PABPN1 est une protéine de liaison à l'ARN nucléaire et ubiquitaire impliquée dans de nombreux mécanismes de régulation post-transcriptionnelle des ARN. Une expansion anormale de triplets GCN dans le gène PABPN1 conduit à une dystrophie musculaire appelée dystrophie musculaire oculopharyngée (OPMD). A l'heure actuelle les mécanismes moléculaires conduisant d'une expansion de quelques triplets dans le gène d'une protéine ubiquitaire vers cette pathologie où seulement quelques muscles sont touchés ne sont pas connus. La caractéristique phénotypique majeure de la maladie est la présence d'agrégats intranucléaires dans les noyaux des muscles atteints et non atteints. Cependant le rôle exact de ces agrégats et leur implication dans la pathologie reste encore incertain. A l'heure actuelle il n'y a pas de traitements curatifs pour l'OPMD. Dans ce contexte, ce projet de thèse a porté sur 1) l'étude des mécanismes moléculaires dérégulés dans la pathologie, 2) l'étude de la contribution des agrégats nucléaires et 3) le développement d'un stratégie de thérapie génique. Au cours de ce travail il a été mis en évidence des défauts mitochondriaux et les mécanismes moléculaires sous-jacents ont été élucidés. L'étude de l'implication des agrégats dans la maladie a révélé la présence de défauts d'épissage et en particulier dans un ARN muscle spécifique codant la protéine TNNT3. Le projet de thérapie génique dit de remplacement consiste à éteindre PABPN1 par interférence à ARN et amener un ADNc (PABopt) qui code la forme saine et qui est non ciblée par les outils interférence grâce à la redondance du code génétique. Les résultats obtenus ont été très positifs à la fois in vitro et in vivo / PABPN1 is an RNA binding protein involved in many post-transcriptional RNA regulation mechanisms. A pathological expansion of the GCN triplet in the gene leads to a muscular dystrophy called Oculopharyngeal muscular dystrophy (OPMD). The molecular mechanisms leading to a small expansion in an ubiquitous protein to a disease, where only few muscles are impaired are still not fully understood. The main pathological hallmark is the presence in the myonuclei of nuclear aggregates of the PABPN1 protein. Today there is no cure for OPMD patients. In this context the projects developed during this thesis have been to 1) study the molecular mechanisms involved in OPMD, 2) study the contribution of the nuclear aggregates in the physiopathology of the disease and 3) develop a gene therapy strategy. We found mitochondrial dysfunctions present in OPMD muscles and we decipher the molecular mechanism involved. Study of PABPN1 aggregates in OPMD has highlighted splicing deregulation events. Among them TNNT3, a RNA which encodes a muscle specific protein is deregulated and we found that the pre-mRNA is trapped in nuclear aggregates outsides speckles nuclear domain containing its natural splicing factor (SC35), leading to an imbalance of the ratio of two mutually exclusives exons of the transcript. The gene therapy strategy developed is a replacement strategy that consists of silencing PABPN1 using RNAi and also bringing a novel version of the protein using a cDNA, untargeted by RNAi thanks to the genetic code redundancy, which encodes a wild-type form of PABPN1. We obtained promising results both in vitro and in vivo in mice OPMD model with a rescue of the pathological phenotype.

L'ataxie spinocérébelleuse de type 7 (SCA7) est une maladie neurodégénerative due à une expansion de CAG traduit en polyQ dans la protéine ataxine-7. La SUMOylation, modification post-traductionnelle que nous avons identifiée moduler l'agrégation de la protéine mutante, est facilitée par une SUMO E3 ligase.Nous avons identifié RanBP2, une nucléoporine appartenant au complexe du pore nucléaire en tant que SUMO E3 ligase, via SUMO-1 de l'ataxine-7. En effet, le silencing de RanBP2 induit l'agrégation de l'ataxine-7 mutante, ce qui démontre l'implication de RanBP2 dans la physiopathologie de SCA7. Nous montrons également que l'ataxine-7 endogène est une cible modifiée par SUMO-1 et -2. L'ataxine-7 poly-SUMOylée, grâce à la présence de chaines SUMO2/3, est capable de recruter RNF4. Cette protéine conduit à la dégradation de l'ataxine-7 mutante par la voie du protéasome. La dégradation est abolie en présence d'un mutant de RNF4.Dans un modèle murin KI SCA7, nous avons quantifié l'expression des gènes impliqués dans la voie de la SUMOylation au niveau des régions les plus touchées du cerveau. Le niveau d'expression des ARNs messagers montre des altérations dépendantes des répétitions CAG du gène SCA7. A 6 mois (avant le début de la pathologie), les premières dérégulations sont observées; à 12 mois (à un stade avancé de la maladie), on note une diminution statistiquement significative de Sumo-1 dans le cervelet des souris Atxn7100Q/5Q. Ces résultats, alliés à l'observation de l'accumulation anormale des protéines SUMO-1 et RanBP2 dans le cervelet d'un patient SCA7, suggèrent que les voies de la SUMOylation in vivo peuvent être perturbées dans SCA7. / Spinocerebellar ataxia type 7 (SCA7) is a neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (polyQ) in the protein ataxin-7. SUMOylation, a post-translational modification that we identified to modulate mutant protein aggregation in a SCA7 cellular model, is facilitated by a SUMO E3 ligase. Here, we identified RanBP2 (Nup358), a nucleoporin belonging to the nuclear pore complex, as the major E3 enzyme implicated in ataxin-7 modification by SUMO-1. Indeed, RanBP2 silencing renders mutant ataxin-7 more prone to aggregation, thus demonstrating the implication of RanBP2 in SCA7 pathophysiology. We also show that endogenous ataxin-7 is a target for both SUMO-1 and -2 modification. Poly-SUMOylated ataxin-7 presents a docking site composed of SUMO2/3 chains for the recruitment of RNF4: this protein is a SUMO E3 ubiquitin ligase that mediates degradation of mutant ataxin-7 by the proteasome pathway. The degradation is abolished in presence of a mutant form of RNF4. In a SCA7 knock-in mouse model we quantified expression of SUMO-pathway related genes in cerebellum and retina, the most affected regions using quantitative RT-PCR. SUMO-related genes show expanded repeat-dependent alterations in expression patterns. At 6 months (before onset), deregulations begin to occur; by 12 months (late stage of disease), there is a statistically significant impairment in Sumo-1 levels in Atxn7100Q/5Q cerebellum. These results, together with the observation that SUMO-1 and RanBP2 protein accumulate abnormally in the cerebellum of a SCA7 patient, suggest that in vivo SUMO-modifying pathways may be perturbed in SCA7.