O objetivo do trabalho foi avaliar a capacidade de cepas de bactérias ácido-láticas (BAL) em remover a aflatoxina M1 (AFM1) em solução tampão fosfato salina (TFS) e em amostras de leite. Nos ensaios com TFS, verificou-se a influência do tempo de contato (15 min. ou 24 horas) entre as células de sete cepas de BAL e AFM1, as diferenças entre a eficiência de remoção das bactérias viáveis e inviabilizadas termicamente, e a estabilidade do complexo BAL/AFM1 formado. As três cepas de BAL com maior percentual (> 33%) de remoção da AFM1 nos ensaios com TFS foram re-avaliadas utilizando-se leite UHT (ultra-high-temperature) desnatado artificialmente contaminado com AFM1. Para isso, foram utilizadas somente células inviabilizadas termicamente, verificando-se o efeito da temperatura (4ºC ou 37ºC) sobre a capacidade de remoção da toxina por 15 minutos. A remoção média da AFM1 pelas cepas de BAL em TFS variou entre 5,60±0,45 e 45,67±1,65% (n=3), sendo que as células inviáveis obtiveram percentuais de remoção de AFM1 significativamente maiores que as células viáveis, em ambos os tempos de contato analisados (15 min. ou 24 horas), não havendo diferença significativa entre os tempos. Observou-se que o complexo BAL/AFM1 obtido nos ensaios com TFS é instável, pois 40,57±4,66 a 87,37±1,82% da AFM1 retida pela bactéria foram recuperados em solução após a lavagem do complexo com TFS. As três cepas de BAL com maior percentual de remoção da AFM1 em TFS (Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus e Bifidobacterium lactis) não apresentaram diferenças significativas nos ensaios com leite UHT a 37ºC. Somente B. lactis apresentou maior capacidade de remover a AFM1 do leite UHT a 4ºC. Os resultados demonstraram que a remoção de AFM1 empregando-se as BAL em alimentos é viável para reduzir as concentrações da toxina a níveis seguros. Entretanto, estudos adicionais são necessários a fim de investigar os mecanismos envolvidos na remoção da toxina pelas BAL com vistas à aplicação em indústrias de alimentos. / The purpose of this study was to evaluate the ability of strains of lactic acid bacteria (LAB) to remove aflatoxin M1 (AFM1) in phosphate buffer saline (PBS) and in milk samples. In the assays with PBS, the influence of contact time (15 min. or 24 hours) between the cells of seven LAB strains and AFM1 was evaluated, as well as the differences between the removal efficiency of viable and non-viable (heat-killed) bacteria, and the stability of AFM1/LAB complex produced. The three LAB strains with the highest percentage (> 33%) of AFM1 removal in the tests with PBS were reevaluated using UHT (ultra-high-temperature) skimmed milk spiked with AFM1. For these assays, only non-viable bacterial cells were used for checking the effect of temperature (4ºC or 37ºC) on the toxin removal capacity during 15 min. The mean AFM1 removal by LAB strains in PBS ranged from 5.60±0.45 and 45.67±1.65% (n=3). Non-viable cells showed AFM1 removal percentages significantly higher than viable cells in both contact times (15 min. or 24 hours), although there were not significant differences between these contact times. The AFM1/LAB complex resulted from the tests with PBS was unstable, as 40.57±4.66 to 87.37±1.82% of AFM1 retained by the bacteria were recovered in solution after washing the complex with PBS. The three LAB strains with the highest percentage of AFM1 removal in the PBS assays (Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus and Bifidobacterium lactis) showed no significant differences in the UHT skimmed milk assays at 37ºC. Only B. lactis had greater ability to remove AFM1 in UHT milk at 4ºC. The results demonstrated that the removal of AFM1 by using LAB in foods is viable to reduce the toxin concentrations until safe levels. However, additional studies are needed to investigate the mechanisms involved in the toxin removal by LAB aiming its application in food industries.

A aflatoxina M1 (AFM1) é um metabólito hidroxilado da aflatoxina B1 (AFB1), e é detectada no leite, após a ingestão de alimentos contaminados com a AFB1. Foram avaliadas durante o período de dez meses (julho/2009 a abril/2010): a ocorrência de AFM1 em leite bovino cru, produzido em 45 fazendas de três mesorregiões produtoras de leite do Estado de São Paulo (Araçatuba, Bauru e Vale do Paraíba); a variação da contaminação entre as mesorregiões produtoras; e a correlação da concentração de AFM1 com parâmetros de qualidade (contagem bacteriana total e contagem de células somáticas) e composição (teores de gordura, proteína, lactose e sólidos totais). A análise de AFM1 foi realizada empregando-se coluna de imunoafinidade para purificação associada à cromatografia líquida de alta eficiência, com detector de fluorescência. Os valores do limite de detecção e de quantificação foram 0,003 µg L-1 e 0,01 µg L-1, respectivamente. A recuperação média da metodologia avaliada com amostras artificialmente contaminada em três concentrações (0,04, 0,1 e 0,2 µg L-1) foi 83%. A AFM1 foi detectada em 210 (49%) das 429 amostras analisadas numa faixa de concentração de traços a 0,617 µg L-1 com média de 0,017 µg L-1 e mediana igual a não detectada (LD<0,003 µg L-1). A concentração média de AFM1 das amostras da mesorregião de Bauru (0,031 µg L-1) foi estatisticamente maior do que da mesorregião de Araçatuba (0,015 µg L-1) e do Vale do Paraíba (traços). Apenas 3 amostras (0,7%) encontraram-se acima do limite máximo permitido no Brasil (0,5 µg L-1) e 28 amostras (6,5%) apresentaram contaminação acima do limite da Comunidade Européia (0,05 µg L-1). A média dos valores de contagem de células somáticas e de contagem bacteriana total foi de 497 103 células mL-1 e 515 103 UFC mL-1, com faixa de 72 a 1411 103 células mL-1 e 17 a 5014 103 UFC mL-1, respectivamente. Os valores médios dos parâmetros de composição do leite foram: gordura 3,59%, proteína 3,15%, lactose 4,50% e sólidos totais 12,22%. Não foi observada correlação significativa entre a ocorrência de AFM1 e os parâmetros de qualidade e de composição do leite. / The AFM1 is a hydroxylated metabolite of aflatoxin B1 (AFB1), and is detected in milk, after ingestion of food/feed contaminated with B1. During the period of ten months (July/2009 to April/2010), it was evaluated: the occurrence of aflatoxin M1 (AFM1) in raw cow milk produced in 45 farms of three mesoregions of São Paulo State (Araçatuba, Bauru and Vale do Paraíba); the variability of contamination among mesoregions; and the correlation of AFM1 contamination with quality parameters (total bacterial count and somatic cell count) and composition (fat, protein, lactose and total solid contents) of raw milk. The AFM1 analysis were performed using an immunoaffinity column for clean up, and high performance liquid chromatography, with fluorescence detection. The detection and quantification limits were 0.003 µg L-1 and 0.01 µg L-1, respectively. The mean recovery of the methodology obtained with spiked aflatoxin-free milk samples at three concentrations (0.04, 0.1 and 0.2 µg L-1) was 83%. The AFM1 was detected in 210 (49%) of 429 samples ranged from traces to 0.617 µg L-1 with a mean level of 0.017 µg L-1 and median not detected (LOD <0.003 µg L-1). The mean AFM1 concentration of samples from Bauru mesoregion (0.031 µg L-1) was statistically higher than Araçatuba (0.015 µg L-1) and Vale do Paraíba (traces) mesorregions. Only 3 samples (0.7%) were above the maximum limit allowed in Brazil (0.5 µg L-1) and 28 samples (6.5%) were above the limit of the European Community (0.05 µg L-1). The mean values of somatic cell count and total bacterial count was 497 103 cells mL-1 and 515 103 CFU mL-1 ranged from 72-1411 103 cells mL-1 and from 17-5014 103 CFU mL-1, respectively. The mean values of the parameters of milk composition were: fat 3.59%, protein 3.15%, lactose 4.50% and total solids 12.22%. There was no significant correlation among the occurrence of aflatoxin M1 and the quality and composition parameters of milk.

As aflatoxinas são substâncias naturais que apresentam efeitos tóxicos aos humanos e são reconhecidamente carcinogênicas. Estas substâncias podem estar presentes na dieta humana ou, em casos específicos, no ar respirado. Desta maneira, a exposição humana às aflatoxinas é objeto de muita preocupação. Uma das maneiras mais eficazes de avaliar a exposição humana as aflatoxinas é através da mensuração da presença de biomarcadores da exposição a estas substâncias em fluidos biológicos. Dentre as possibilidades de biomarcadores de exposição às aflatoxinas tem-se que aflatoxina M1 (AFM1), presente na urina e leite humano, é considerada um biomarcador válido. Assim sendo, o objetivo deste trabalho de pesquisa foi avaliar a presença de AFM1 em amostras de urina provenientes de indivíduos residentes na região urbana e rural da cidade de Piracicaba-SP, assim como, de leite de gestantes de Piracicaba e cidades da região. Nos indivíduos doadores de amostras de urina foi levantado também o padrão de ingestão de alimentos com alto risco de conter aflatoxinas, através da aplicação de inquéritos de freqüência alimentar e recordatórios 24 horas. A análise de AFM1 em urina e leite foi realizada por cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE) com detecção por fluorescência. A extração e purificação do extrato foram realizadas com auxílio de colunas de imunoafinidade. No total 69 amostras de urina e 18 de leite foram analisadas. Entre as amostras de urina detectou-se a presença de AFM1 em 54 (78%) das amostras, com concentrações variando de 1,8 até 39,9 pg/mL. Não foi observada diferença estatística entre as concentrações médias detectadas entre urinas de indivíduos da zona urbana e rural, bem como no nível de consumo de produtos de risco. Apesar das concentrações de AFM1 detectadas serem inferiores as concentrações médias reportadas em outros países a freqüência de amostras positivas foi bastante elevada mostrando que as populações estudadas estão sendo expostas às aflatoxinas. Assim, melhores avaliações dos níveis de exposição necessitam ser realizados considerando que a amostragem utilizada foi pontual, pode existir variação de contaminação sazonal com aflatoxinas na dieta e a contaminação é heterogênea dentro no alimento. Não foi observada uma correlação entre o nível do consumo de produtos de risco e as concentrações detectadas em amostras de urina. Apenas uma amostra de leite apresentou contaminação detectada; entretanto, o nível de contaminação estava entre o limite de detecção (LD) e o limite de quantificação (LQ). / Aflatoxins are natural substances that present toxic and carcinogenic effects to humans. These substances may be present in human diet or, in specific cases, in the breathing air. Thus, the human exposition to aflatoxins is object of concern. One of the most effective ways to evaluate human exposition to aflatoxins is to measure the presence of biomarkers in biological fluids. Among the possibilities of aflatoxin presence biomarkers, the aflatoxin M1 (AFM1), present in human urine and milk, is considered a valid biomarker. The objective of this work was to evaluate the presence of AFM1 in urine samples from individuals who live in urban and rural areas in the county of Piracicaba, state of São Paulo, Brazil, and in milk of pregnant women from Piracicaba and neighbor cities. Urine-donor individuals were researched in relation to the ingestion of food with high risk of containing aflatoxins through the application of a food frequency questionnaire and 24-hour recall. The analysis of AFM1 in urine and milk was performed through high-performance liquid chromatography (HPLC) with fluorescence detection. The extract purification and extraction were performed with the aid of immunoaffinity columns. Overall, 69 urine and 18 human breast milk samples were analyzed. Among urine samples, the presence of AFM1 was detected in 54 (78%), with concentrations ranging from 1.8 to 39.9 pg/mL. No statistical difference was observed between average concentrations detected in the urine of individuals from urban and rural areas, as well as the consumption of aflatoxin risky food. Although the AFM1 concentrations detected are lower than those reported for other countries, the frequency of positive samples was quite high, showing that the populations studied are exposed to aflatoxins. Thus, further evaluations on the exposition levels should be performed, and considering that the sampling used in this work was punctual, there may be seasonal contamination variations in diet and the contamination level is heterogeneous within a food. No correlation between the consumption of risky food and concentrations detected in urine samples was observed. Only one milk sample presented detected contamination; however, the contamination level was between the limit of detection (LOD) and the limit of quantification (LOQ).

As aflatoxinas são substâncias naturais que apresentam efeitos tóxicos aos humanos e são reconhecidamente carcinogênicas. Estas substâncias podem estar presentes na dieta humana ou, em casos específicos, no ar respirado. Desta maneira, a exposição humana às aflatoxinas é objeto de muita preocupação. Uma das maneiras mais eficazes de avaliar a exposição humana as aflatoxinas é através da mensuração da presença de biomarcadores da exposição a estas substâncias em fluidos biológicos. Dentre as possibilidades de biomarcadores de exposição às aflatoxinas tem-se que aflatoxina M1 (AFM1), presente na urina e leite humano, é considerada um biomarcador válido. Assim sendo, o objetivo deste trabalho de pesquisa foi avaliar a presença de AFM1 em amostras de urina provenientes de indivíduos residentes na região urbana e rural da cidade de Piracicaba-SP, assim como, de leite de gestantes de Piracicaba e cidades da região. Nos indivíduos doadores de amostras de urina foi levantado também o padrão de ingestão de alimentos com alto risco de conter aflatoxinas, através da aplicação de inquéritos de freqüência alimentar e recordatórios 24 horas. A análise de AFM1 em urina e leite foi realizada por cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE) com detecção por fluorescência. A extração e purificação do extrato foram realizadas com auxílio de colunas de imunoafinidade. No total 69 amostras de urina e 18 de leite foram analisadas. Entre as amostras de urina detectou-se a presença de AFM1 em 54 (78%) das amostras, com concentrações variando de 1,8 até 39,9 pg/mL. Não foi observada diferença estatística entre as concentrações médias detectadas entre urinas de indivíduos da zona urbana e rural, bem como no nível de consumo de produtos de risco. Apesar das concentrações de AFM1 detectadas serem inferiores as concentrações médias reportadas em outros países a freqüência de amostras positivas foi bastante elevada mostrando que as populações estudadas estão sendo expostas às aflatoxinas. Assim, melhores avaliações dos níveis de exposição necessitam ser realizados considerando que a amostragem utilizada foi pontual, pode existir variação de contaminação sazonal com aflatoxinas na dieta e a contaminação é heterogênea dentro no alimento. Não foi observada uma correlação entre o nível do consumo de produtos de risco e as concentrações detectadas em amostras de urina. Apenas uma amostra de leite apresentou contaminação detectada; entretanto, o nível de contaminação estava entre o limite de detecção (LD) e o limite de quantificação (LQ). / Aflatoxins are natural substances that present toxic and carcinogenic effects to humans. These substances may be present in human diet or, in specific cases, in the breathing air. Thus, the human exposition to aflatoxins is object of concern. One of the most effective ways to evaluate human exposition to aflatoxins is to measure the presence of biomarkers in biological fluids. Among the possibilities of aflatoxin presence biomarkers, the aflatoxin M1 (AFM1), present in human urine and milk, is considered a valid biomarker. The objective of this work was to evaluate the presence of AFM1 in urine samples from individuals who live in urban and rural areas in the county of Piracicaba, state of São Paulo, Brazil, and in milk of pregnant women from Piracicaba and neighbor cities. Urine-donor individuals were researched in relation to the ingestion of food with high risk of containing aflatoxins through the application of a food frequency questionnaire and 24-hour recall. The analysis of AFM1 in urine and milk was performed through high-performance liquid chromatography (HPLC) with fluorescence detection. The extract purification and extraction were performed with the aid of immunoaffinity columns. Overall, 69 urine and 18 human breast milk samples were analyzed. Among urine samples, the presence of AFM1 was detected in 54 (78%), with concentrations ranging from 1.8 to 39.9 pg/mL. No statistical difference was observed between average concentrations detected in the urine of individuals from urban and rural areas, as well as the consumption of aflatoxin risky food. Although the AFM1 concentrations detected are lower than those reported for other countries, the frequency of positive samples was quite high, showing that the populations studied are exposed to aflatoxins. Thus, further evaluations on the exposition levels should be performed, and considering that the sampling used in this work was punctual, there may be seasonal contamination variations in diet and the contamination level is heterogeneous within a food. No correlation between the consumption of risky food and concentrations detected in urine samples was observed. Only one milk sample presented detected contamination; however, the contamination level was between the limit of detection (LOD) and the limit of quantification (LOQ).