Submitted by Luciana Sebin (lusebin@ufscar.br) on 2016-10-13T12:06:00Z No. of bitstreams: 1 TeseMMC.pdf: 4981123 bytes, checksum: d5a8170e8917fcba950766e44afd3868 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2016-10-14T20:37:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseMMC.pdf: 4981123 bytes, checksum: d5a8170e8917fcba950766e44afd3868 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2016-10-14T20:38:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseMMC.pdf: 4981123 bytes, checksum: d5a8170e8917fcba950766e44afd3868 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-17T12:54:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseMMC.pdf: 4981123 bytes, checksum: d5a8170e8917fcba950766e44afd3868 (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / The main goal of the present work was to perform an expression analysis of the Arg1, Arg2 and iNOS genes in the liver, anterior kidney and spleen of pacu (Piaractus mesopotamicus) in 4 different times post-infection, in response to the experimental infection with the bacterium Aeromonas dhakensis. The strain used in the present study was isolated from a specimen of P. mesopotamicus from the CEPTA/ICMBio in Pirassununga – SP, characterized by biochemical tests using the VITEK 2 automated identification system, and identified as belonging to the genus Aeromonas. Further molecular analyses of the 16S rRNA, gyrB and rpoD genes showed that the isolated strain belonged to the species A. dhakensis, a species that had never been reported in South America. This strain was resistant to the antibiotics ampicillin, ampicillin/sulbactam, cefoxitin and meroponem, with a high virulence level against experimentally infected pacus, causing clinical signs of acute hemorrhagic septicemia. The fifty per cent lethal dose (LD50) was 1.1 × 105 CFU/fish. Once characterized, this A. dhakensis strain was used in the infection experiments in P. mesopotamicus in order to analyze the expression of the Arg1, Arg2 and iNOS genes. These genes were sequenced and, from the partial sequences, P. mesopotamicus specific primers were designed for the quantitative real time PCR (qPCR) expression analyses. Following the infection with A. dhakensis, the Arg1 gene expression levels decreased in the kidney 24 h post-infection; the Arg2 gene expression of reduced in the liver at 12 h and 24 h post-infection and increased in the spleen at 24 h and 48 h post-infection; the gene expression of iNOS was significantly increased in she spleen at 12 h, 24 h, and 48 h post-infection. The results of the present study showed that the Arg2 and iNOS genes were the most variable in response to the A. dhakensis infection, indicating that these are involved in the initial immune response to bacterial infections in P. mesopotamicus. The organ that was most involved in this response was the spleen, which showed the highest levels of variation in these genes after the challenge. This is the first study assessing the expression levels of the Arg1, Arg2 and iNOS genes in P. mesopotamicus following the infection with A. dhakensis, providing a valuable contribution for the understanding of the immune response mechanisms against bacterial pathogens in this important South American fish species. / O presente trabalho teve como objetivo realizar uma análise da expressão dos genes das enzimas Arg1, Arg2 e iNOS no fígado, rim anterior e baço de pacu (Piaractus mesopotamicus) em 4 períodos diferentes pós-infecção, em resposta à infecção experimental pela bactéria Aeromonas dhakensis. A cepa bacteriana utilizada no presente estudo foi isolada de um exemplar de P. mesopotamicus obtido do CEPTA/ICMbio em Pirassununga – SP, caracterizada por testes bioquímicos pelo sistema de identificação automatizado VITEK 2 e identificada como sendo do gênero Aeromonas. Posteriores análises moleculares dos genes 16S rRNA, gyrB e rpoD demonstraram que a bactéria isolada era da espécie A. dhakensis, cuja ocorrência na América do Sul nunca havia sido relatada. Essa cepa se mostrou resistente aos antibióticos ampicilina, ampicilina/sulbactam, cefoxitina e meropenem, com elevado nível de virulência para pacus experimentalmente infectados, causando sinais clínicos de septicemia hemorrágica aguda. A dose letal para 50% dos animais infectados (DL50) foi de 1,1 × 105 UFC/peixe. Uma vez caracterizada, essa cepa de A. dhakensis foi utilizada no experimento de infecção em P. mesopotamicus para análise de expressão dos genes Arg1, Arg2 e iNOS. Esses genes foram sequenciados e, a partir das sequências parciais, primers específicos para P. mesopotamicus foram desenhados para as análises de expressão por PCR em tempo real quantitativo (qPCR). O gene Arg1 apresentou os maiores níveis de expressão basal no fígado, já o gene Arg2 foi mais expresso no rim e o gene iNOS apresentou os maiores níveis de expressão basal no rim e no fígado. Após a infecção por A. dhakensis, o gene Arg1 apresentou uma leve diminuição na expressão no rim no período de 24 h pósinfecção; o gene Arg2 apresentou uma redução na sua expressão no fígado nos períodos de 12 h e 24 h pós-infecção e um aumento na expressão no baço nos períodos de 24h e 48 h pósinfecção; e o gene iNOS apresentou aumento significativo nos níveis de expressão no baço nos períodos de 12 h, 24 h e 48 h pós-infecção. Os resultados do presente trabalho mostram que os genes Arg2 e iNOS foram os que apresentaram maior variação em resposta à infecção por A. dhakensis, indicando que estes genes estão envolvidos na resposta inicial à infecções por essa bactéria em P. mesopotamicus. O baço foi o órgão mais envolvido nessa resposta, apresentando os maiores variações nos níveis de expressão desses genes após o desafio. Este é o primeiro estudo avaliando os níveis de expressão dos genes Arg1, Arg2 e iNOS em P. mesopotamicus após infecção por A. dhakensis, fornecendo uma valiosa contribuição para o entendimento dos mecanismos de resposta imunológica contra patógenos desse importante peixe sul-americano.