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Caractérisation de deux récepteurs du fer d'Actinobacillus pleuropneumoniae (FhuA et HgbA) ainsi que leur utilisation dans un vaccin sous-unitaireShakarji, Lara January 2005 (has links)
Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.
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Role of HIR2 protein and plasma membrane microdomains in the control of iron acquisition machinery in plants / Rôle de la protéine HIR2 et des microdomaines de la membrane plasmique dans le contrôle de la machinerie d’acquisition du fer chez les plantesMartín-Barranco, Amanda 18 June 2019 (has links)
Le fer est essentiel à la croissance et au développement des plantes. Chez Arabidopsis thaliana, le transporteur IRT1 permet l’absorption du fer par les cellules épidermiques de la racine et est, par conséquent, un des acteurs majeurs de la nutrition en fer. IRT1 est cependant un transporteur peu spécifique qui transporte également des métaux non ferreux que sont le zinc (Zn), le manganèse (Mn) et le cobalt, qui constituent les substrats secondaires d’IRT1 et qui ont été récemment démontrés dans notre laboratoire comme régulant l’endocytose d’IRT1. Afin d’identifier des protéines potentiellement impliquées dans le trafic ou dans la régulation de l’activité d’IRT1, nous avons isolé des interactants de ce transporteur via des immunopurifications d’IRT1 combinées à des analyses de spectrométrie de masse. Cette approche nous a permis d’établir le premier intéractome d’IRT1. Parmi les protéines interagissant avec IRT1, nous avons isolé AHA2 et FRO2 qui participent toutes les deux au processus d’absorption du fer chez Arabidopsis, ainsi que la protéine à domaine SPFH appelée HIR2. HIR2 est localisée dans des microdomaines membranaires chez Arabidopsis mais sa fonction reste jusqu’à présent assez énigmatique. Cependant, chez les animaux, les protéines à domaine SPFH ont été proposées comme étant impliquées dans la formation des microdomaines membranaires; de plus certaines protéines à domaines SPFH appelées Flotillines interviennent dans des mécanismes d’endocytose chez les animaux et les plantes. Après avoir validé les interactions entre les protéines IRT1 et FRO2/AHA2/HIR2 par des approches complémentaires, nous avons analysé la dynamique intracellulaire de ces protéines par microscopie. Nos résultats suggèrent l’existence d’un complexe protéique regroupant les trois acteurs majeurs de l’homéostasie du fer chez Arabidopsis : IRT1, FRO2 et AHA2, dont la fonction pourrait être d’optimiser l’absorption du fer dans la racine. Contrairement à ce qui est observé pour IRT1, les protéines FRO2 et AHA2 ne sont pas massivement endocytées en réponse à un excès de métaux (Zn,Mn, Co) et ceci bien qu’elles puissent être présentes au sein d’un complexe contenant IRT1. Nous avons en outre montré que FRO2 et AHA2 étaient ubiquitinées, mais contrairement à IRT1, de façon indépendante de la concentration en métaux non ferreux. En utilisant des approches de génétique inverse, nous avons mis en évidence que HIR2 était impliquée dans le maintien de l’homéostasie du fer, les mutants hir2 étant extrêmement sensibles à la carence en fer. D’autre part nous avons montré que l’accumulation de la protéine IRT1 était dérégulée chez le mutant hir2 et ceci de façon post-transcriptionnelle. Nous cherchons actuellement à déterminer comment HIR2 régule la dynamique et/ou la stabilité d’IRT1 dans la cellule. HIR2 pourrait assurer le recrutement d’IRT1 et plus généralement du complexe d’acquisition du fer décrit ci-dessus dans des microdomaines membranaires spécifiques. D’autre part, nous avons également émis l’hypothèse que HIR2 pourrait être impliquée dans une voie d’endocytose d’IRT1 indépendante de la clathrine. / Iron is an essential nutrient for plant growth and development. In Arabidopsis thaliana, the transporter IRT1, which allows iron absorption through the epidermic cells of the root, is a major actor in iron nutrition. Despite of it, IRT1 also transports the non-iron metals zinc (Zn), manganese (Mn) and cobalt (Co). These metals are considered as the secondary substrates of IRT1, and therefore this transporter is considered as poorly specific. Our laboratory has recently uncover that these secondary substrates regulate IRT1 endocytosis. In order to uncover the different proteins that can be implicated in the traffic or in the regulation of IRT1 activity, we have proceeded to perform IRT1 immnopurifications, followed by mass spectrometry analyses. This approach has allowed us to produce a first interactome list of IRT1. Among the proteins that interact with IRT1, we have isolated AHA2 and FRO2, both well known in the process of iron acquisition in Arabidopsis, and also a SPFH domain containing protein known as HIR2. Although it is known that HIR2 is contained in membrane microdomains in Arabidopsis, its function is still to be determined. Nevertheless, in the animal kingdom, SPFH domain containing proteins have been proposed as implicated in the formation of membrane microdomains. This is specially the case of the specific SPFH domain containing proteins known as Flotillins, which have the ability to mediate endocytosis in animals as in plants. After validation of the interaction between IRT1 and FRO2/AHA2/HIR2 by different complementary approaches, we have microscopically analyzed the intracellular dynamics of these proteins. Our results suggest the existence of a protein complex that reunites the three major actors of iron homeostasis in Arabidopsis: IRT1, FRO2 and AHA2. We suspect that the main function of this complex is to optimize the process of iron absorption in the root. In spite of what is known for IRT1 and despite being part of a same complex, FRO2 and AHA2 are not massively endocytosed in response to a non-iron metal excess (Zn, Mn, Co). Furthermore, we have shown that FRO2 and AHA2 are ubiquitinated, although their ubiquitination is also independent of the concentration of the non-iron metals, unlike the ubiquitination of IRT1. Finally, using reverse genetic approaches, we have been able to show that HIR2 is implicated in the maintenance of the iron homeostasis. Indeed, hir2 mutants are extremely sensitive to lack of Fe, even though they present posttranslational deregulations that result in the an overaccumulation of the protein IRT1. We are currently trying to determine how HIR2 regulates the dynamics and/or the stability of IRT1 inside the cell. HIR2 could be assuring the recruiting of IRT1 (or the recruitment of the whole iron acquisition complex) into specific membrane microdomains. On the other hand, HIR2 could be implicated in a new pathway of internalization of IRT1, independent of clathrin.
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Identification de nouveaux facteurs hôtes-dépendants chez Bacillus cereus Caractérisation moléculaire et fonctionnelle d'IlsA, une protéine de surface essentielle pour l'acquisition du fer au cours de l'infectionDaou, Nadine 07 November 2008 (has links) (PDF)
Bacillus cereus est fréquemment associé à des toxi-infections alimentaires et peut être responsable de pathologies opportunistes sévères. Les facteurs d'adaptations de B. cereus chez l'hôte, liés à son pouvoir pathogène, sont encore inconnus. La capacité d'acquérir le fer lors d'une infection, est une importante réponse adaptative des bactéries, leur permettant de surmonter le manque de fer imposé par l'hôte. Nos travaux ont permis l'identification de nouveaux facteurs impliqués dans l'adaptation de B. cereus chez l'hôte, ainsi que la caractérisation d'une nouvelle protéine IlsA (Iron regulated leucine-rich surface protein) fortement exprimée in vivo. L'identification de ces facteurs a été réalisée à l'aide du système IVET (In Vivo Expression Technology), adapté à la souche B. cereus ATCC 14579 et analysé après infection chez la larve du lépidoptère Galleria mellonella. Ce système permet la détection des promoteurs activés de façon transitoire. L'analyse de la structure protéique d'IlsA, montre quatre domaines conservés: un peptide signal d'export N-terminal, un domaine NEAT potentiellement impliqué dans le transport du fer, suivi d'une région riche en leucine (LRR) susceptible d'interagir avec les protéines de l'hôte, et un domaine SLH de liaison à la surface bactérienne. La présence d'une boîte fur dans la région promotrice d'ilsA suggère une régulation dépendante du fer. Les analyses transcriptionnelles ont montré qu'ilsA est en effet, exprimé dans les conditions de carence en fer in vitro et in vivo. De plus, nous avons démontré qu'IlsA est localisée à la surface et qu'elle est nécessaire pour l'acquisition de fer à partir des protéines présentes chez l'hôte : l'hémoglobine, l'hème et la ferritine, et ceci en se liant directement avec elles. En outre, l'étude de la séquence protéique du domaine NEAT d'IlsA, suggère qu'il serait responsable de l'interaction avec l'hème. Par ailleurs, nous avons montré que l'inactivation d'ilsA affecte la survie et la virulence de B. cereus chez l'insecte, et chez les macrophages murins. Nos résultats indiquent qu'IlsA est un facteur d'adaptation essentiel pour l'acquisition de fer au cours de l'infection, contribuant à la pathogénie de B. cereus chez les invertébrés et vertébrés.
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Epidémie clonale d'infections invasives à méningocoque de groupe B en Normandie : caractérisation d'un facteur de virulence - HmbR, système d'acquisition du fer via l'hémoglobine - et analyse de la protection conférée par un vaccin à base de vésicules de membrane externe / Clonal epidemic of group B meningococcal disease in Normandy : characterisation of a virulence factor – HmbR, the hemoglobin receptor allowing iron acquisition – and analysis of the protection conferred by an outer membrane vesicle vaccineSevestre, Julien 22 June 2018 (has links)
Ce travail de thèse comporte deux volets ayant pour trait commun l’analyse a posteriori d’une épidémie d’infection invasive à méningocoque (IIM) survenue en Normandie entre 2003 et 2012 et liée à l’expansion d’un clone hypervirulent particulier (B:14:P1.7,16/ST-32 ). Le premier travail (publié dans Virulence : Sevestre et al 2018 ;9 :923-929) s’est focalisé sur les déterminants de la virulence de « B14 » en comparant 6 isolats identifiés les uns d’IIM, les autres de portage pharyngé sain (ces derniers exprimant ou non la capsule). Apparemment identiques selon le typage classique (immunotypage et génotypage par MLST), ces 3 groupes bactériens se sont révélés distincts après analyse génomique et comparaison gène par gène (plus de 600 gènes au profil génétique variable entre les groupes) conduisant à identifier le rôle majeur de l’acquisition du fer dans la virulence et en particulier celui du système HmbR, un récepteur de l’hémoglobine. Dans un modèle murin (souris transgéniques rendues sensibles à l’infection humaine) les 3 groupes de souches sont aussi apparus distincts, avec une hiérarchie des marqueurs d’infectiosité (titres bactériens, taux de cytokines). La restauration du système HmbR (souches de portage capsulées « Off » dérivées en « On ») a restauré le pouvoir invasif in vitro et chez l’animal. Si le fer était déjà connu comme facteur de virulence pour différentes espèces bactériennes, l’originalité ici est d’avoir identifié le rôle de la variation de phase du gène hmbR au sein d’un même clone épidémique, permettant l’adaptation au portage, condition sine qua non de la transmission d’individu en individu. Le second travail (publié dans Vaccine : Sevestre et al 2017 ;35 :4029-4033) s’est intéressé à la durabilité et à l’ampleur de la protection vaccinale du MenBvac®, vaccin à base de vésicules de membranes externes (Outer Membrane Vesicles, OMV) utilisé jadis pour contrôler l’épidémie. Ceci a pu être réalisé grâce à deux cohortes d’enfants vaccinés par un schéma à 4 doses et prélevés pour les uns 1 an après la dernière dose et pour les autres 4 an après. L’immunogénicité (étude de l’activité bactéricide du sérum vis-à-vis du clone ciblé) s’est avérée de durabilité moyenne avec 48% des enfants protégés à 1 an et 31% à 4 ans, un résultat en phase avec les données de la littérature sur les vaccins OMV. Un effet bactéricide fut observé très au-delà de « B14 », du fait d’une immunité croisée aux souches avec une homologie au moins partielle de la porine PorA (principal déterminant antigénique des vaccins OMV) soit pour le MenBvac® 15% des clones virulents B actuellement circulants en France, un résultat davantage original car ayant jusqu’alors que peu investigué. / This thesis work includes two studies which both contribute to analyze a posteriori an outbreak of invasive meningococcal diseases (IMD) that had occurred in Normandy from 2003 to 2012 due to the expansion of a single hypervirulent clone (B:14:P1.7,16/ST-32 ). The first work (published in Virulence: Sevestre et al 2018 ;9 :923-929) focused on the virulence determinants of “B14” by comparing 6 isolates, either from IMD or from asymptomatic carriage (these latter expressing or not the capsule). Apparently identical on the basis of classical typing methods (immunotyping and MLST genotyping), these 3 groups of isolates were markedly different by whole genome analysis and on gene by gene comparison (more than 600 genes presenting a variable genetic profile). This analysis leaded to identify the crucial implication of iron acquisition in virulence and in particular the place of the HmbR system, an hemoglobin receptor. In a murine model (transgenic mice made susceptible to infection), these 3 groups also appeared separated, with a distinct infectivity hierarchy (bacterial counts, levels of cytokines). The restoration of the HmbR system in the capsulated carriage isolates (switch from Off phase to On phase) also restored their invasiveness in vitro and in vivo. Even if iron is already known to be a determining factor in the virulence of many bacterial species, our results clearly indicate the importance of the hmbR phase variation among clonal epidemic isolates, allowing adaptation to carriage, sine qua non condition for people to people transmission. The second work (published in Vaccine: Sevestre et al 2017 ;35 :4029-4033) concerned the durability and the cross-protection of the MenBvac®, an OMV vaccine (Outer Membrane Vesicles), used in the past to control the outbreak. This work has been done thanks to 2 cohorts of children vaccinated with 4 doses and sampled either 1 year or 4 years after the last dose. The efficacy (serum bactericidal activity against the epidemic strain) was short lasting, with 48% of children protected after 1 year and 31% after 4 years, a result in accordance with OMV literature. A bactericidal effect was observed far beyond “B14”, by cross-immunity with strains harboring homologies, even partials of the porin PorA (main antigenic determinant in OMV vaccine), indicating a coverage for 15% of virulent isolates B circulating in France, an original result as until then not so far investigated.
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