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Characterization of IKAP/hELP1-dependent pathways. Abstract An extensive characterization of the signal transduction pathways is required to better understand how cells respond to various stimuli. While the human genome is completely sequenced, it is still necessary to combine those informations with a full knowledge of the biological roles played by the proteins. Importantly, a deregulation of the signal transduction pathways underlie a variety of human diseases such as cancer or neurodegenerative disorders. IKAP/hELP1 is the largest subunit of Elongator and is required for the functional integrity of this complex. The histone acetyltransferase activity of Elongator helps the transcriptional machinery to move on the template of still poorly characterized genes to transcribe. In yeast, Elongator has also been involved in tRNA modifications as well as in exocytosis. In humans, Familial dysautonomia, an autosomal recessive disease characterized by defects in the development and maintenance of neurons of the autonomic and sensory systems, results from a loss-of-function of IKAP/hELP1. Recent work in our laboratory linked this disease to a cell migration defect of IKAP/hELP1 depleted cells. The aim of this work is to investigate the role of Elongator in signal transduction. In the first part, we wanted to know whether Elongator was required for the regulation of gene expression in response to DNA damage. We demonstrated that some p53-dependent genes were aberrantly expressed upon Elongator deficiency in colon cancer-derived cells. Moreover, we showed that these IKAP/hELP1 depleted cells were not more sensitive to apoptosis in response to persistent DNAdamage. In the second part of this work, to better characterize IKAP/hELP1, we tried to validate its potential interaction with the RanBP2 nucleoporin which is a component of the nuclear pore complex. Given its mainly cytoplasmic localization and its role in the nucleus, we studied the translocation of IKAP/hELP1 between both of these cellular compartments. We determined a potential nuclear export signal on the C-terminal part of IKAP/hELP1. This might allow us to further explore the link between the distinct roles and the localization of the Elongator complex. / Caractérisation des mécanismes moléculaires impliquant la protéine IKAP/hELP1 et le complexe Elongator. Résumé Létude des voies de signalisation permet de mieux comprendre comment une cellule réagit face à divers stimuli. Alors que le génome humain est complètement séquencé, la caractérisation des différentes voies de signalisation cellulaire est à ce jour toujours incomplète et nécessite une meilleure connaissance de leurs principaux acteurs, les protéines. Ceci est dautant plus important quun dérèglement de lactivation de ces voies de signalisation peut conduire à des pathologies aussi diverses que le cancer ou des maladies neurodégénératives. IKAP/hELP1 est la plus grande sous-unité du complexe Elongator et est essentielle pour lassemblage fonctionnel de celui-ci. Le complexe Elongator grâce à son activité dacétylation des histones qui permet laccès à la chromatine, participe à lélongation de la transcription de gènes, ceux-ci restant à ce jour peu caractérisés. Récemment chez la levure, Elongator a été décrit comme prenant part à dautres évènements cellulaires aussi divers que la modification des ARNs de transfert qui permet une traduction fidèle des protéines, ou que lexocytose. Chez lhomme, une neuropathologie génétique, la dysautonomie familiale, est la conséquence directe dune perte de fonction de la protéine IKAP/hELP1. Notre laboratoire a récemment fait le lien entre cette maladie qui affecte le développement et la survie du système nerveux autonome et sensoriel, et un déficit des capacités migratoires de cellules exprimant trop faiblement la protéine IKAP/hELP1. Le but de ce travail est de poursuivre la caractérisation des rôles biologiques du complexe Elongator. Dans la première partie de ce travail, nous avons examiné le rôle dElongator dans la modulation de lexpression de gènes suite à un dommage à lADN. Nous avons pu mettre en évidence une altération du profil dexpression de plusieurs gènes connus pour être sous la dépendance de p53, une protéine activée en réponse à divers signaux de stress, dans des cellules dérivées de cancers du colon et déficientes pour Elongator. De plus, nous avons déterminé que ces cellules déplétées pour IKAP/hELP1 nétaient pas plus sensibles à lapoptose, en réponse ou non à des dommages persistants à lADN. Dans la deuxième partie, nous avons tenté de valider, sur base de résultats obtenus chez la levure, son interaction potentielle avec une protéine du pore nucléaire, RanBP2. Etant donné sa localisation majoritairement cytoplasmique et sa fonction dans le compartiment nucléaire, nous avons étudié le transport dIKAP/hELP1 entre le noyau et le cytoplasme. Nous avons pu déterminer un site dexport nucléaire potentiel sur lextrémité C-terminale dIKAP/hELP1 qui nous permettra dexplorer le lien entre les différentes fonctions et la localisation du complexe Elongator.

L'ataxie spinocérébelleuse de type 7 (SCA7) est une maladie neurodégénerative due à une expansion de CAG traduit en polyQ dans la protéine ataxine-7. La SUMOylation, modification post-traductionnelle que nous avons identifiée moduler l'agrégation de la protéine mutante, est facilitée par une SUMO E3 ligase.Nous avons identifié RanBP2, une nucléoporine appartenant au complexe du pore nucléaire en tant que SUMO E3 ligase, via SUMO-1 de l'ataxine-7. En effet, le silencing de RanBP2 induit l'agrégation de l'ataxine-7 mutante, ce qui démontre l'implication de RanBP2 dans la physiopathologie de SCA7. Nous montrons également que l'ataxine-7 endogène est une cible modifiée par SUMO-1 et -2. L'ataxine-7 poly-SUMOylée, grâce à la présence de chaines SUMO2/3, est capable de recruter RNF4. Cette protéine conduit à la dégradation de l'ataxine-7 mutante par la voie du protéasome. La dégradation est abolie en présence d'un mutant de RNF4.Dans un modèle murin KI SCA7, nous avons quantifié l'expression des gènes impliqués dans la voie de la SUMOylation au niveau des régions les plus touchées du cerveau. Le niveau d'expression des ARNs messagers montre des altérations dépendantes des répétitions CAG du gène SCA7. A 6 mois (avant le début de la pathologie), les premières dérégulations sont observées; à 12 mois (à un stade avancé de la maladie), on note une diminution statistiquement significative de Sumo-1 dans le cervelet des souris Atxn7100Q/5Q. Ces résultats, alliés à l'observation de l'accumulation anormale des protéines SUMO-1 et RanBP2 dans le cervelet d'un patient SCA7, suggèrent que les voies de la SUMOylation in vivo peuvent être perturbées dans SCA7. / Spinocerebellar ataxia type 7 (SCA7) is a neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (polyQ) in the protein ataxin-7. SUMOylation, a post-translational modification that we identified to modulate mutant protein aggregation in a SCA7 cellular model, is facilitated by a SUMO E3 ligase. Here, we identified RanBP2 (Nup358), a nucleoporin belonging to the nuclear pore complex, as the major E3 enzyme implicated in ataxin-7 modification by SUMO-1. Indeed, RanBP2 silencing renders mutant ataxin-7 more prone to aggregation, thus demonstrating the implication of RanBP2 in SCA7 pathophysiology. We also show that endogenous ataxin-7 is a target for both SUMO-1 and -2 modification. Poly-SUMOylated ataxin-7 presents a docking site composed of SUMO2/3 chains for the recruitment of RNF4: this protein is a SUMO E3 ubiquitin ligase that mediates degradation of mutant ataxin-7 by the proteasome pathway. The degradation is abolished in presence of a mutant form of RNF4. In a SCA7 knock-in mouse model we quantified expression of SUMO-pathway related genes in cerebellum and retina, the most affected regions using quantitative RT-PCR. SUMO-related genes show expanded repeat-dependent alterations in expression patterns. At 6 months (before onset), deregulations begin to occur; by 12 months (late stage of disease), there is a statistically significant impairment in Sumo-1 levels in Atxn7100Q/5Q cerebellum. These results, together with the observation that SUMO-1 and RanBP2 protein accumulate abnormally in the cerebellum of a SCA7 patient, suggest that in vivo SUMO-modifying pathways may be perturbed in SCA7.

This thesis presents an investigation of fluorescence resonance energy transfer (FRET) as a reporting signal for protein-protein interactions. Quantitative optical assays to measure protein binding, conjugation and deconjugation are developed and results validated by conventional biochemical techniques. The optical techniques developed provide fast, cheap, quantitative and accurate alternatives to conventional methods. Fluorescent protein fluorophores ECFP and Venus-EYFP were chosen as they are a non-interfering FRET pair and provide an inexpensive and convenient cloning-based labelling method. The small ubiquitin-like modifier SUMO and the SUMOylation pathway leading to its conjugation to target proteins is investigated as a model system. These assays are hence particularly relevant to research on post-translational modification and ubiquitin systems. In protein-protein binding assays we utilise both steady-state and time-resolved FRET detection to measure the equilibrium binding constant of the well-characterised pair SUMO1 and Ubc9. An assay in multi-well plate format is also presented, which uniquely enables repeat measurements under varying conditions and under the addition of further substances. The multi-protein binding interactions of the SUMOylation pathway including RanBP2 are analysed in binding inhibition assays. Our results clarify the role of RanBP2: a covalent SUMO1-Ubc9 link is required for the formation of a trimeric complex, although mutual binding sites are present on all three proteins. Furthermore, the binding of SUMO1 and Ubc9 is disrupted by RanBP2, which may be an essential step in transferring SUMO1 to its target protein. A FRET-based kinetic study of this conjugation process to RanGAP1 is presented. An assay to monitor the deconjugation of SUMO1 by specific proteases is established using a doubly-tagged SUMO construct. This enables a quantitative analysis of protease and substrate specificity based on real-time kinetic data, a characterisation of crude cell extracts and a high-throughput screen for protease inhibitors using FRET. A screen of the National Cancer Institute (NIC) diversity set for SenP1 inhibition reveals nine suitable compounds, which are potential anti-cancer drugs. The results of two further projects, the study of protein-protein binding by measuring small refractive index changes and the autofluorescence of normal and neoplastic cervical tissue models are also presented. In the latter, principal component analysis was used to systematically identify emission regions of significant variation between samples, enabling discrimination between healthy and pre-cancerous tissue models.