El treball realitzat en aquesta Tesi consisteix en l'anàlisi de diferents mecanismes que participen en la regulació de les activitats HAT i HDAC cel·lulars. Podríem distingir dos tipus de modulació d'aquestes activitats: (1) senyals extracel·lulars- antigen T, (2) senyals intracel·lulars- mitosi. Es coneix que aquests dos processos tenen respostes per part de la cèl·lula a nivell de cromatina. A grans trets, en els capítols 1A i 1B es presenten dos treballs que tenen com a objectiu l'estudi de l'antigen T quan interacciona amb l'acetiltransferasa CBP i la desacetilasa HDAC1. D'altra banda, en el capítol 2 s'ha analitzat l'establiment de diversos patrons de modificacions posttraduccionals de les histones per al manteniment de l'activitat transcripcional dels gens quan la cèl·lula entra a Mitosi. Per últim, en el capítol 3 es presenta un altre tipus de regulació d'aquestes activitats, l'autoacetilació de l'acetiltransferasa PCAF. Així doncs, tres mecanismes diferents per al control d'unes activitats molt importants per la cèl·lula eucariota, que són crucials per al manteniment de l'equilibri acetilació i desacetilació de la cromatina.1. L'antigen T de SV40 modula les activitats acetiltransferasa i desacetilasa d'histones.Les acetiltransferases i desacetilases d'histones juguen un paper clau en l'activació de la transcripció gènica, la proliferació i diferenciació cel·lulars modulant l'estructura de la cromatina; no obstant, es coneixen poques coses de la seva pròpia regulació. En el treball que es presenta al capítol 1A, s'ha analitzat la regulació de les activitats acetiltransferasa de cèl·lules CV1 i de cèl·lules CV1COS. A nivell global l'antigen T incrementa l'acetilació de les histones i l'activació de les activitats enzimàtiques que regulen aquesta modificació (HATs) (Figures 1 i 2). L'activitat acetiltransferasa de CBP és superior en les cèl·lules que expressen l'antigen T. D'altra banda, l'existència de la interacció entre l'antigen T i CBP (interacció descrita a la literatura {Avantaggiati, 1996 #39; Eckner, 1996 #24}) modula positivament la capacitat de l'acetiltransferasa d'activar la transcripció gènica del promotor pGal4-Hsp70-luciferasa (Figura 5). El capítol 1B aborda les conseqüències funcionals de la interacció entre l'antigen T i la desacetilasa d'histones HDAC1. La transcripció del promotor Timidina Quinasa quan és activat pel coactivador CBP, pateix una repressió transcripcional per acció de l'antigen T (Figura 1) com s'havia descrit anteriorment {Avantaggiati, 1996 #39; Eckner, 1996 #24}. Aquesta repressió transcripcional suggereix la presència d'un complex repressor amb activitat desacetilasa. En els experiments de transfeccions transitòries utilitzant TSA s'observa una desrepressió de l'activitat transcripcional d'aquest promotor (Figura 2). Paral·lelament, els nostres resultats demostren que l'antigen T interacciona in vitro amb HDAC1 (Figura 4). En aquest capítol es fa palesa la versatilitat de la proteïna viral, al poder participar en la regulació de dues activitats cel·lulars oposades.2. Paper de les modificacions de les histones en la senyalització i l'activació dels gens durant Mitosi.S'havia descrit que durant la mitosi, hi ha una inhibició de la transcripció de forma generalitzada {Prescott, 1962 #390}, tot i així, hi ha alguns promotors que mantenen llocs d'hipersensibilitat a la DNasa I o al KMNO4 {Michelotti, 1997 #414}. Les modificacions post-traduccionals de les histones sorgeixen com a candidates al marcatge dels gens durant la mitosi {Jeppesen, 1997 #360; Kouskouti, 2005 #264}. En l'anàlisi global de les modificacions de les histones relacionades amb l'activació transcripcional: acetilació de H3 (K9, k14) i H4 (K5, K8, K12, K16) o dimetilació i trimetilació de la histona H3K4, es va observar que aquests senyals es mantenen units als cromosomes mitòtics (Figura 1). En l'anàlisi local de tres tipus de gens es va poder observar que tant l'acetilació de H3 i H4 com la metilació de H3K4 eren marques que es mantenien als promotors i gens de GAPDH i Hsp70 (constitutiu i induïble). L'anàlisi del gen de la Ciclina B1, actiu durant mitosi determina que l'activació transcripcional d'aquest gen estava relacionada amb un augment en la di- i la trimetilació de H3K4 (Figura 5). / "REGULATION OF HAT AND HDAC ACTIVITIES IN RESPONSE TO INTRACELLULAR AND EXTRACELLULAR SIGNALS"Mitosis is a critical phase of the cell cycle: genetic information has to divide and to be transmitted into the daughter cells. Therefore, chromosomes are highly condensed, and the most cellular transcriptional activity becomes repressed.Histone acetylation is a dynamic process that is regulated by two classes of enzymes, the histone acetyltransferases (HATs) and histone deacetylases (HDACs). These two activities are implicated in remodeling chromatin, so they become very important during mitosis. In the last few years accumulating evidence have shown HATs and HDACs activities as key enzymes on transcriptional activity of genes. These enzymes gain great importance immediately after exit mitosis, when transcriptional activity recovers. What's about these enzymes during mitosis? Do they become inactive? Are they displaced from chromatin or do they remain bound to it?In this work we have analyzed the global localization, subcellular distribution and activity of these enzymes during mitosis. Finally we have studied the acetylation and methylation levels on promoters and coding regions of selected genes during mitosis. The results show that the basal levels of acetylation are maintained at the promoters during mitosis.

L'ATP és una molècula molt carregada elèctricament important per a l'obtenció de l'energia necessària per l'activitat cel·lular. A més a més, també actua com a molècula de senyalització cel·lular. Normalment, la secreció controlada d'ATP té lloc a través de l'exocitosi de grànuls o vesícules. Tot i això, en algunes cèl·lules, altres mecanismes poden controlar l'alliberació d'ATP. En aquesta tesi s'han estudiat dos d'aquests mecanismes: l'alliberació d'ATP a través de la proteïna CD39 i l'alliberació d'ATP a través de connexines.La CD39, o NTPDasa 1, és una proteïna que hidrolitza nucleòtids trifosfat i difosfat fins a nucleòtids monofosfat. Resultats anteriors del nostre laboratori suggerien que, aplicant polsos hiperpolaritzants en la membrana dels oòcits de Xenopus, l'ectoenzim NTPDasa1 podia esdevenir permeable per l'ATP. Continuant amb l'estudi d'aquesta proteïna, es va voler determinar també si estava relacionada amb l'alliberació d'ATP induïda per estrès hipertònic descrita en oòcits. Per portar a terme aquests estudis, era necessari aconseguir un oligonucleòtid antisentit contra la CD39 dels oòcits de Xenopus. Per tant, el nostre primer objectiu va ser sintetitzar i validar aquest oligonucleòtid, per tal de poder-lo utilitzar posteriorment a l'hora de fer els experiments. Mitjançant el disseny de dos oligonucleòtids antisentit per dita proteïna es va mesurar l'alliberació d'ATP en grups d'oòcits injectats amb els oligonucleòtids i en grups control, després de ser sotmesos a un xoc hiperosmòtic. Al mateix temps, per a comprovar l'efectivitat dels oligonucleòtids injectats, es va mesurar l'activitat ATPàsica en aquests oòcits. Es va observar com l'antisentit per la CD39 reduïa de manera significativa l'alliberació d'ATP i el corrent iònic després de 13 minuts d'exposició hipertònica.Els hemicanals, formats per connexines, és un altre dels possibles mecanismes de regulació de l'alliberació d'ATP. En les gap junctions, les connexines uneixen el citoplasma de dues cèl·lules adjacents establint un canal intercel·lular que permet el pas d'ions i molècules més petites d'1 KDa. Es va estudiar aquest mecanisme en oòcits de Xenopus, estudiant la Cx38, un tipus específic de connexina endògena dels oòcits, i la Cx32, expressada en els oòcits de manera heteròloga. En els experiments amb la Cx38, vam observar que solucions lliures d'ions divalents activaven un corrent d'entrada en els oòcits que era inhibit per octanol i àcid flufenàmic, dos inhibidors de les gap junctions. Aquest corrent sensible a calci, depenia de l'expressió de Cx38: disminuïa en oòcits injectats amb un oligonucleòtid antisentit per la Cx38 (ASCx38) i augmentava en oòcits que sobrexpressaven la Cx38. A més, l'activació dels hemicanals de Cx38 induïa l'alliberació d'ATP, la qual era inhibida per l'àcid flufenàmic, l'octanol i l'ASCx38 i augmentada en la sobrexpressió de Cx38. Aquests resultats suggerien que l'activació dels hemicanals era responsable de l'alliberació d'ATP en els oòcits de Xenopus.D'altra banda, vam investigar l'alliberació d'ATP a través dels hemicanals formats per Cx32 expressada en oòcits. Aquesta proteïna s'expressa en la majoria d'òrgans humans, però, particularment, mutacions de la Cx32 en les cèl·lules de Schwann produeixen la malaltia de Charcot-Marie-Tooth lligada al cromosoma X (CMTX). En oòcits que expressen la Cx32, vam combinar l'ús de tècniques de fixació de voltatge per registrar els corrents iònics generats pels hemicanals i la reacció bioluminiscent de la luciferina-luciferasa per mesurar l'alliberació d'ATP. Els hemicanals formats per la Cx32 eren estimulats mitjançant polsos despolaritzants generant un corrent iònic de sortida. Després de l'estimulació, en el període de repolarització, hi havia un corrent de cua que coincidia amb el moment d'alliberació d'ATP. L'àrea d'aquest corrent tenia una relació lineal amb la quantitat d'ATP alliberada. El conjunt de resultats d'aquesta tesi ens suggereixen que, tant les connexines com la CD39, participen en l'alliberació d'ATP a través de la membrana plasmàtica. / ATP is an electrically charged molecule required to obtain the energy necessary for cellular activity; in addition, it is an intercellular signaling molecule. Usually, the controlled secretion of ATP occurs through the exocytosis of granules and vesicles. However, in some cells, other mechanisms control ATP release. Two of these mechanisms have been studied in this thesis: ATP release through CD39 and ATP release through connexin hemichannels. CD39, or NTPDasa 1, is a protein that hydrolyze nucleotide triphosphates and nucleotide diphosphates to nucleotide monophosfates. To study its relationship with ATP release we have synthetized an antisense oligonucleotide against Xenopus oocyte CD39. Our results indicate that the antisense against CD39 significanty reduce ATP release and also the ionic current due to the activation of CD39 by hypertonic solution. It has been suggested that hemichannels, formed by connexins, may be an alternative pathway for ATP release. In gap junctions, connexins link the cytoplasm of two adjacent cells by establishing an intercellular channel. We have investigated the release of ATP from Xenopus oocytes through hemichannels formed by connexin 38 (Cx38), an endogenous, specific type of connexin, and by connexin32 (Cx32) heterologously expressed in Xenopus oocytes. In Xenopus oocytes, calcium-free solution reversibly activates an inward current that is inhibited by octanol and flufenamic acid. This calcium-sensitive current depends on Cx38 expression: it's decreased in oocytes injected with an antisense oligonucleotide against Cx38 (ASCx38) and is increased in oocytes overexpressing Cx38. Moreover, the activation of Cx38 also induce the release of ATP, which is inhibited by flufenamic acid, octanol and ASCx38 and increased by Cx38 overexpression. Connexin 32 is expressed in most of human organs but, particularly, Cx32 mutations present in Schwann cells produce X-linked Charcot-Marie-Tooth disease. In oocytes expressing Cx32, application of depolarizing pulses to positive potentials induce outward hemichannel currents that become inward during the repolarization phase. The release of ATP occurred during the repolarization period and the amount of ATP released correlate with the area of the tail current.