Reproduction de : Thèse de doctorat : Pathologie, mycologie, génétique et nutrition : Toulouse, INPT : 2007. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 342 réf.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Génie des procédés et de l'environnement : Toulouse, INPT : 2007. Reproduction de : Thèse de doctorat : Sciences de la Vie : Beyrouth, USJ Beyrouth : 2007. / Thèse soutenue en co-tutelle. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 175 réf.

Les aflatoxines sont des mycotoxines contaminants de nombreuses matières premières, particulièrement en région tropicale et sub-tropicale où les conditions climatiques sont très favorables à leur synthèse. Dans cette famille de contaminant, l’aflatoxine B1 est le composé le plus important car cancérigène chez l’homme et l’animal. L’objectif général de ce travail est de développer une nouvelle stratégie de lutte contre ces mycotoxines en identifiant des composés d’origine naturelle capables d’inhiber spécifiquement la synthèse de ces toxines. Dans un premier temps, notre travail a visé à identifier des composés d’intérêt. Pour cela, nous avons réalisé l’analyse de la contamination fongique et mycotoxique d’épices commercialisées au Maroc. Ce travail a permis d’identifier des substrats d’intérêt. En effet, certaines épices se caractérisent par la présence fréquente de souches toxinogènes d’Aspergillus de la section Flavi mais ne sont cependant que très rarement contaminées par les aflatoxines. Dans une seconde partie, nous avons démontrer que des extraits aqueux préparés à partir de ces épices étaient effectivement capables d’inhiber de façon dose-dépendante la synthèse de l’aflatoxine B1 par une souche toxinogène d’Aspergillus flavus. Cet effet a aussi été observé sur la synthèse des autres aflatoxines et dans toutes les espèces fongiques de la section Flavi capables de produire ces composés. Les premiers essais visant à identifier le mécanisme d’action semblent montrer que cette inhibition n’est pas liée à une modulation du stress oxydant.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Génie des procédés et de l'environnement : Toulouse, INPT : 2007. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 134 réf.

Les aflatoxines sont des mycotoxines contaminants de nombreuses matières premières, particulièrement en région tropicale et sub-tropicale où les conditions climatiques sont très favorables à leur synthèse. Dans cette famille de contaminant, l'aflatoxine B1 est le composé le plus important car cancérigène chez l'homme et l'animal. L'objectif général de ce travail est de développer une nouvelle stratégie de lutte contre ces mycotoxines en identifiant des composés d'origine naturelle capables d'inhiber spécifiquement la synthèse de ces toxines. Dans un premier temps, notre travail a visé à identifier des composés d'intérêt. Pour cela, nous avons réalisé l'analyse de la contamination fongique et mycotoxique d'épices commercialisées au Maroc. Ce travail a permis d'identifier des substrats d'intérêt. En effet, certaines épices se caractérisent par la présence fréquente de souches toxinogènes d'Aspergillus de la section Flavi mais ne sont cependant que très rarement contaminées par les aflatoxines. Dans une seconde partie, nous avons démontrer que des extraits aqueux préparés à partir de ces épices étaient effectivement capables d'inhiber de façon dose-dépendante la synthèse de l'aflatoxine B1 par une souche toxinogène d'Aspergillus flavus. Cet effet a aussi été observé sur la synthèse des autres aflatoxines et dans toutes les espèces fongiques de la section Flavi capables de produire ces composés. Les premiers essais visant à identifier le mécanisme d'action semblent montrer que cette inhibition n'est pas liée à une modulation du stress oxydant. / Aflatoxins are mycotoxins that may contaminate many commodities, especially in tropical and sub-tropical region, where the climatic conditions are very favourable for their synthesis. Aflatoxin B1 is the most important member of this family of compounds, due to its carcinogenic properties in both humans and animals. The general objective of this work is to develop a new strategy to prevent mycotoxin contamination based on the identification of natural compounds able to specifically down modulated toxin synthesis pathway. As a first step, our work aimed to identify compounds of interest. For that we studied fungal and mycotoxin contamination of spices marketed in Morocco. The results obtained demonstrated that some spices were frequently contaminated with toxigenic isolates of Aspergillus (section Flavi) but rarely contaminated with aflatoxins. In a second part, we demonstrated that aqueous extracts made from these spices were able to inbitit in a dose-dependant manner aflatoxin B1 synthesis by a toxigenic strain of Aspergillus flavus. This effect was also observed on the production of other aflatoxins and in all species of the Flavi section able to produce these toxins. The first assays aiming to identity the mechanism of action seem to show that this inhibition is not linked to oxidative stress.

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est la principale forme de cancer primitif du foie. Le CHC présente des variations d'incidence géographique qui reflètent les variations de prévalence des infections chroniques par les virus de l'hépatite B (VHB) et/ou C (VHC), ainsi que l'exposition alimentaire aux aflatoxines. Dans les régions de haute incidence, une mutation spécifique au le codon 249 du gène TP53 est très fréquemment détectée dans les CHC et a été proposée comme un marqueur moléculaire de l'exposition aux aflatoxines. La protéine mutée correspondante, p.R249S, interagit avec l'oncogène viral HBx, qui module la réplication virale, la prolifération et la survie cellulaire. Des séquences HBX sont détectables dans l'ADN génomique de plus de 80% des CHC liés au VHB. Nous avons étudié les associations de mutation R249S avec les caractéristiques moléculaires de HBX et la progression du CHC en utilisant des spécimens obtenus dans deux études cas-témoins développées Thaïlande et en Gambie. Nos résultats démontrent (1) que la mutation R249S est préférentiellement associée aux CHC qui se développent en l'absence de cirrhose hépatique préexistante ; (2) que la mutation est associée à la présence de polymorphismes dans l'intron 1 de TP53, suggérant l'influence de facteurs de susceptibilité génétique sur la formation des mutations ; (3) que la mutation est généralement associée à la rétention dans les cancers de séquences de HBX complètes. Ces résultats suggèrent que la protéine mutée p.R249S coopère avec HBx pour favoriser le développement de CHC sans cirrhose, et que la susceptibilité à la formation de cette mutation est influencée par la structure polymorphique de TP53 / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the main form of primary liver cancer. HCC presents geographical variations in incidence that reflect variations in the prevalence of chronic infections by hepatitis B virus (HBV) and / or C (HCV) and dietary exposure to aflatoxins. In areas of high incidence, a specific mutation at codon 249 of TP53 gene is frequently detected in HCC and has been proposed as a molecular hallmark of aflatoxin exposure. The corresponding mutated protein p.R249S, interacts with the viral oncogene HBx, which modulates viral replication, proliferation and cell survival. HBX sequences are detectable in the genomic DNA of more than 80% of HBVrelated HCC. We investigated the associations of mutation R249S with the molecular characteristics of HBX and progression of HCC using specimens obtained in two case-control studies developed in Thailand and in The Gambia. Our results demonstrate (1) that the mutation R249S is preferentially associated with HCC that develop in the absence of pre-existing liver cirrhosis, (2) that the mutation is associated with the presence of polymorphisms in intron 1 of TP53, suggesting influence of genetic susceptibility factors on the formation of mutations, (3) that the mutation is usually associated with the retention of cancers with complete HBX sequences. These results suggest that the mutated protein p.R249S cooperates with HBx to promote the development of HCC without cirrhosis, and that susceptibility to the formation of this mutation is influenced by the polymorphic structure of TP53

Le présent travail vise à expliquer les facteurs favorisant la contamination par les aflatoxines dans la filière arachide en Haïti. Les résultats obtenus à partir d’une revue de la littérature, d’observations et d’entretiens avec des acteurs de la filière dans les départements Nord et Nord-Est du pays ont permis de relever différentes pratiques favorables à la contamination des produits telles que : l’absence de rotation culturale, la récolte précoce ou tardive, le séchage et le stockage inadéquats, la faible rigueur dans la sélection des arachides pendant et après la récolte. D’autres pratiques néfastes comme le mouillage des arachides et le mélange incontrôlé voire délibéré d’arachides de bonne et de mauvaise qualités augmentent substantiellement les risques de contamination pendant la commercialisation. Les résultats des tests d’aflatoxines réalisés sur certains produits ont montré des taux élevés allant de 22 ppb à 36 864 ppb pour 55 des 100 échantillons collectés sur le terrain, ce qui témoigne du grave problème auquel est confrontée la filière. Plusieurs facteurs à la base des mauvaises pratiques et de la contamination des produits ont été analysés. Ces facteurs sont d’ordre organisationnel, socioéconomique, institutionnel, politique, technologique et environnemental. Nous avons ainsi pu construire un schéma systémique qui montre comment ces multiples facteurs se conjuguent pour entrainer des pratiques qui favorisent la contamination par les aflatoxines et fourni des pistes d’intervention pour une amélioration de la qualité des produits dans la filière. / This work aims to explain the factors that facilitate aflatoxins contamination in the peanut sector in Haiti. The results obtained from by literature review, observations and interviews with actors in North and North-East areas of the country have revealed several practices favorable to the contamination of products such as : lack of crop rotation, early or late harvest, inadequate drying and storage, poor rigor in peanut selection during and after harvest. Other harmful practices such as wetting peanut and uncontrolled or even deliberate mixing of good and poor-quality peanuts substantially increase the risk of contamination during marketing. Aflatoxin test results on some products showed high rates ranging from 22 ppb to 36 864 ppb in 55 out of 100 field-collected samples, indicating the serious quality problem in the chain. Several factors sustaining the bad practices and product contamination were analyzed. Dimensions are organizational, socio-economic, institutional, political, technological and environmental. We have thus been able to build a systemic diagram that shows how these multiple factors combine to lead practices that strengthen aflatoxins contamination and provided paths of intervention for improving products quality in the commodity chain.

Certains champignons, notamment des Ascomycètes, peuvent synthétiser des métabolites secondaires toxiques pour les hommes et les vertébrés, appelés mycotoxines. Étant donné que la présence de ces champignons dans les aliments de base constitue un risque potentiel pour la santé humaine et animale, les aliments de base sont éliminés lorsqu'ils sont contaminés. La section Flavi est un des groupes de champignons les plus importants du point de vue économique et sanitaire car il comprend des espèces productrices de mycotoxines. Parmi les mycotoxines produites par ce groupe se trouvent les aflatoxines (AF), considérées comme une préoccupation majeure en raison de leurs effets délétères chez les vertébrés. Les espèces de la section Flavi se développent principalement dans les régions tropicales et subtropicales car elles bénéficient de conditions environnementales optimales. De plus, les conditions de récolte et de stockage sont souvent inappropriées, favorisant ainsi leur développement. Dans les régions tempérées, ces espèces se rencontrent moins fréquemment. Cependant, le réchauffement climatique pourrait favoriser leur colonisation. L'identification des espèces d'Aspergillus de la section Flavi est un défi, en raison de l'inter- et intra-variabilité des caractères. Par conséquent, l'utilisation d'une seule méthode d'identification (caractérisation morphologique, moléculaire ou du profil des métabolites secondaires) est insuffisante. Inversement, le développement d'outils moléculaires a facilité la tâche. Le but de notre étude était de déterminer les relations entre les espèces d'Aspergillus de la section Flavi à partir de différents marqueurs moléculaires (ITS, benA, cmdA, amdS, préA, perB, ppgA, aflP, gènes Mat1), puis d'identifier ceux qui permettent une classification des espèces par inférence phylogénétique. L'utilisation de l'inférence phylogénétique dans cette étude a montré qu'il s'agit d'une approche robuste pour identifier les espèces d'Aspergillus de la section Flavi, notamment en confirmant certaines hypothèses déjà proposées pour les espèces de la section Flavi. En effet, l'ajout de marqueurs moléculaires a permis de confirmer le placement phylogénétique des espèces dans la section Flavi. De plus, une nouvelle espèce cryptique a pu être décrite : Aspergillus korhogoensis (appartenant au clade A. flavus). Notre étude a également pu mettre en évidence que les marqueurs moléculaires sélectionnés (benA, cmdA, mcm7, rpb1, preB, preA et ppgA) sont de bons candidats pour l'étude d'autres sections d'Aspergillus. L'utilisation de l'inférence phylogénétique est une méthode élégante permettant d'identifier de façon précise les espèces. Sur la base de nos résultats, il est recommandé d'utiliser des matrices concaténées pour effectuer une inférence phylogénétique dans cette section, et la meilleure combinaison inclut les gènes benA, cmdA, et l'inclusion d'un autre gène : mcm7, rpb1, preB, preA ou ppgA. A l'inverse, l'utilisation du gène ITS chez Aspergillus peut conduire à une sous-estimation de la diversité car le gène est très fortement conservé. L'étude des gènes du loci Mat1 dans la section est utile pour accroître les connaissances sur la reproduction sexuée chez les ascomycètes. De plus, plusieurs fonctions de la machinerie biologique fongique sont liées aux gènes du loci Mat1. La caractérisation du profil métabolique secondaire chez les souches d'Aspergillus de la section Flavi doit être utilisée, non seulement comme outil d'identification, mais également pour discriminer les souches toxinogènes et atoxinogènes. La section Flavi renferme des espèces capables de produire à la fois de mycotoxines et de composés bénéfiques. Parmi les mycotoxines qui devraient faire l'objet d'une attention particulière figurent les AF, l'acide cyclopiazonique, les versicolorines a et b, la stérigmatocystine. Une étude plus approfondie du métabolisme secondaire sera également utile pour la recherche de nouveaux composés bénéfiques. / Some fungi, mostly Ascomycota, are able to synthesize secondary metabolites that are toxic to humans and vertebrates, called mycotoxins. Since the presence of these fungi in staples represents a potential risk to human and livestock health, staples are eliminated when they are contaminated. The section Flavi is one most important group of fungi from an economic and public health point of view because it comprises several mycotoxin producer species. Amongst the mycotoxins produced by this group are aflatoxins (AFs), considered a main concern because of their deleterious effects on humans and vertebrates. Species from section Flavi grow mainly in tropical and subtropical regions where environmental conditions are optimal, and harvest and storage conditions are not always appropriate to avoid production of mycotoxins, which enhance their growth. In temperate regions, these species are less frequent; however, climate changes can favor their colonization. Species identification in Aspergillus section Flavi is challenging because of inter- and intra- variability of traits. Therefore, the use of one identification method (morphological, molecular or secondary metabolite profile characterization) is futile. Conversely, the development of molecular tools has facilitated the task. The aim of this study was to screen the species relationships in Aspergillus section Flavi based on different molecular markers (ITS, benA, cmdA, amdS, preA, preB, ppgA, aflP, Mat1 genes), and subsequently identify which ones allow a fine species classification in the section Flavi by phylogenetic inference. The use of phylogenetic inference in the present study showed that it is a robust approach to identify Aspergillus section Flavi species. The use of this technique confirmed some of the hypotheses proposed in the Flavi section, since more genetic information was added, thus strengthening the placement of the species in the Flavi section. In addition, we described a new cryptic species in this section Aspergillus korhogoensis that is nested in A. flavus clade as the sister taxon of A. parvisclerotigenus. Likewise, the molecular markers (benA, cmdA, mcm7, rpb1, preB, preA or ppgA) were good candidates for studying other sections in Aspergillus. The use of phylogenetic inference is a good method for fine-scale species identification; however, it should be used carefully, and the morphological approach and characterization of secondary metabolites should also be carried out. Based on our results, concatenated matrices are recommended to perform phylogenetic inference in this section, and the best combination includes benA, cmdA, and the inclusion of at least one another gene (preB, mcm7, rpb1, preA or ppgA). Conversely, the use of ITS in Aspergillus may lead to an underestimation of the diversity because the gene is highly conserved. Studying mating type MAT1 loci in the section is helpful to increase the knowledge of sexual reproduction in ascomycetes. In addition, several functions of fungal biological machinery are linked to Mat1 loci genes. Secondary metabolic profile characterization of Aspergillus section Flavi strains should be performed, not only as an identification tool, but also to discriminate toxinogenic and atoxinogenic strains. Section Flavi encloses species able to produce a mixture of mycotoxins and beneficial compounds. Amongst mycotoxins that should be screened are AFs, cyclopiazonic acid, A and B versicolorin, sterigmatocystin, tenuazonic acid. An exhaustive study of the secondary metabolism can also be useful to investigate novel beneficial products.

Ce travail visait à quantifier monétairement l’incitatif qui pousserait les producteurs d’arachides du département du Nord d’Haïti à mettre en oeuvre un ensemble de pratiques post-récoltes visant à réduire le risque de contamination aux aflatoxines. Par conséquent, à l’aide d’un mécanisme BDM inversé, le consentement à recevoir des producteurs a été déterminé. De plus, l’effet de l’utilisation d’une bâche de séchage sur la teneur en aflatoxines des arachides produites a été mesuré ainsi que l’influence d’un accès à un marché conditionné sur le consentement à recevoir des producteurs et sur la qualité des arachides produites. Les résultats ont révélé que l’accès au marché a eu un effet significatif sur la prime demandée par les producteurs cependant, il n’a pas eu un impact significatif sur la qualité des arachides alors que c’était le cas pour l’accès à une bâche de séchage. Parallèlement, le consentement à payer des consommateurs de beurre d’arachides du secteur formel a été aussi évalué pour un produit attesté de qualité. La détermination du consentement à payer supplémentaire des consommateurs pour du beurre d’arachides attesté de qualité a montré que cette prime suffirait amplement pour inciter les producteurs à agir. Donc, une solution de marché est plausible pour le contrôle des aflatoxines sur ce segment précis du marché. / This work aimed at quantifying monetarily the incentive that would urge peanut producers in the Northern department of Haiti to implement a set of post-harvest practices to reduce the risk of aflatoxin contamination. Therefore, using an individual inverted BDM mechanism, the willingness to accept of producers has been determined. In addition, the effect of the use of a drying tarpaulin on the aflatoxin content of the peanuts produced was measured as well as the influence of access to a market conditioned by the willingness to accept of producers and the quality of the peanuts produced. The results revealed that market access had a significant effect on the premium demanded by producers, however, it did not have a significant impact on the quality of peanuts while this was the case for the access to a drying tarpaulin. At the same time, consumers' willingness to pay for peanut butter in the formal sector has also been assessed for a certified quality product. The determination of consumers' additional willingness to pay for quality certified peanut butter has shown that this premium would be enough to encourage producers to act. So, a market solution is plausible for aflatoxin control in this segment of the market.

Les travaux présentés dans ce manuscrit concernent le développement d‘une approche originale permettant la détermination de plusieurs composés (principalement aflatoxines et pesticides organophosphorés), à l‘aide de biocapteurs électrochimiques basés sur l‘inhibition de l‘acétylcholinestérase. Dans un premier temps, un nouveau biocapteur potentiométrique utilisant des transistors à effet de champ sensibles au pH (pH-FETs) comme transducteurs a été développé pour la détermination de l‘aflatoxine B1 (AFB1) et différent paramètres d‘élaboration et de fonctionnement du biocapteur ont été optimisés. Le biocapteur proposé est caractérisé par une stabilité opérationnelle élevée and bonne reproductibilité du signal en cours d‘utilisation et de stockage. Le biocapteur a ensuite été évalué pour l‘analyse d‘échantillons réels (blé, sésame, noix et pois) et une simulation mathématique de la réponse du biocapteur potentiométrique à l‘AFB1 a été proposée pour la première fois et validée. Dans un deuxième temps, un biocapteur conductimétrique utilisant des microélectrodes interdigitées en or a été développé. La sensibilité de ce biocapteur aux aflatoxines ainsi qu‘à d‘autres classes de substances toxiques, tels que les pesticides organophosphorés, les métaux lourds, les glycoalkaloïdes, et les surfactants, a été déterminée. Une nouvelle procédure originale, permettant la détermination sélective de toxines multiclasses par application successive de solutions de réactivation visant spécifiquement des inhibiteurs irréversibles ou réversibles, a été finalement proposée. En utilisant cette méthode, il a été montré que les biocapteurs enzymatiques pouvaient être appliqués à l‘analyse des aflatoxines et des pesticides organophosphorés, ainsi qu‘à la détermination de la toxicité globale des échantillons / Investigations reported in this manuscript are focused on the development of an original approach for the detection of several toxic compounds, mainly aflatoxins and organophosphorus pesticides, using acetylcholinesterase (AChE)-based inhibitory electrochemical biosensors. In a first step, a new potentiometric biosensor using pH Sensitive Field-Effect Transistors (pH-FETs) as transducers was investigated for aflatoxin B1 (AFB1) determination and different elaboration and working parameters were optimized. The proposed biosensor was characterized by high operational stability and reproducibility of the signal during the work as well as during the storage. The biosensor was further evaluated for real samples analysis (wheat, sesame, walnuts and peas) and a mathematical simulation of the potentiometric biosensor response to aflatoxin B1 was proposed for the first time and validated. In a second step, a conductometric biosensor using interdigitated gold microelectrodes was developed. The sensitivity of the biosensor to aflatoxins and other classes of toxic substances, such as organophosphorus pesticides, heavy metals ions, glycoalkaloids, and surfactants, was determined. A new and original procedure, enabling the selective determination of multiclass toxins by applying successive reactivation solutions targeting either irreversible or reversible inhibitors, was finally proposed. Using this method, the electrochemical enzyme inhibitory biosensors could be applied to the analysis of aflatoxins and organophosphorus pesticides, as well as for the determination of total toxicity of the samples