Submitted by Eliete Santos (profliete@hotmail.com) on 2018-03-14T18:58:24Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_ImunopatologiaHepaticaInfeccao.pdf: 4042036 bytes, checksum: fdd989701e3ca93ed1baeec85a2d8ec1 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliete Santos (profliete@hotmail.com) on 2018-03-14T18:59:57Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_ImunopatologiaHepaticaInfeccao.pdf: 4042036 bytes, checksum: fdd989701e3ca93ed1baeec85a2d8ec1 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-14T18:59:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_ImunopatologiaHepaticaInfeccao.pdf: 4042036 bytes, checksum: fdd989701e3ca93ed1baeec85a2d8ec1 (MD5) Previous issue date: 2015-09-25 / A Dengue constitui um dos principais problemas de Saúde Pública no mundo, e um dos fatores que colaboram com esta situação é a falta de uma vacina eficaz contra a doença, sendo que em parte, essa dificuldade para obtenção, se deve à inexistência de um modelo experimental que represente o quadro de infecção e manifestação da doença similar aos observados em humanos. Dessa forma, o Instituto Evandro Chagas demonstrou a presença de antígenos virais de dengue, através do teste de Imuno-histoquímica, em primata não humano (PNH) da espécie Callithrix jacchus, o qual evoluiu a óbito com quadro de dengue hemorrágica. Diante do exposto, aliados ao fato de que o fígado é o órgão onde se observa as principais alterações provocadas pelo Virus Dengue (VDEN) em humanos, torna-se importante analisar o fígado de primatas do gênero Callithrix a fim de estudar a patogênese e a imunopatologia da infecção sequencial pelo VDEN. No total, 26 PNH da espécie Callithrix penicillata foram submetidos a infecção primária (IP) por via subcutânea com VDEN-3 (3,23 x 103 PFU/mL), sendo 13 destes animais anestesiados e sacrificados diariamente por sete dias pós-infecção (dpi) (fase aguda) e em intervalos aleatórios até 60 dpi (fase convalescente); a infecção secundária (IS) com VDEN-2 (4,47 x 104 PFU/mL) foi realizada dois meses após a IP nos demais 13 animais. Animais sentinelas não infectados foram reservados até o final do experimento. O fígado dos animais foram processados para histopatologia e imunohistoquímica usando anticorpos policlonais para VDEN e anticorpos para análises da resposta imune inata, celular e citocínica. Os PNH estudados foram suscetíveis à replicação sequencial do VDEN-3 e VDEN-2 no fígado, havendo expressão de antígenos virais em hepatócitos, células de Kupffer e nos corpúsculos de Councilman; o comprometimento histopatológico do fígado foi caracterizado por: presença de apoptose; focos de necrose lítica; esteatose; tumefação cellular; inflamação acinar, no espaço porta (EP) e na veia hepática central (VHC); hiperplasia/hipertrofia em células de Kupffer, bem como, hemossiderina em células de Kupffer; e dilatação dos sinusóides. A intensidade da lesão hepática foi proeminente na fase aguda da IP e IS, apresentando discreta hepatite aguda. A apoptose foi a forma predominante de morte em hepatócitos; bem como, necrose lítica e o infiltrado inflamatório apresentaram padrão de distribuição predominante em Z2. Observou-se aumento na expressão acinar de macrófagos ativados, células NK, proteína S-100 e linfócitos B durante as fases da IP e IS; houve ainda, aumento da expressão acinar de linfócitos TCD4+ durante a fase aguda da IP; observou-se aumento na expressão acinar de IFN- durante as fases da IP e IS, TNF-α e IL-8 com maior prevalência na IS, TGF-β e IL-10 mais expressas na fase aguda da IP, proteína Fas durante a fase aguda da IP e IS e VCAM na fase aguda da IS e aumento na expressão nos EP. Esses achados foram semelhantes aos observados em fígados de casos fatais de dengue em humanos, porém com intensidade e amplitude menor, sugerindo que PNH da espécie Callithrix penicillata é um bom modelo experimental para o estudo da infecção pelo VDEN, especialmente os aspectos imunopatológicos. / Dengue is one of most important public health problem in the world, and one of the factors that contribute with this situation is the lack of an effective vaccine against the disease, and in part, this difficulty to obtain is due clinical the lack of an experimental model that mimic the infection and manifestation of the disease as those observed in humans. Then, the Evandro Chagas Institute showed the presence of dengue antigens using the Immunohistochemistry assay, in the liver of a non-human primate (NHP) of the species Callithrix jacchus, with a fatal outcome following dengue hemorrhagic fever. Based in the above considerations and in addition to the fact that the liver is the targetb organ for Dengue Virus (DENV) in humans, it is important to analyze the liver of primates of the genus Callithrix in order to study the pathogenesis and the immunopathology of sequential infection by DENV. A total of 26 NHP Callithrix penicillata were submitted to primary infection (PI) subcutaneously with DENV-3 (3.23 x 103 PFU/mL), and 13 of these animals anesthetized and sacrificed daily for seven days post-infection (dpi) (acute phase) and in random intervals until 60 dpi (convalescent phase); the secondary infection (SI) with DENV-2 (4.47 x 104 PFU/mL) was performed two months after the PI in the remaining 13 animals. Uninfected sentinels animals were reserved up ending of the experiment. The liver of the animals were processed for histopathology and Immunohistochemical assay using polyclonal antibodies to DENV and antibodies for analyses of the innate and cellular immune response as well as the cytokine expression . The NHP were susceptible to sequential infection by DENV-3 and DENV-2; in the liver viral antigens were expressed in hepatocytes, Kupffer cells and Councilman bodies; the histopathological changes in liver was characterized by the presence of apoptosis, focal lytic necrosis, steatosis, swelling cellular, inflammation (acinar, EP and HCV), hyperplasia/hypertrophy in Kupffer cells, hemosiderin in Kupffer cells and sinusoidal dilatation; the intensity of the liver damage was prominent in the acute phase of PI and SI resulting in acute hepatitis. In addition the apoptosis was the most frequent mechanism of death of hepatocytes; lytic necrosis and inflammatory infiltrate showed predominant distribution pattern in Z2. An increase of the acinar expression of activated macrophages, NK cells, S-100 protein and B-lymphocytes during the stages of PI and SI; as well as, increased acinar expression of TCD4 + lymphocytes during the acute phase of PI; as to the quantification of cytokines and molecules, was observed an increase in acinar expression of: IFN- during the stages of PI and SI, TNF-α and IL-8 with higher prevalence in SI, TGF-β and IL-10 with prevalence in acute phase of PI, Fas protein during the acute phase of PI and SI and VCAM in acute phase of SI, as well as increase in expression in the EP. These findings were similar to those observed in livers from fatal cases of dengue fever in humans, but with lower intensity and amplitude, thus indicating that NHP Callithrix penicillata species is a good experimental model for infection by DENV, involving immunopathologic studies.

Submitted by Simone Souza (simonecgsouza@hotmail.com) on 2017-10-18T14:04:08Z No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Selma Samiko Miyazaki Onuma.pdf: 1498739 bytes, checksum: 80569040824ee0dd609c6d63ad7c4fa7 (MD5) / Approved for entry into archive by Jordan (jordanbiblio@gmail.com) on 2017-11-08T12:33:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Selma Samiko Miyazaki Onuma.pdf: 1498739 bytes, checksum: 80569040824ee0dd609c6d63ad7c4fa7 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-08T12:33:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Selma Samiko Miyazaki Onuma.pdf: 1498739 bytes, checksum: 80569040824ee0dd609c6d63ad7c4fa7 (MD5) Previous issue date: 2014-02-27 / Amostras de sangue de 11 onças-pintadas de vida livre (Panthera onca) foram coletadas em duas unidades de conservação federal no Pantanal de Mato Grosso com objetivo de avaliar o perfil sanitário dessas populações. A presença de anticorpos séricos para Ehrlichia spp., Rickettsia spp., Toxoplasma gondii, Neospora caninum e Sarcocystis neurona foi investigada pela Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI); para Leptospira spp. pela Microtécnica de Soroaglutinação Microscópica (SAM) e para Brucella abortus pelo teste do Antígeno Acidificado Tamponado (Rosa Bengala). O DNA genômico em cada amostra de sangue total coletada foi analisada pela Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) com intuito de identificar a presença de DNA de Ehrlichia spp., Rickettsia spp., Hepatozoon spp. e Cytauxzoon spp. Duas fêmeas de carrapato Amblyomma cajennense coletados em um animal foram também testadas pela PCR para detecção de DNA de Ehrlichia spp. e Rickettsia spp. Duas onças foram soropositivas para Ehrlichia spp., com títulos de anticorpos de 80 e 320, respectivamente. Nove animais reagiram positivamente a pelo menos quatro espécies de Rickettsia spp. Dez, 7 e 8 animais amostrados foram soropositivos para T. gondii, N. caninum e S. neurona, respectivamente. Duas onças apresentaram soros reagentes para Leptospira spp. , e o provável sorotipo infectante em ambos os animais foi um isolado brasileiro do sorovar Canicola (L01). Todas as amostras de soro foram negativas para B. abortus. Nenhum DNA da família Anaplasmataceae e do gênero Ehrlichia foi detectado pela PCR ou pela Heminested- PCR nas amostras de sangue, entretanto uma foi positiva na PCR para Rickettsia spp. segundo o gene citrate sintase (gltA), porém negativa para o gene ompA, comum entre riquétsias pertencentes ao grupo da Febre Maculosa. Um A. cajennense apresentou DNA riquetsial, cujo sequenciamento de nucleotídeos demonstrou 99% de similaridade a R. amblyommii. Sete amostras apresentaram DNA de Hepatozoon spp., com 99% de similaridade para H. felis e 10 das 11 amostras foram positivas para DNA de Cytauxzoon spp., com 99% de similaridade para C. felis. O presente estudo mostrou que as onças de vida livre na porção norte do Pantanal foram expostas a inúmeros agentes patogênicos, e que uma abordagem integrada para a conservação da vida selvagem e a integridade da saúde pública é uma questão eminente a fim de determinar intervenções de gestão em áreas protegidas. Este é o primeiro relato da exposição de onças-pintadas de vida livre a N. caninum e S. neurona. / Blood samples from 11 free-living jaguars (Panthera onca) were collected in two federal conservation units in the Pantanal of Mato Grosso state to determine the health profile of these populations . The presence of serum antibodies for Ehrlichia spp., Rickettsia spp., Toxoplasma gondii, Neospora caninum and Sarcocystis neurona was investigated by Immunofluorescence Assay (IFA); for Leptospira spp by the Microscopic Agglutination Test (MAT). and for Brucella abortus by rose Bengal test . Blood genomic DNA in each sample was tested by Polymerase Chain Reaction( PCR ) to identify Ehrlichia spp . , Rickettsia spp . , Hepatozoon spp . and Cytauxzoon spp. Two females of Amblyomma cajennense ticks collected from an animal were tested by PCR for DNA detection of Ehrlichia spp . and Rickettsia spp. Two jaguars were seropositive for Ehrlichia spp ., with antibody titres of 80 and 320, respectively. Nine animals were positive for at least four species of Rickettsia spp. Ten, 7 and 8 of the sampled animals were seropositive for T. gondii, N. caninum and S. neurona, respectively. Two jaguars were seroreactive for Leptospira spp. antigen and the most likely infecting serotype in both animals was a Brazilian isolate of serovar Canicola ( L01 ) . All serum samples were negative for B. abortus. No Anaplasmataceae and Ehrlichia DNA was detected by PCR or by Heminested-PCR. One sample was positive by PCR for Rickettsia spp. according to the citrate synthase gene (gltA), but it was negative for the ompA rickettsial gene of the spotted fever group. An A. cajennense collected showed riquetsial DNA whose sequence showed 99 % similarity to R. amblyommii . Seven samples presented DNA fragments of Hepatozoon spp., with 99% similarity to H. felis and 10 of the 11 samples were positive for DNA fragments of Cytauxzoon spp., with 99 % similarity to C. felis. The present study showed that free-living jaguars in northern Pantanal were exposed to numerous pathogens, and an integrated approach to wildlife conservation and integrity of public health is a prominent issue in order to determine management interventions in protected areas. This is the first report of exposure of free-living jaguars to N. caninum and S. neurona.