<i>Actinobacillus pleuropneumoniae</i> is the etiological agent of contagious swine pleuropneumonia, an economically important disease of the swine industry worldwide. Improved control of this disease requires enhanced understanding of the factors contributing to pathogenesis. The objectives of this study were to investigate the immune response and virulence properties of the 110-kilodalton (110-KDa) hemolysins [hemolysin I (HlyI) and hemolysin II (HlyII)] of <i>A. pleuropneumoniae</i>. Several monoclonal antibodies (MAb) to the hemolysins were developed. An IgGl. MAb (8C2) specific for HlyII, as determined by immunoblotting, was cross-linked to Protein A-Sepharose, and HlyII was purified from serotypes 1 and 5 by immunoaffinity chromatography. An indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using MAb 8C2, or affinitypurified rabbit IgG to both hemolysins, was developed for detection of swine antibody to one or both hemolysins, respectively. In comparison with the complement fixation test, the ELISA was highly sensitive and specific, and was able to identify animals infected with or exposed to most, if not all, serotypes of <i>A. pleuropneumoniae</i>. Several nonhemolytic mutants of <i>A. pleuropneumoniae</i> serotype 5 were isolated following electroporation of the parent with an hemolysin gene whose open-reading-frame was disrupted with a kanamycin resistance gene. One mutant was characterized for phenotypic and pathogenic properties. Biochemical profiles, growth rate, capsule content, and lipopolysaccharide and whole cell protein electrophoretic profiles of the parent and one of the mutants were similar. The nonhemolytic mutant lacked both HlyI and HlyII proteins in culture supernatant and in whole cell lysates as determined by immunoblot analysis; extracellular and intracellular hemolytic and cytotoxic activity was also absent. The mutant was avirulent in mice and pigs at doses greater than 10 times the lethal dose of the parent. Unlike the parent, the nonhemolytic mutant failed to confer protection against lethal challenge in mice following immunization. Thus, one or both hemolysins are essential for virulence and immunoprotection in <i>A. pleuropneumoniae</i> serotype 5. / Ph. D.

Actinobacillus pleuropneumoniae est un bacille Gram-négatif de la famille des Pasteurellaceae. A. pleuropneumoniae est l'agent étiologique de la pleuropneumonie porcine, une maladie hautement contagieuse et endémique qui cause encore à ce jour d’énormes pertes économiques dans le monde de l’industrie porcine. La pathogenèsedes infections à A. pleuropneumoniae implique plusieurs facteurs de virulence de la bactérie dont les principaux sont les lipopolysaccharides (LPS) et la capsule polysaccharidique (CPS). Ces derniers sont impliqués dans l'adhérence d’A. pleuropneumoniae. Très récemment, il a été démontré qu’A. pleuropneumoniae était capable de produire, sous certaines conditions un biofilm riche en poly- N-acétyl-D-glucosamine (PGA). Cependant, le rôle de cette structure dans la pathogenèse ainsi que les facteurs intervenant dans sa formation et ses signaux déclencheurs sont peu connus à ce jour. Dans cette étude, nous avons démontré que l’antigène O du LPS joue un rôle important dans la formation d’un biofilm mature par A. pleuropneumoniae que ce soit dans un modèle statique ou dans un modèle dynamique en flux, le «drip flow reactor», plus représentatif de l’environnement pulmonaire. Alors que l’absence de la capsule ou du noyau oligosaccharidique du LPS ne semble pas affecter la formation du biofilm, le défaut de formation du biofilm chez le mutant antigène O semble être lié à un problème de production de PGA. En effet, des tests d’immunodétection du PGA associé aux bactéries, à l’aide d’anticorps spécifiques, et les études d’expression du PGA démontrent que le mutant antigène O produit moins de polysaccharide. De plus, les gènes codant pour le système de stress exocytoplasmique CpxRA semblent être moins exprimés chez le mutant antigène O. I L’expression du système CpxRA a également été étudiée lors de l’exposition de souches faiblement productrices de biofilm à des doses sous inhibitrices de pénicilline G (sous-CMI de PG). L’expression des gènes cpxR et cpxA ainsi que d’un gène codant pour la biosynthèse du PGA est augmentée après exposition à des doses sous-CMI de PG. Cette augmentation est suivie d’une augmentation de la capacité des souches étudiées à former un biofilm ainsi que d’une modification de la composition de la matrice extracellulaire. Ces résultats suggèrent que des doses sous-CMI de PG semblent agir comme signaux activateurs de la formation de biofilm chez A. pleuropneumoniae. Finalement, des expériences visant à établir l’implication du biofilm dans l’échappement d’A. pleuropneumoniae au système immunitaire ont démontré que les bactéries du biofilm sont moins susceptibles d’activer des cellules immunitaires que les bactéries planctoniques. À l’aide de la spectrométrie de masse, nous avons démontré une distribution différente des structures du lipide A du LPS entre les bactéries planctoniques et ceux du biofilm. Ces modifications structurelles au niveau du lipide A pourraient expliquer, du moins en partie, cette diminution de la réponse inflammatoire suite à l’exposition des macrophages aux bactéries du biofilm d’A. pleuropneumoniae. Au cours de ce projet, nous avons ainsi pu identifier de nouveaux facteurs importants pour la formation du biofilm d’A. pleuropneumoniae nous permettant de mieux comprendre les mécanismes de formation du biofilm ainsi que son implication dans la pathogénicité. / Actinobacillus pleuropneumoniae is a Gram-negative bacterium belonging to the Pasteurellaceae family and the causative agent of porcine pleuropneumonia, a highly contagious disease that causes important economic losses to the swine industry worldwide. Several virulence factors of A. pleuropneumoniae have been identified. These factors include the Apx toxins, iron uptake systems and surface polysaccharides. Surface polysaccharides including lipopolysaccharides (LPS) and capsular polysaccharides (CPS) are implicated in the adhesion of A. pleuropneumoniae. Recent literature indicates that A. pleuropneumoniae has the ability to rapidly form a biofilm rich in poly-N-acetyl-D-glucosamine (PGA). However, the role of the biofilm in the pathogenesis as well as factors and signals involved in are little known to date. In this study, we demonstrated that the LPS O antigen plays an important role in the biofilm formation by A. pleuropneumoniae whether in a static model or a dynamic model under continuous flow, the "drip flow reactor" which is more representative of the lung environment. While truncation of the LPS core oligosaccharide or the absence of CPS did not have any effect, absence of O antigen markedly reduced the ability of A. pleuropneumoniae serotype 1 to form a mature biofilm. This finding was linked for the O-antigen mutant to a reduced pgaA expression and, consequently, a reduced PGA production. Indeed, compared to the parental or other strains, the biofilm of the O-antigen mutant was dramatically reduced and it had less cell-associated PGA. Real-time PCR analyses revealed a significant reduction in the level of pgaA which encodes for biosynthesis of PGA. Interestingly, the O-antigen mutant also exhibited reduced expression of stress extracytoplasmic CpxRA system. Expression of CpxRA system was also investigated during the exposure of field isolates of A. pleuropneumoniae to sub-minimal inhibitory concentrations of penicillin G (sub-MICs of PG). III Surprisingly, cpxR, cpxA and pgaA expression was increased after exposure to sub-MICs of PG. The up-regulation of these genes was followed by an increase of the capacity of the studied strains to form a biofilm as well as a change in the composition of the induced biofilm extracellular matrix. These results suggest that sub-MICs of PG seem to act as activators signal towards biofilms of A. pleuropneumoniae. Finally, experiments to establish the involvement of the biofilm in the immune evasion of A. pleuropneumoniae have shown that biofilm cells have weaker ability to stimulate innate immune cells compared to planktonic bacteria. Using mass spectrometry, we demonstrated a different distribution of structures of lipid A of LPS between planktonic bacteria and those of the biofilm. These structural changes in the lipid A could explain, at least in part, the reduction of the inflammatory response following exposure of macrophages to A. pleuropneumoniae biofilm cells compared to their planktonic counterparts. During this project, we were able to identify new factors important for biofilm formation of A. pleuropneumoniae allowing us to better understand the biofilm formation and its involvement in pathogenicity.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Sveriges lantbruksuniv., 2001. / Härtill 5 uppsatser.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Actinobacillus pleuropneumoniae est un pathogène strict des voies respiratoires du porc et l'agent causal d'une pleuropneumonie. Plusieurs facteurs de virulence déjà connus sont impliqués dans ce processus infectieux. Récemment, nous avons démontré la liaison de l'hémoglobine porcine au lipopolysaccharide (LPS) d'A. pleuropneumoniae. Nous avons également mis en évidence qu'A. pleuropneumoniae pouvait utiliser l'hémoglobine comme seule source de fer pour sa croissance. Par contre, aucune information n'est présentement disponible concernant le système d'acquisition en fer provenant de l'hémoglobine porcine. Certains chercheurs ont identifié la liaison entre le LPS de certaines bactéries et l'hémoglobine humaine. De plus, des protéines liant l'hémoglobine ont été mises en évidence chez certaines bactéries. L'intérêt premier des études décrites dans cette thèse était de caractériser les molécules impliquées dans la liaison de l'hémoglobine porcine chez A. pleuropneumoniae. Le premier objectif de ce travail consistait à étudier l'effet de la liaison de l'hémoglobine porcine sur les propriétés biologiques et physiques du LPS d'A . pleuropneumoniae. Tout d'abord, la liaison de l'hémoglobine porcine à la surface de la cellule entière d'A. pleuropneumoniae a été mise en évidence par microscopie électronique à transmission (MET) et par spectroscopie. Puis il a été observé par cytométrie en flux que cette liaison ne modifiait pas l'accessibilité des anticorps aux antigènes de surface 0 et K. Ensuite, la liaison de l'hémoglobine porcine au lipide A de la molécule de LPS a été confirmée par le déplacement de la sonde fluorescente dansylcadavérine. Des analyses en MET ont mis en évidence que l'hémoglobine porcine fragmentait le LPS et diminuait ainsi sa vélocité de sédimentation sur un gradient de sucrose. Des tests sur lysats d'amébocytes du Limulus (ou LAL) ont révélé que l'hémoglobine diminuait l'activité biologique du LPS et réduisait également son habileté à stimuler la production d'oxide nitrique par les macrophages murins. Le deuxième objectif de notre étude consistait à élaborer une méthodologie nous permettant de quantifier la liaison de l'hémoglobine porcine à la surface d'A. pleuropneumoniae dans le but de comparer différentes souches et différentes conditions de croissance. L'activité liant l'hémoglobine a été évaluée chez A. pleuropneumoniae par cytométrie en flux à l'aide d'hémoglobine porcine marquée à la fluorescéine. L'activité liant l'hémoglobine a été démontrée chez des souches représentatives d'A . pleuropneumoniae appartenant aux sérotypes 1 et 2. En comparant l'activité liant l'hémoglobine chez A. pleuropneumoniae sérotype 1 souche 4074 dans différentes conditions de croissance, il a été démontré que la restriction en fer augmentait l'expression des récepteurs d'hémoglobine. Ceci implique que l'activité liant l'hémoglobine semble, en partie, répressible par le fer. Ces résultats nous indiquaient que, en plus des LPS, des protéines de la membrane externe (OMPs) régulées par le fer pourraient possiblement être impliquées dans l'activité liant l'hémoglobine. De plus, des mutants isogéniques LPS et un mutant acapsulé d A. pleuropneumoniae serotype 1 ont été testés par cytométrie en flux afin de comprendre le rôle des polysaccharides de surface dans l'activité liant l'hémoglobine. Les expériences menées avec le mutant acapsulé ont indiqué que les molécules de surface possédant une activité liant l'hémoglobine étaient plus exposées à la surface cellulaire en absence du polysaccharide capsulaire. Cependant, l'activité liant l'hémoglobine des mutants LPS analysés dans cette étude était semblable à celle de la souche mère. Le profil des protéines de la membrane externe d'A. pleuropneumoniae sérotype 1 obtenu dans des conditions suffisantes ou restreintes en fer a été également évalué sur gel de polyacrylamide. Des OMPs régulées par le fer ont été observées suggérant qu'une ou plusieurs de ces OMPs pourraient jouer un rôle dans l'activité liant l'hémoglobine détectée par cytométrie en flux. Le troisième objectif de notre étude était d'identifier et de caractériser un ou des récepteurs protéiques impliqués dans la liaison de l'hémoglobine porcine. Les souches de référence représentant les 12 sérotypes d'A. pleuropneumoniae ont été examinées pour tester leur habileté à utiliser différentes sources de fer pour leur croissance. Dans un test de promotion, toutes les souches ont utilisé soit l'hémoglobine porcine ou l'hémine porcine. Cette acquisition ne semblait pas spécifique d'espèce étant donné que les souches d'A. pleuropneumoniae ont également utilisé l'hémoglobine bovine ou l'hémine bovine comme seule source de fer pour croître. En utilisant une procédure de purification par affinité à l'aide d'hémine- ou d'hémoglobine-agarose, une OMP majeure de 75 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine a été isolée chez A. pleuropneumoniae sérotype 1 souche 4074 après croissance dans des conditions de restriction en fer. Des OMPs mineures de 47 et 36 kDa liant l'hémine ou l'hémoglobine ont également été identifiées. Une étude portant sur les souches de référence des 12 sérotypes d'A. pleuropneumoniae après croissance dans des conditions de restriction en fer a révélé que toutes les souches, excepté celles des sérotypes 3, 6, 7, et 10 synthétisaient l'OMP majeure de 75 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine. Cette étude a également démontré que l'OMP mineure de 47 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine était conservée chez toutes les souches testées représentant les 12 sérotypes; l'OMP mineure de 36 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine a été isolée chez toutes les souches testées sauf chez la souche 8329/85 représentant le sérotype 12. Le marquage de la cellule entière d'A. pleuropneumoniae au palmitate radioactif a indiqué que l'OMP majeure de 75 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine n'était pas de nature lipoprotéique. Cependant, les OMPs mineures de 47 et 36 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine pourraient être des lipoprotéines étant donné que des bandes d'approximativement 47 et 36 kDa ont été observées suite au marquage. Malgré plusieurs essais, il n'a pas été possible de déterminer la séquence N-terminale en acides aminés de l'OMP majeure de 75 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine. Afin de prouver que l'OMP majeure de 75 kDa purifiée par hémine-agarose ou hémoglobine-agarose étaient identiques et dans le but d'obtenir une séquence nous permettant de synthétiser un oligonucléotide, ces protéines ont été analysées par un spectromètre de masse couplé à un HPLC et à un séquenceur Edman. Ces analyses ont révélé des peptides communs entre l'OMP purifiée par hémineagarose et l'OMP purifiée par hémoglobine-agarose. Ces résultats suggèrent fortement que ces peptides proviendraient de la même protéine. L'ensemble de nos résultats suggèrent donc que l'OMP majeure de 75 kDa et les OMPs mineures de 36 et 47 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine chez A. pleuropneumoniae pourraient être impliquées dans le système d'acquisition en fer provenant de l'hémine ou de l'hémoglobine porcine.

Actinobacillus pleuropneumoniae est l’agent étiologique de la pleuropneumonie porcine. La bactérie se transmet par voies aériennes et contacts directs. Plusieurs facteurs de virulence ont été identifiés, nommément les polysaccharides capsulaires, les lipopolysaccharide, les exotoxines ApxI à IV et de nombreux mécanismes d’acquisition du fer. Aucun vaccin efficace contre tous les sérotypes de la bactérie n’a encore été élaboré. Afin de mieux comprendre de quelle façon A. pleuropneumoniae régule la transcription de ses nombreux facteurs de virulence et de découvrir de nouvelles cibles potentielles pour l’élaboration de vaccins efficaces, le profil transcriptomique de la bactérie a été étudié dans des conditions simulant l’infection ainsi qu’à la suite d’une infection naturelle aiguë chez l’animal. Des biopuces de première et de seconde génération (AppChip1 et AppChip2) comportant respectivement 2025 cadres de lecture ouverts (ORF) de la version préliminaire du génome d’A. pleuropneumoniae sérotype 5b souche L20 et 2033 ORF de la version finale annotée du même génome ont été utilisées. Dans un premier temps, des expériences réalisées dans des conditions de concentration restreinte en fer ont permis d’identifier 210 gènes différentiellement exprimés, dont 92 étaient surexprimés. Plusieurs nouveaux mécanismes d’acquisition du fer ont pu être identifiés, incluant un système homologue au système YfeABCD de Yersinia pestis, impliqué dans l’acquisition du fer chélaté, ainsi que des gènes homologues aux composantes du système HmbR de Neisseria meningitidis impliqué dans l’acquisition du fer à partir de l’hémoglobine. Dans des conditions de culture permettant la formation de biofilms, les gènes tadC et tadD d’un opéron tad (« tight adherence locus ») putatif, les gènes pgaBC impliqués dans la synthèse d’un polysaccharide de la matrice du biofilm ainsi que deux gènes présentant de fortes homologies avec un gène codant pour l’adhésine auto-transporteur Hsf retrouvée chez Haemophilus influenzae ont montré une surexpression significative. Plusieurs de ces gènes ont également été retrouvés lors d’expériences réalisées avec des cellules épithéliales d’origine pulmonaire en culture, qui ont permis d’identifier 170 gènes différentiellement exprimés après la croissance planctonique au-dessus des cellules, et 131 autres suite à l’adhésion à ces cellules. Parmis les gènes surexprimés, les gènes tadB et rcpA de l’opéron tad putatif, les gènes pgaBC ainsi que le gène codant pour l’homologue d’Hsf ont été retrouvés. En présence de liquide de lavage broncho-alvéolaire (BALF), 156 gènes ont montré un profil d’expression modifié, et le gène apxIVA, identifié comme étant surexprimé, a pu être détecté pour la première fois dans des conditions de croissance in vitro. Finalement, des expériences visant à déterminer les gènes utilisés directement chez l’animal en phase aiguë de la pleuropneumonie porcine ont permis d’identifier 150 gènes qui étaient différentiellement exprimés. En plus d’identifier des gènes d’un possible opéron codant pour un fimbriae de type IV, 3 des 72 gènes surexprimés sont conservés chez tous les sérotypes d’A. pleuropneumoniae et codent pour des protéines ou lipoprotéines de surface. Nos expériences ont permis d’identifier plusieurs nouveaux facteurs de virulence potentiels chez A. pleuropneumoniae ainsi que plusieurs nouvelles cibles potentielles pour l’élaboration de vaccins efficaces contre tous les sérotypes. / Actinobacillus pleuropneumoniae is the etiological agent of porcine pleuropneumonia. Transmission of the disease occurs through direct contact or aerosols. The bacteria possess many virulence factors, namely capsular polysaccharides, lipopolysaccharides, four Apx toxins and iron acquisition mechanisms. To this day, an efficient cross-serotype vaccine has yet to be developed. In order to investigate regulation mechanisms in A. pleuropneumoniae and to identify new potential targets for the synthesis of subunit vaccines, the transcriptomic profile of the bacteria under conditions that simulate the infection and following a natural acute infection in vivo were studied. The experiences relied on first and second generation microarrays (AppChip1 and AppChip2) designed using 2025 ORFs of the draft version of the A. pleuropneumoniae serotype 5b strain L20 genome and 2033 ORFs of the final and annotated version of the same genome respectively. First, experiments were conducted under iron-restricted conditions and 210 genes were deemed differentially expressed, 92 of which were up-regulated. Some new putative iron acquisition mechanisms were identified, including genes homologous to those of the Yersinia pestis YfeABCD chelated-iron acquisition system, as well as other genes homologous to components of the HmbR iron uptake from hemoglobin system of Neisseria meningitidis. When cultured in conditions promoting biofilm production, genes tadC and tadD from a putative tad (« tight adherence locus ») operon, genes pgaABC involved in the biosynthesis of a polysaccharide of the biofilm matrix as well as two ORFs encoding a putative autotransporter adhesins similar to the Haemophilus influenzae Hsf adhesin were all significantly overexpressed. Many of these genes were also overexpressed when lung epithelial cells were infected with A. pleuropneumoniae. While 170 genes were differentially expressed after planktonic growth in the culture medium above the cells, another 131 were identified following direct adhesion to the cells. Genes tadB and rcpA of the tad locus, as well as genes pgaBC and an ORF coding for the Hsf homolog where all found among overexpressed genes. When A. pleuropneumoniae was cultured in contact with broncho-alveolar lavage fluids (BALF), 156 genes were significantly differentially expressed and gene apxIVA, which was up-regulated, was detected for the first time during in in vitro growth conditions. Finally, experiments were conducted in vivo in animals naturally infected with A. pleuropneumoniae in the late stage of the acute phase in order to identify genes that are expressed during the infection of the natural host. While 150 genes were deemed differentially expressed, genes apxIVA as well as two genes from an operon coding for a putative type IV fimbriae were up-regulated. Out of those 72 genes that were overexpressed, 3 encode proteins or lipoproteins of the outer membrane which are conserved among all serotypes of the bacteria. Overall, we were able to identify several new potential virulence factors for A. pleuropneumoniae in the course of our experiments, as well as several new potential targets for the elaboration of an efficient cross-serotype vaccine.

Actinobacillus pleuropneumoniae est l’agent étiologique de la pleuropneumonie porcine. La bactérie se transmet par voies aériennes et contacts directs. Plusieurs facteurs de virulence ont été identifiés, nommément les polysaccharides capsulaires, les lipopolysaccharide, les exotoxines ApxI à IV et de nombreux mécanismes d’acquisition du fer. Aucun vaccin efficace contre tous les sérotypes de la bactérie n’a encore été élaboré. Afin de mieux comprendre de quelle façon A. pleuropneumoniae régule la transcription de ses nombreux facteurs de virulence et de découvrir de nouvelles cibles potentielles pour l’élaboration de vaccins efficaces, le profil transcriptomique de la bactérie a été étudié dans des conditions simulant l’infection ainsi qu’à la suite d’une infection naturelle aiguë chez l’animal. Des biopuces de première et de seconde génération (AppChip1 et AppChip2) comportant respectivement 2025 cadres de lecture ouverts (ORF) de la version préliminaire du génome d’A. pleuropneumoniae sérotype 5b souche L20 et 2033 ORF de la version finale annotée du même génome ont été utilisées. Dans un premier temps, des expériences réalisées dans des conditions de concentration restreinte en fer ont permis d’identifier 210 gènes différentiellement exprimés, dont 92 étaient surexprimés. Plusieurs nouveaux mécanismes d’acquisition du fer ont pu être identifiés, incluant un système homologue au système YfeABCD de Yersinia pestis, impliqué dans l’acquisition du fer chélaté, ainsi que des gènes homologues aux composantes du système HmbR de Neisseria meningitidis impliqué dans l’acquisition du fer à partir de l’hémoglobine. Dans des conditions de culture permettant la formation de biofilms, les gènes tadC et tadD d’un opéron tad (« tight adherence locus ») putatif, les gènes pgaBC impliqués dans la synthèse d’un polysaccharide de la matrice du biofilm ainsi que deux gènes présentant de fortes homologies avec un gène codant pour l’adhésine auto-transporteur Hsf retrouvée chez Haemophilus influenzae ont montré une surexpression significative. Plusieurs de ces gènes ont également été retrouvés lors d’expériences réalisées avec des cellules épithéliales d’origine pulmonaire en culture, qui ont permis d’identifier 170 gènes différentiellement exprimés après la croissance planctonique au-dessus des cellules, et 131 autres suite à l’adhésion à ces cellules. Parmis les gènes surexprimés, les gènes tadB et rcpA de l’opéron tad putatif, les gènes pgaBC ainsi que le gène codant pour l’homologue d’Hsf ont été retrouvés. En présence de liquide de lavage broncho-alvéolaire (BALF), 156 gènes ont montré un profil d’expression modifié, et le gène apxIVA, identifié comme étant surexprimé, a pu être détecté pour la première fois dans des conditions de croissance in vitro. Finalement, des expériences visant à déterminer les gènes utilisés directement chez l’animal en phase aiguë de la pleuropneumonie porcine ont permis d’identifier 150 gènes qui étaient différentiellement exprimés. En plus d’identifier des gènes d’un possible opéron codant pour un fimbriae de type IV, 3 des 72 gènes surexprimés sont conservés chez tous les sérotypes d’A. pleuropneumoniae et codent pour des protéines ou lipoprotéines de surface. Nos expériences ont permis d’identifier plusieurs nouveaux facteurs de virulence potentiels chez A. pleuropneumoniae ainsi que plusieurs nouvelles cibles potentielles pour l’élaboration de vaccins efficaces contre tous les sérotypes. / Actinobacillus pleuropneumoniae is the etiological agent of porcine pleuropneumonia. Transmission of the disease occurs through direct contact or aerosols. The bacteria possess many virulence factors, namely capsular polysaccharides, lipopolysaccharides, four Apx toxins and iron acquisition mechanisms. To this day, an efficient cross-serotype vaccine has yet to be developed. In order to investigate regulation mechanisms in A. pleuropneumoniae and to identify new potential targets for the synthesis of subunit vaccines, the transcriptomic profile of the bacteria under conditions that simulate the infection and following a natural acute infection in vivo were studied. The experiences relied on first and second generation microarrays (AppChip1 and AppChip2) designed using 2025 ORFs of the draft version of the A. pleuropneumoniae serotype 5b strain L20 genome and 2033 ORFs of the final and annotated version of the same genome respectively. First, experiments were conducted under iron-restricted conditions and 210 genes were deemed differentially expressed, 92 of which were up-regulated. Some new putative iron acquisition mechanisms were identified, including genes homologous to those of the Yersinia pestis YfeABCD chelated-iron acquisition system, as well as other genes homologous to components of the HmbR iron uptake from hemoglobin system of Neisseria meningitidis. When cultured in conditions promoting biofilm production, genes tadC and tadD from a putative tad (« tight adherence locus ») operon, genes pgaABC involved in the biosynthesis of a polysaccharide of the biofilm matrix as well as two ORFs encoding a putative autotransporter adhesins similar to the Haemophilus influenzae Hsf adhesin were all significantly overexpressed. Many of these genes were also overexpressed when lung epithelial cells were infected with A. pleuropneumoniae. While 170 genes were differentially expressed after planktonic growth in the culture medium above the cells, another 131 were identified following direct adhesion to the cells. Genes tadB and rcpA of the tad locus, as well as genes pgaBC and an ORF coding for the Hsf homolog where all found among overexpressed genes. When A. pleuropneumoniae was cultured in contact with broncho-alveolar lavage fluids (BALF), 156 genes were significantly differentially expressed and gene apxIVA, which was up-regulated, was detected for the first time during in in vitro growth conditions. Finally, experiments were conducted in vivo in animals naturally infected with A. pleuropneumoniae in the late stage of the acute phase in order to identify genes that are expressed during the infection of the natural host. While 150 genes were deemed differentially expressed, genes apxIVA as well as two genes from an operon coding for a putative type IV fimbriae were up-regulated. Out of those 72 genes that were overexpressed, 3 encode proteins or lipoproteins of the outer membrane which are conserved among all serotypes of the bacteria. Overall, we were able to identify several new potential virulence factors for A. pleuropneumoniae in the course of our experiments, as well as several new potential targets for the elaboration of an efficient cross-serotype vaccine.

Durant une infection pulmonaire, les porcs sont souvent infectés par plus d’un microorganisme. Actinobacillus pleuropneumoniae et le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) sont des pathogènes qui peuvent infecter de manière simultanée les porcs. L’objectif du présent projet est d’étudier l’interaction entre ces pathogènes. Les deux lignées cellulaires permissives au VSRRP utilisées sont les cellules « St-Jude porcine lung » (SJPL) et MARC-145. Les cellules ont été pré-infectées avec le VSRRP, puis infectées avec A. pleuropneumoniae. Un dosage de la lactate déshydrogénase a montré qu’une co-infection VSRRP-A. pleuropneumoniae comparée à une infection simple augmente significativement la cytotoxicité. Dans les mêmes conditions expérimentales, une pré-infection virale ne semble pas affecter l’adhérence d’A. pleuropneumoniae aux cellules. À l’aide de tests ELISA, il a été possible de démontrer la production d’IL-8 et d’INF-γ lorsqu’il y a infection des cellules. Pour ce qui est du TNF-α, d’IL-6 et d’IL-10, ces cytokines ne sont pas détectées en présence des pathogènes étudiés. Des expériences de pré-infection bactérienne suivie d’infection virale ont également été réalisées. Il a été démontré que la pré-infection avec A. pleuropneumoniae diminuait la réplication du VSRRP chez la lignée cellulaire SJPL, mais cela n’est pas observé avec la lignée cellulaire MARC-145. Les résultats préliminaires ont démontré que cette diminution de la réplication serait causée par une molécule de faible poids moléculaire sécrétée dans le surnageant bactérien et celle-ci serait résistante à la chaleur. Les lignées cellulaires SJPL et MARC-145 représentent de bons modèles pour l’étude des infections mixtes des voies respiratoires du porc. / The respiratory tract of pigs is often colonized by more than one pathogen during an infection. Actinobacillus pleuropneumoniae and the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) are pathogens that can be associated with co-infection. The objective of this project was to study interactions between A. pleuropneumoniae and PRRSV during mixed infection. The PRRSV-permissive cell lines, St-Jude porcine lung (SJPL) and MARC-145 were used. In the first part, cells were pre-infected with PPRSV followed by an infection with A. pleuropneumoniae. Results obtained with a lactate dehydrogenase test showed that a co-infection resulted in a greater cytotoxicity then the single infections. The adherence of A. pleuropneumoniae to non-infected or PRRSV-infected cells was similar. Based on ELISAs tests, it was found that the cells produced IL-8 and IFN-γ when they were infected, but TNF-α, IL-6 and IL-10 were not detected. In the second part, cells were pre-infected with A. pleuropneumoniae followed by viral infection. The results showed that a pre-infection with A. pleuropneumoniae decreased PRRSV replication in SJPL cells, whereas A. pleuropneumoniae did not impair PRRSV replication in MARC-145 cells. Preliminary results indicate that a molecule secreted by A. pleuropneumoniae is the factor impairing PRRSV replication in SJPL cells. The factor is probably a small molecular weight molecule that is heat-resistant. In conclusion, both cell lines allowed the study of A. pleuropneumoniae and PRSSV interactions during a mixed-infection and these models could be adapted to study interactions of other swine pathogens.

Durant une infection pulmonaire, les porcs sont souvent infectés par plus d’un microorganisme. Actinobacillus pleuropneumoniae et le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) sont des pathogènes qui peuvent infecter de manière simultanée les porcs. L’objectif du présent projet est d’étudier l’interaction entre ces pathogènes. Les deux lignées cellulaires permissives au VSRRP utilisées sont les cellules « St-Jude porcine lung » (SJPL) et MARC-145. Les cellules ont été pré-infectées avec le VSRRP, puis infectées avec A. pleuropneumoniae. Un dosage de la lactate déshydrogénase a montré qu’une co-infection VSRRP-A. pleuropneumoniae comparée à une infection simple augmente significativement la cytotoxicité. Dans les mêmes conditions expérimentales, une pré-infection virale ne semble pas affecter l’adhérence d’A. pleuropneumoniae aux cellules. À l’aide de tests ELISA, il a été possible de démontrer la production d’IL-8 et d’INF-γ lorsqu’il y a infection des cellules. Pour ce qui est du TNF-α, d’IL-6 et d’IL-10, ces cytokines ne sont pas détectées en présence des pathogènes étudiés. Des expériences de pré-infection bactérienne suivie d’infection virale ont également été réalisées. Il a été démontré que la pré-infection avec A. pleuropneumoniae diminuait la réplication du VSRRP chez la lignée cellulaire SJPL, mais cela n’est pas observé avec la lignée cellulaire MARC-145. Les résultats préliminaires ont démontré que cette diminution de la réplication serait causée par une molécule de faible poids moléculaire sécrétée dans le surnageant bactérien et celle-ci serait résistante à la chaleur. Les lignées cellulaires SJPL et MARC-145 représentent de bons modèles pour l’étude des infections mixtes des voies respiratoires du porc. / The respiratory tract of pigs is often colonized by more than one pathogen during an infection. Actinobacillus pleuropneumoniae and the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) are pathogens that can be associated with co-infection. The objective of this project was to study interactions between A. pleuropneumoniae and PRRSV during mixed infection. The PRRSV-permissive cell lines, St-Jude porcine lung (SJPL) and MARC-145 were used. In the first part, cells were pre-infected with PPRSV followed by an infection with A. pleuropneumoniae. Results obtained with a lactate dehydrogenase test showed that a co-infection resulted in a greater cytotoxicity then the single infections. The adherence of A. pleuropneumoniae to non-infected or PRRSV-infected cells was similar. Based on ELISAs tests, it was found that the cells produced IL-8 and IFN-γ when they were infected, but TNF-α, IL-6 and IL-10 were not detected. In the second part, cells were pre-infected with A. pleuropneumoniae followed by viral infection. The results showed that a pre-infection with A. pleuropneumoniae decreased PRRSV replication in SJPL cells, whereas A. pleuropneumoniae did not impair PRRSV replication in MARC-145 cells. Preliminary results indicate that a molecule secreted by A. pleuropneumoniae is the factor impairing PRRSV replication in SJPL cells. The factor is probably a small molecular weight molecule that is heat-resistant. In conclusion, both cell lines allowed the study of A. pleuropneumoniae and PRSSV interactions during a mixed-infection and these models could be adapted to study interactions of other swine pathogens.

Le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) est un pathogène ayant d’énormes conséquences pour les producteurs porcins. Il est la cause d’une des maladies les plus coûteuses à l’industrie au Québec et, à ce jour, il n’y a aucun traitement efficace commercialement disponible contre le virus. Il a été précédemment démontré que le surnageant de culture de bactéries Actinobacillus pleuropneumoniae (App) - l’agent causant la pleuropneumonie porcine - possède une activité antivirale in vitro contre le VSRRP. Ces études ont déterminé que cette activité était en fait médiée par des métabolites excrétés par les bactéries d’App, résistants à la chaleur et de faible poids moléculaire. Cependant, l’identité de ces métabolites demeurait inconnue, menant ainsi aux objectifs de ce projet : (I) produire un surnageant actif d’App; (II) caractériser et identifier les métabolites actifs utilisant la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS); (III) tester et évaluer l’activité antivirale des composés purifiés. De nombreux métabolites de nucléotides de l’adénosine en haute concentration dans le surnageant d’App ont ainsi été identifiés par HRMS. Pour confirmer l’effet antiviral du surnageant et des métabolites actifs identifiés, un modèle d’infection de cellules SJPL permissives au VSRRP et de l’imagerie à immunofluorescence ont été employés. Les métabolites ont en effet montré une inhibition de la réplication du VSRRP dans les cellules et leurs mécanismes d’actions sont déjà bien répertoriés; soit l’inhibition des polymérases d’ARN cellulaire et virale par la forme de triphosphate de nucléoside, ainsi que l’arrêt de synthèse des acides nucléiques lors de la réplication virale. Cette étude propose donc de nouvelles ouvertures, basé sur les mécanismes d’actions cellulaires responsables de l’effet antiviral, pour développer des traitements préventifs contre le VSRRP / Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is one of the most devastating viruses in the swine industry. It causes major economic losses worldwide on an annual basis. To date, there has not been an effective treatment for this virus. Previous studies conducted in our group have shown that the culture supernatant of Actinobacillus pleuropneumoniae (App), the causative agent of porcine pleuropneumonia, possesses an antiviral activity in vitro against PRRSV. These studies have shown that the antiviral activity was mediated by small molecular weight, heat resistant metabolites present in the App supernatant ultrafiltrates. However, the identity of those metabolites remained unknown, which led us to the objectives of this study: (I)generate an active supernatant; (II)characterize and identify the active metabolites using high resolution mass spectrometry; (III)evaluate the antiviral activity of the purified compounds following identification. In this study we utilized a virus infection model using SJPL cells and immunofluorescence imagery to confirm the antiviral activity of the App supernatant as our first approach. Subsequently, using high resolution mass spectrometry we identified several adenosine nucleotide metabolites present in App supernatants in high concentrations. Following testing, we revealed that several adenosine nucleotide metabolites inhibit PRRSV replication in SJPL cells. Interestingly, the antiviral mechanism of action of adenosine nucleotide analogs is already known. The nucleoside triphosphate form functions by inhibiting cellular and viral RNA polymerases and during viral RNA replication, incorporates nucleoside analogs into nascent RNA chains resulting in termination of nucleic acid synthesis. This study may suggest new approaches to develop prophylactic treatment for PRRSV

Le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) est un pathogène d’importance dans l’industrie porcine et est responsable d’importantes pertes économiques. Il n’existe pas d’antiviral efficace contre celui-ci. Il a récemment été mis en évidence que le surnageant de culture d’Actinobacillus pleuropneumoniae, l’agent étiologique de la pleuropneumonie porcine, possédait une activité antivirale in vitro contre le VSRRP dans la lignée cellulaire SJPL. Les objectifs de mon projet sont (i) d’étudier les mécanismes cellulaires menant à l’activité antivirale causée par le surnageant de culture d’A. pleuropneumoniae, et (ii) de caractériser les molécules actives présentes dans le surnageant de culture d’A. pleuropneumoniae. Dans un premier temps, des analyses de protéome ont été effectuées et ont permis d’observer que le surnageant de culture modulait la régulation du cycle cellulaire. Dans le but d’analyser le cycle cellulaire des cellules SJPL, la cytométrie en flux a été utilisée et a permis de démontrer que le surnageant de culture induisait un arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M. Deux inhibiteurs de la phase G2/M ont alors été utilisé. Il s'est avéré que ces inhibiteurs avaient la capacité d’inhiber le VSRRP dans les cellules SJPL. Enfin, la spectrométrie de masse a été utilisée dans le but de caractériser les molécules actives présentes dans le surnageant de culture d’A. pleuropneumoniae et d’identifier deux molécules. Ce projet a permis de démontrer pour la première fois qu’A. pleuropneumoniae est capable de perturber le cycle cellulaire et que ce dernier était un élément important dans l’effet antiviral contre le VSRRP. / Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is the most important pathogen in the swine industry and causes important economic losses. No effective antiviral drugs against it exist. It was recently reported that the culture supernatant of Actinobacillus pleuropneumoniae, the causative agent of porcine pleuropneumonia, possesses an antiviral activity in vitro against PRRSV in SJPL cells. The objectives of this project were (i) to identify the mechanism behind the antiviral activity displayed by A. pleuropneumoniae, and (ii) to characterize the active molecules present in the culture supernatant. Proteomic analyses were first conducted and demonstrated the culture supernatant ability to induce modulations of the cell cycle regulation. In order to determine the SJPL cell cycle, flow cytometry analyses were performed and demonstrated that the culture supernatant induced a G2/M-phase cell cycle arrest. Two G2/M-phase cell cycle inhibitors were then used and their ability to inhibit PRRSV infection in SJPL cells was demonstrated. Finally, in order to characterize the active molecules present in the A. pleuropneumoniae culture supernatant, mass spectrometry was used and two molecules were identified. This is the first study demonstrating the A. pleuropneumoniae ability to disrupt cell cycle and the cell cycle importance to the inhibitory activity against PRRSV.