The  rapidly  activating  delayed  rectifier  potassium   channel  (IKr)  encoded  by  the  human  ether-­a-­go-­go  related  gene  (hERG)  is  a  crucial   component  of cardiac  repolarization  of  the  action  potential.  The   gating  kinetics  of  the  channel  and  the  number  of  channels  on  the  membrane  determine  the   degree  of  current  flowing  through  hERG  channels.  Membrane  channel  density  is  directly   related  to  a  balance  between  protein  trafficking  and  degradation.  While  hERG  channel   trafficking  has  been  studied  in  the  past  decade,  recently  our  lab  and  others  have  made  new   discoveries  regarding  hERG  degradation.  These  studies  show  that  Neural  Down  Regulated   Gene  4  subtype  2  (Nedd4-­‐2)  is  the  ligase  that  covalently  attaches  ubiquitin  to  the  hERG   channel  and  facilitates  degradation  (Albesa  et  al.,  2011;Guo  et  al.,  2012).  Given  these   findings,  my  goal/objective  was  to  study  the  molecular  mechanisms  that  control  the   destructive  effects  of  Nedd4-­‐2  on  the  hERG  channel.  In  the  present  study,  I  demonstrated   that  overexpression  of  the  stress-­‐responsive  serum-­‐  and  glucocorticoid-­‐inducible  kinase   (SGK)  isoforms  SGK1  and  SGK3  increase  the  current  and  expression  level  of  the  membrane-­‐ localized  mature  proteins  of  hERG  channels  stably  expressed  in  HEK  293  (hERG-­‐HEK)  cells.   I  have  found  that  the  overexpression  of  SGK1  and  SGK3  increased  Nedd4-­‐2   phosphorylation,  which  is  known  to  inhibit  Nedd4-­‐2  activity.  Furthermore,  the  synthetic   glucocorticoid,  dexamethasone,  increased  the  current  and  abundance  of  mature  ERG   proteins  in  both  hERG-­‐HEK  cells  and  neonatal  rat  cardiac  myocytes  through  the   enhancement  of  SGK1  but  not  SGK3  expression.  Additionally,  disruption  of  Rab11  proteins led  to  a  complete  elimination  of  SGK-­‐mediated  increase  in  hERG  expression.  These  results   indicate  that  SGK  enhances  the  expression  level  of  mature  hERG  channels  by  inhibiting   Nedd4-­‐2  as  well  as  by  promoting  Rab11-­‐mediated  hERG  recycling. / Thesis (Master, Physiology) -- Queen's University, 2013-08-14 16:01:43.951

層黏蛋白 (laminin) 是基底膜內主要的糖蛋白，屬於細胞外基質。研究指出層黏蛋白在學習與記憶扮演重要角色，且內生性laminin β1表現於海馬迴神經，但是目前對於層黏蛋白在中樞神經的瞭解仍不是很清楚。因此，本實驗室利用水迷津學習實驗探討laminin β1對大白鼠空間學習與記憶的影響，實驗結果發現，經過學習試驗後的大白鼠，其海馬迴CA1區域的laminin β1 mRNA和蛋白質表現量明顯地減少，laminin β2的表現則不受到影響。為瞭解laminin β1在空間學習與記憶力程中扮演的角色及其下游的訊息傳遞路徑，我們轉染laminin β1 siRNA至海馬迴CA1區域會促進大白鼠在水迷津空間學習與記憶的能力，由西方墨點法也觀察到抑制海馬迴中laminin β1的表現量會促進SGK Ser422及ERK1/2的磷酸化，但是AKT Ser473的磷酸化則無顯著差異。當轉染質體基因laminin β1至CA1區域，則會抑制大白鼠水迷津空間學習與記憶的能力，同時也抑制SGK Ser422及ERK1/2的磷酸化。由於過去證實SGK1於大白鼠空間學習記憶歷程中扮演重要角色，我們推測laminin β1與SGK Ser422的磷酸化有關，為確認laminin β1與SGK1之間的關係，我們同時轉染laminin β1 siRNA和SGK siRNA至海馬迴CA1區域，原先laminin β1促進大白鼠在水迷津空間學習與記憶的能力反而受到抑制。由於許多文獻指出mitogen-activated protein kinase /extracellular signal-regulated kinase (MAPK/ERK) 能整合不同訊息傳遞路徑進而調控基因的表現，對神經突觸的可塑性及記憶的形成是個重要分子，我們進一步探討laminin β1是否透過ERK1/2調控下游的SGK1進而影響大白鼠的空間記憶與學習。因此我們先轉染laminin β1 siRNA，48小時後再給予U0126 (MEK抑制劑) 以抑制MAPK/ERK的活性。結果顯示U0126會阻斷laminin β1所引起SGK ser422的磷酸化。本篇研究提出laminin β1會參與哺乳類動物學習記憶的形成，同時也證實laminin β1會經由抑制ERK1/2及SGK1的活化進而抑制大白鼠空間學習與記憶的形成。

Characterization of IKAP/hELP1-dependent pathways. Abstract An extensive characterization of the signal transduction pathways is required to better understand how cells respond to various stimuli. While the human genome is completely sequenced, it is still necessary to combine those informations with a full knowledge of the biological roles played by the proteins. Importantly, a deregulation of the signal transduction pathways underlie a variety of human diseases such as cancer or neurodegenerative disorders. IKAP/hELP1 is the largest subunit of Elongator and is required for the functional integrity of this complex. The histone acetyltransferase activity of Elongator helps the transcriptional machinery to move on the template of still poorly characterized genes to transcribe. In yeast, Elongator has also been involved in tRNA modifications as well as in exocytosis. In humans, Familial dysautonomia, an autosomal recessive disease characterized by defects in the development and maintenance of neurons of the autonomic and sensory systems, results from a loss-of-function of IKAP/hELP1. Recent work in our laboratory linked this disease to a cell migration defect of IKAP/hELP1 depleted cells. The aim of this work is to investigate the role of Elongator in signal transduction. In the first part, we wanted to know whether Elongator was required for the regulation of gene expression in response to DNA damage. We demonstrated that some p53-dependent genes were aberrantly expressed upon Elongator deficiency in colon cancer-derived cells. Moreover, we showed that these IKAP/hELP1 depleted cells were not more sensitive to apoptosis in response to persistent DNAdamage. In the second part of this work, to better characterize IKAP/hELP1, we tried to validate its potential interaction with the RanBP2 nucleoporin which is a component of the nuclear pore complex. Given its mainly cytoplasmic localization and its role in the nucleus, we studied the translocation of IKAP/hELP1 between both of these cellular compartments. We determined a potential nuclear export signal on the C-terminal part of IKAP/hELP1. This might allow us to further explore the link between the distinct roles and the localization of the Elongator complex. / Caractérisation des mécanismes moléculaires impliquant la protéine IKAP/hELP1 et le complexe Elongator. Résumé Létude des voies de signalisation permet de mieux comprendre comment une cellule réagit face à divers stimuli. Alors que le génome humain est complètement séquencé, la caractérisation des différentes voies de signalisation cellulaire est à ce jour toujours incomplète et nécessite une meilleure connaissance de leurs principaux acteurs, les protéines. Ceci est dautant plus important quun dérèglement de lactivation de ces voies de signalisation peut conduire à des pathologies aussi diverses que le cancer ou des maladies neurodégénératives. IKAP/hELP1 est la plus grande sous-unité du complexe Elongator et est essentielle pour lassemblage fonctionnel de celui-ci. Le complexe Elongator grâce à son activité dacétylation des histones qui permet laccès à la chromatine, participe à lélongation de la transcription de gènes, ceux-ci restant à ce jour peu caractérisés. Récemment chez la levure, Elongator a été décrit comme prenant part à dautres évènements cellulaires aussi divers que la modification des ARNs de transfert qui permet une traduction fidèle des protéines, ou que lexocytose. Chez lhomme, une neuropathologie génétique, la dysautonomie familiale, est la conséquence directe dune perte de fonction de la protéine IKAP/hELP1. Notre laboratoire a récemment fait le lien entre cette maladie qui affecte le développement et la survie du système nerveux autonome et sensoriel, et un déficit des capacités migratoires de cellules exprimant trop faiblement la protéine IKAP/hELP1. Le but de ce travail est de poursuivre la caractérisation des rôles biologiques du complexe Elongator. Dans la première partie de ce travail, nous avons examiné le rôle dElongator dans la modulation de lexpression de gènes suite à un dommage à lADN. Nous avons pu mettre en évidence une altération du profil dexpression de plusieurs gènes connus pour être sous la dépendance de p53, une protéine activée en réponse à divers signaux de stress, dans des cellules dérivées de cancers du colon et déficientes pour Elongator. De plus, nous avons déterminé que ces cellules déplétées pour IKAP/hELP1 nétaient pas plus sensibles à lapoptose, en réponse ou non à des dommages persistants à lADN. Dans la deuxième partie, nous avons tenté de valider, sur base de résultats obtenus chez la levure, son interaction potentielle avec une protéine du pore nucléaire, RanBP2. Etant donné sa localisation majoritairement cytoplasmique et sa fonction dans le compartiment nucléaire, nous avons étudié le transport dIKAP/hELP1 entre le noyau et le cytoplasme. Nous avons pu déterminer un site dexport nucléaire potentiel sur lextrémité C-terminale dIKAP/hELP1 qui nous permettra dexplorer le lien entre les différentes fonctions et la localisation du complexe Elongator.

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