 7,79, preferencialmente expressa em células leveduriformes, foi isolada do proteoma de P. brasiliensis e caracterizada como uma aconitase (EC 4.2.1.3). Aconitase é uma enzima que catalisa a isomerização do citrato em isocitrato tanto no ciclo de Krebs (CK) quanto no ciclo glioxalato (CG). No presente estudo reportamos a clonagem e caracterização do cDNA da aconitase de P. brasiliensis (PbACO). O cDNA apresentou um quadro aberto de leitura (ORF) com 2337 pares de bases, codificando uma predita proteína com 779 resíduos de aminoácidos. Objetivando a localização da aconitase de P. brasiliensis foi produzida e purificada uma proteína recombinante a qual foi utilizada para a produção de um anticorpo policlonal anti-PbACO. A proteína foi localizada no fluído extracelular, parede celular, mitocôndria, citosol e nos peroxissomos de células leveduriformes, como demonstrado por ensaios de Western blotting e por imunocitoquímica. A análise da expressão do gene Pbaco foi realizada através RT-PCR em tempo real e os resultados demonstraram um aumento da expressão durante a diferenciação celular de micélio para levedura. A expressão Pbaco também foi avaliada quando o fungo é cultivado em meios de cultura contendo acetato e etanol como única fonte de carbono bem como em diferentes concentrações de ferro. Os resultados demonstraram que o transcrito de Pbaco é mais expresso em acetato e etanol como única fonte de carbono e em altas concentrações de ferro.

L’avancement des connaissances sur la biologie de l’ARN progresse à un rythme effréné. En effet, les découvertes des dernières années ont confirmé l’importance de l’ARN comme régulateur. Par exemple, de courtes molécules d’ARN, appelées sRNA (small RNA), ont été identifiées comme régulateurs post-transcriptionnels majeurs, capables de moduler l’expression des ARN messagers (ARNm) chez les procaryotes. Généralement, le mode d’action de ces sRNA consiste à s’attacher de manière anti-sens à leurs ARNm cibles, au site de la liaison du ribosome située dans la région 5′ non traduite de l’ARNm. L’inhibition de la traduction par le sRNA conduit, dans la majorité des cas, à la dégradation rapide de l’ARNm. Dans le cadre de mes travaux de recherche, j’ai participé à modéliser, à partir de données biologiques, certains mécanismes de régulation de cibles ARNm. Plus précisément, deux des sRNA, parmi les mieux caractérisés chez E. coli, soient RyhB et Spot42, ont été analysés. Cette étude a montré qu’un sRNA peut réguler ses cibles selon différents régimes (efficace ou modéré) en fonction du mode de régulation priorisé par le sRNA, et ce, indépendamment de son abondance relative. Ces résultats permettront d’améliorer notre compréhension et notre capacité à prédire l’efficacité d’un sRNA à réguler ses cibles ARNm. Par des recherches subséquentes, il m’a été possible de démontrer que l'expression de l’ARNm encodant pour la protéine aconitase B était régulée de manière antagoniste à la fois par le sRNA RyhB et par la protéine aconitase B et ce, dans une condition de carence en fer. Par la suite, j’ai pu mettre en évidence un deuxième mécanisme de régulation similaire pour l’ARNm grxD, encodant pour la glutharédoxine D. Jusqu'à ce jour, le sRNA RyhB démontrait une efficacité infaillible pour dégrader ses ARNm cibles. Les résultats obtenus durant ce projet démontrent sans équivoque une nouvelle voie de protection permettant à l’ARNm d'éviter la dégradation par un petit ARN régulateur. Ce mécanisme de protection de l'ARNm ouvre la porte à un tout nouveau processus cellulaire de régulation post-transcriptionnelle qui s'étend sûrement à un groupe plus important d’ARN.

Chez les mammifères, deux protéines cytosoliques régulatrices du fer, IRP1 et IRP2 (Iron Regulatory Proteins), sont impliqué dans le métabolisme de ce métal biologiquement essentiel. Ces protéines peuvent fixer des régions spécifiques d'ARNm, appelée Iron Responsive Elements, et ainsi contrôler l'expression des protéines impliquées dans l'importation, le stockage et l'utilisation du fer. IRP1 peut perdre sa capacité de fixer l'ARN en acquièrent un agrégat [4Fe-4S] lui conférant une activité d'aconitase cytosolique catalysant la conversion du citrate en isocitrate. Le rôle physiologique exact d'IRP1 n'est pas encore complètement clair mais des indications laissent à penser qu'elle serait impliquée dans la réponse au stress oxydant.<br />L'IRP1 humaine a une masse moléculaire de 98 kDa. La forme contenant un agrégat [4Fe-4S] a été cristallisée dans des conditions anaérobiques et un jeu de donnée allant jusqu'à 1,85 Å a été collecté. Un remplacement moléculaire a été tenté afin de résoudre la structure de la protéine à partir de la structure de l'aconitase mitochondriale de bœuf qui présente 22% d'identité de séquence avec IRP1 mais sans succès. Par la suite, une seconde forme cristalline diffractant à 2,5 Å de résolution a été obtenue. Le signal anomal de l'agrégat fer-soufre ainsi que celui d'un site zinc inattendu dans l'enzyme native ont été utilisés en plus des données isomorphes d'un dérivés or pour résoudre le problème de la phase. La structure a été affinée et analysée en respectant la fonction aconitase et celle de fixation d'ARN de la protéine et ce en utilisant les résultats des différentes études de mutagenèse dirigée disponibles dans la littérature.

Iron Regulatory Protein 1 (IRP1) est une protéine cytosolique dont le rôle est de réguler la concentration de fer intracellulaire chez les métazoaires par un mécanisme post-transcriptionnel. Elle interagit avec certains ARN messagers au niveau de motifs spécifiques appelés IRE (Iron Responsive Element) situés dans leurs régions non traduites et modifie la synthèse des protéines correspondantes. En présence de fer, IRP1 perd cette capacité de fixation, intègre un agrégat [4Fe-4S] et acquiert une activité aconitase. La régulation s'effectue donc par un processus d'assemblage et de désassemblage du centre fer-soufre.<br />La réactivité de la protéine recombinante IRP1 humaine, purifiée sous sa forme aconitase [4Fe-4S], a été étudiée vis à vis d'autres effecteurs que le fer capables de modifier l'activité des IRP. Ainsi des excès assez modestes de diverses espèces réactives de l'oxygène ne peuvent former que l'espèce [3Fe-4S] de la protéine. La doxorubicine, un composé cytostatique utilisé comme anti-cancéreux, a une action sur IRP1, mais elle dépend des conditions d'application et implique certainement des mécanismes multiples. In vitro, IRP1 est complètement activée pour la fixation d'ARN par un fort excès de 2-mercaptoéthanol. Parmi les diverses causes possibles de cet effet, les propriétés de solvant de ce produit (comme de l'éthanol) en sont responsables.<br />La recherche d'éventuels partenaires physiologiques de la protéine IRP1 a été entreprise par une étude double hybride chez la levure Saccharomyces cerevisiae, mais les constructions utilisées n'ont pas permis de déterminer de candidats potentiels. L'utilisation d'autres constructions ainsi que d'autres systèmes double hybride est envisagée pour la poursuite de cette étude.<br />Une nouvelle méthode de dosage de l'activité de fixation au motif IRE a été envisagée par l'utilisation d'un substrat fluorescent et de l'électrophorèse capillaire. Les résultats préliminaires obtenus n'ont pas encore abouti, mais ils contribuent à donner des orientations pour le développement de cette méthode présentant de nombreux avantages.<br />Des changements de conformation entre les deux formes actives de IRP1 ont été analysés par deux méthodes structurales en solution. La formation de certains éléments de structure secondaire d'IRP1 dépend de l'état d'activité de la protéine et ils sont sensibles à la fixation des substrats. Les propriétés hydrodynamiques d'IRP1 varient aussi lors de ces différents changements. Faute de structure à haute résolution, ces informations permettent toutefois de se représenter le comportement structural d'IRP1 dans son rôle de régulateur.