Objetivo general. Abordar la caracterización molecular y funcional de un sistema binario de plásmidos crípticos involucrados en la transferencia horizontal de genes por conjugación en la bacteria fijadora de nitrógeno y simbionte de alfalfa, Sinorhizobium meliloti. Objetivos específicos. En el marco del objetivo precedente abordaremos el estudio de las funciones que hacen a la transferencia conjugativa y a la replicación del plásmido críptico modelo pSmeLPU88b de S. meliloti descripto previamente por Pistorio et al., (2003) según el siguiente esquema: - Identificación y caracterización de elementos estructurales y genes involucrados en la movilización del plásmido modelo pSmeLPU88b. - Caracterización del complejo Dtr (DNA transfer and replication). - Clonado, y caracterización de la región génica del plásmido pSmeLPU88b asociada al módulo Dtr. Búsqueda y caracterización del gen de la relaxasa y de su producto de traducción como una de las proteínas centrales de la transferencia de ADN via conjugativa. - Identificación y caracterización funcional del origen de transferencia (oriT). - Evaluación con herramientas moleculares del grado de ubicuidad de funciones de movilización (Dtr) en S. meliloti. - Identificación y caracterización de los módulos de replicación del plásmido pSmeLPU88b. - Clonado de los módulos de replicación, secuenciamiento, estudios de incompatibilidad. - Evaluación de la transmisibilidad del plásmido pSmeLPU88b en el medio suelo, en condiciones de laboratorio y de campo.

El genoma mitocondrial humano es una molécula circular de doble cadena de 16,5 kb. En su secuencia existe información para 13 polipéptidos de diferentes subunidades de los complejos de la cadena de transporte electrónico (CTE), para 22 ARNt y para 2 ARNr. Una mutación en cualquiera de estos genes puede provocar que la CTE no funcione correctamente, dando lugar a una disfunción del sistema de fosforilación oxidativa. Todo ello puede provocar por un lado un déficit de energía en las células o tejidos, o por otro lado un incremento de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Según la demanda energética de cada tejido este déficit de producción de energía será más o menos importante, pudiendo incluso provocar graves trastornos fisiopatológicos.El incremento de la producción de ROS por parte de la cadena de transporte electrónico puede ser eliminado con ayuda de las defensas antioxidantes celulares. Si la producción de ROS es más importante que la acción de estas defensas, ello puede llegar a provocar lesiones en diferentes componentes celulares tales como lípidos, proteínas o al propio ADNmt. Para profundizar en este campo, en este trabajo en primer lugar se han diagnosticado a cuatro pacientes con enfermedad mitocondrial, portadores de una mutación en su genoma mitocondrial. A partir de plaquetas de estos pacientes se han generado cíbridos transmitocondriales, que se han utilizado como modelo de estudio. Se han estudiado las siguientes mutaciones en genes mitocondriales: T14487C en la subunidad ND6 del complejo I, A3243G en el ARN de transferencia Leu (UUR), A8344G en el ARN de transferencia Lys y G6930A en la subunidad COXI del complejo IV. Analizando la producción de peróxido de hidrógeno como medida de la producción de ROS en estas cuatro líneas, hemos observado que las líneas portadoras de una mutación que afectase al funcionamiento del complejo I y III (descritos ampliamente en la literatura como principales productores de ROS en la mitocondria) es decir A3243G, A8344G y T144874C, sí provocan un incremento de la producción, mientras que la mutación que no afectaba a estos complejos (G6930A) no provocaba incremento. Posteriormente se ha estudiado si este incremento producía daño oxidativo a diferentes componentes celulares, tales como lípidos, proteínas y el propio ADNmt. Previamente, debido a que en la literatura no existía un consenso claro sobre el mejor método de análisis de la peroxidación lipídica, se realizó un pequeño estudio sobre cuál era el mejor inhibidor de la peroxidación lipídica a utilizar y en que concentración, obteniendo que el mejor a utilizar era el BHT a una concentración de 3mM.En cuanto los resultados de daño oxidativo se observó que en los lípidos solo se observaba daño oxidativo en la línea portadora de la mutación T144874C, mientras que las otras no lo presentaban. En la oxidación de proteínas no se observó daño en ninguna de las cuatro líneas portadoras de la mutación y en cuanto a la oxidación del ADNmt, se observó daño oxidativo en las líneas portadoras de las mutaciones A8344G y T14487C. Con estos resultados se observa que en algunas mutaciones en el genoma mitocondrial la producción de ROS generada es superior a la capacidad detoxificadora de la célula, provocando daño oxidativo, mientras que en otras la producción de ROS no supera la acción de las enzimas antioxidantes. / Mitochondrial encephalomyopathies caused by mutations in mitochondrial DNA (mtDNA) are a heterogeneous group of disorders characterized by primary dysfunction of the oxidative phosphorylation system (OXPHOS) with a decrease in ATP production. Clinical and biochemical heterogeneity of mitochondrial disorders is due to the ubiquitous nature of mitochondria and the dual genetic (mitochondrial and nuclear DNA) control of OXPHOS. Some unique features of mitochondrial genetics, such as heteroplasmy and tissue segregation, contribute to this phenomenon. However, the precise mechanisms leading to this heterogeneity are still largely unclear.Mitochondria are the major source of reactive oxygen species (ROS), which are generated as toxic by-products of redox-coupled reactions in the electron transport chain (ETC). Inhibition of the ETC in vitro using some respiratory complex inhibitors results in a significant increase in the mitochondrial production of ROS. This increase suggests that when dysfunction of the respiratory chain complexes occurs, electrons can be transferred directly to the molecular oxygen. However, cells are well protected by antioxidant enzymes: the manganese superoxide dismutase (Mn-SOD) and copper-Zinc superoxide dismutase (CuZn-SOD) to eliminate superoxide anion (O2.-) and the glutahione peroxidase (GSH-Px) and catalase (CAT) to eliminate hydrogen peroxide. Oxidative stress results when the balance of prooxidants and antioxidants is altered in favour of the prooxidants. In turn, an excess of ROS may contribute to OXPHOS damage. Thus, to define the relationship between mtDNA mutations and production of ROS, several transmitochondrial cell lines (cybrids) carrying different mutations in their mtDNA were obtained from different mitochondrial patients. These included two common and well characterized mtDNA mutations in tRNA genes, the A3243G transition in the tRNALeu(UUR) derived from a patient with MELAS syndrome (mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes), and the A8344G mutation in the tRNALys, derived from a patient with the MERRF syndrome (myoclonus epilepsy with ragged-red fibers). In addition, another two cybrids cell lines were studied, harbouring the G6930A mutation in the gene encoding the subunit I (COI) of the cytochrome c oxidase (COX). This mutation changes the amino acid glycine into a premature termination codon, resulting in the loss of the last 170 amino acids (33%) of the polypeptide, thus causing a complete disruption in the COX assembly. The last cybrid cell line studied carried the mutation T144874C in the subunit 6 of the complex I of the ETC.Hydrogen peroxide production was increased in cybrids harbouring tRNA and complex I mutations, but no changes were observed in cybrids harbouring the mutation in complex IV. No oxidative damage to lipids, proteins or mtDNA was detected in cybrids harbouring A3243G and G6930A mutations. In the cybrid cell line harbouring A8344G mutation, only oxidative damage to mtDNA was observed and in the cybrids harbouring the mutation in complex I, mtDNA and lipid oxidative damage were detected.These results suggest that some mutations in mtDNA may increase the production of hydrogen peroxide (i.e., those mutations which affect complex I or III of the ETC) meanwhile other mutations do not. Furthermore this increase can sometimes override the antioxidant defences of the cells and produce oxidative damage to key cellular components.

Le but de ce mémoire est l'étude des méthodes d'analyse de données d'une expérience de microréseau. Nous nous intéressons au problème des tests d'hypothèses multiples, de contrôle de l'erreur de type 1 et de taux de faux positifs. Nous décrivons les techniques de Dudoit et al. (2003), de Hochberg (1988), de Benjamini et Hochberg (1995) et de Westfall et Young (1993) entre autres. Les problèmes des tests d'hypothèses multiples, les mesures différentes de l'erreur du type 1 et le contrôle de telles erreurs sont discutées ici d'après Dudoit et al. (2003). Nous nous intéressons également à la théorie des inégalités de probabilité dues à Dunn (1967), Jogdeo (1970, 1977) et Simes (1986) parce que ces inégalités forment la base de la méthodologie pour contrôler les différentes erreurs de type 1. De plus, une description d'un progiciel informatique pour faire une telle analyse de données de microréseau est aussi présentée, une analyse utilisant une des méthodes de Dudoit et al. (2003) ainsi que des données de Colub et al. (1999) avec les gènes de deux types de leucémie. Nous avons introduit la méthode de «Jackknife» comme un autre contrôle du taux des faux positifs pour cet exemple. Le mémoire termine avec une étude de simulation afin d'illustrer les différences entre les mesures de l'erreur du type 1. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Microréseaux, Génétique, Inférence statistique, Taux d'erreur, Jackknife, Simulations.

Se aplica la técnica del ADN polimorfico Amplificado al Azar (RAPD) se aplica al estudio molecular de Lama pacos (alpaca), esta metodología se propone debido a que las técnicas de microsatélites y ADN mitocondrial, que actualmente se utilizan, no tienen un uso práctico cuando se trata de analizar gran cantidad de muestras. Para la estandarización del RAPD se utilizo ADN genómico a partir de sangre total y cebadores de 10 nucleotidos siguiendo los protocolos estandarizados modificando básicamente la concentración de MgCl2 a 2.5 mM permitiendo aumentar la intensidad de las bandas y una mejor visualización. Se prosiguió con la identificación de cebadores informativos, de 23 cebadores fueron seleccionados 7 (OPF-05, OPI-04, OPB-03, OPI-18, OPB-11, OPA-18 y OPI-14) por generar numerosas bandas por muestras analizadas. Estos cebadores permitieron obtener perfiles diferentes entre alpacas híbridas y puras; en la muestra poblacional estudiadas no se encontraron alpacas que tuvieran un perfil de bandas similares a los presentados por los animales puros, esto explicaría el grado de hibridación que existe debido a un inadecuado cuidado en el cruce, esto trae como consecuencia, por ejemplo, una baja calidad en la producción de fibra por las alpacas y llamas híbridas disminuyendo el ingreso económico para las familias campesinas. En 8 alpacas los cebadores OPB-03 y OPA-18 mostraron bandas polimorficas de 650 pb y 1000 pb respectivamente, este polimorfismo nos podría indicar alguna mutación o variabilidad intraespecífica, ya que estos animales no presentan diferencias fenotípicas evidentes. / The Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) is applied on the molecular study of Lama pacos (Alpaca), this methodology is proposed because the microsatellites and DNA mitochondrial techniques, which are used commonly, don't have a practical utility when is necessary to analyze great quantity of samples. Genomic DNA obtained from total blood and primers of 10 nucleotides were used to standardize the RAPD technique following the standardized protocols, and concentration of MgCl2 was modified at 2.5 mM which allowed an increase at the intensity and a better visualization of the bands. After the standardization, the identification of informative primers was realized, beginning with 23 primers, selecting only 7 (OPF 05, OPI 04, OPB 03, OPI 18, OPB 11, OPA 18 and OPI 14), because the presence of several bands for the analyzed samples. These primers let obtain different profiles between hybrid and pure alapacas; in the sample were not found alpacas with a similar bands profiles to those presented by the pure animals, this would explain the hybridization grade that exists due to an inadequate care in the crossing, this results in, for example a low quality in the fiber production from the hybrid alpacas and llamas, diminishing the economic entrance for the rural families. In 8 alpacas the primers OPB-03 and OPA-18 showed polymorphic bands of 650 pb and 1000 pb respectively, this polymorphism could indicate some mutation or intraespecific variability, since these animals don't present evident phenotypic differences.

Diez microsatélites para alpacas y llamas fueron usados para evaluar parentesco en 47 alpacas registradas de la Estación Experimental IVITA - Maranganí, provenientes de la provincia de Canchis (Cusco - Perú). El análisis se llevo a cabo utilizando dos metodologías: secuenciador automático (ABI 377 DNA sequencersâ) y técnica de tinción con nitrato de plata. Los microsatélites fueron amplificados en tres reacciones de PCR múltiple y diez reacciones de PCR simple. Los 10 microsatélites fueron polimórficos para ambas metodologías. El número de alelos vario entre 4 y 20, las frecuencias alélicas y probabilidad de exclusión (PE) fueron calculadas utilizando el software Cervus 2.0. Todos los loci, a excepción de dos, se encontraron dentro de los rangos publicados por Lang et al. (1996) y Penedo et al. (1998). La probabilidad de exclusión acumulada para los 10 loci de 0.9999. La probabilidad de exclusión acumulada para cada reacción de PCR múltiple fue mayor a 0.90. Ambas metodologías obtuvieron los mismos resultados. Los resultados confirmaron la paternidad en 17 casos, sin embargo, en más de un 22% de los casos, padres alternativos fueron identificados como padres comparando con los registros. / Ten microsatellites for alpacas and llamas were used to evaluate paternity in 47 alpacas registered at IVITA Research Station Maranganí, Canchis Province (Cusco – Perú). Analysis was carried out using both methodologies: Automatic Sequencer (ABI 377 DNA sequencersâ) and silver staining techniques. Microsatellites were amplified in three multiplex reactions and ten single PCR reactions. They were polymorphic for all alpaca samples using both methodologies. The number of alleles varied between 4 and 20, the allelic frequencies and the exclusion probability were calculated using Cervus 2.0. All loci, except for two, were within the range published by Lang et al. (1996) and Penedo et al. (1998). The accumulated exclusion probability for the ten loci was 0.9999. For each multiplex reaction the accumulated exclusion probability was more than 0.90. Both methodologies yielded the same results. It was possible obtain the same results using both methodologies. The results confirmed paternity in 17 cases of parent-offspring pairs, however in a further 22% of cases alternative adults were identified as parents compared with the register.

Diss.--Turku--Å̊bo Akademi University, 2003. / Contient cinq articles du même auteur publiés dans des revues scientifiques. Bibliogr. p. 35-43.

Thèse doctorat : Analyse et Modélisation des Systèmes Biologiques : Villeurbanne, INSA : 1997. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p. 118-132.

Thèse doctorat : Médecine. Virologie : Université de Nantes : 2005. / Bibliogr. 146-173 f.

Thèse de doctorat : Médecine. Biologie moléculaire : Université de Nantes : 2004. / Bibliogr. f. 168-189.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Chimie fine : Le Mans : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p. 189-192.