Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia / Made available in DSpace on 2012-10-26T00:16:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 299102.pdf: 1115675 bytes, checksum: 1561537b124aa393233ecf22c382c035 (MD5) / Os sistemas endocanabinóide e adenosinérgico, através dos receptores A1 e CB1, compartilham uma série de características. Ou seja, ambos os receptores ativam proteínas Gi/o para mediar suas principais ações, inibem a liberação de diferentes neurotransmissores e são expressos em grandes concentrações no córtex, hipocampo e cerebelo. Além disso, agonistas dos dois receptores prejudicam processos relacionados à memória espacial enquanto que antagonistas induzem melhora cognitiva. Apesar das semelhanças entre os dois sistemas e da importância da memória espacial na fisiopatologia de diferentes doenças, poucos estudos avaliaram a possível interação entre ambos os sistemas no controle da memória espacial. Desta forma o objetivo deste trabalho foi avaliar a interação entre os sistemas adenosinérgico e endocanabinóide, através dos receptores A1 e CB1, na modulação da memória espacial. Para isso validou-se o modelo da localização de objetos em camundongos, o qual pareceu sensível a drogas amnésicas ou pró-mnemônicas. Além disso, demonstrou-se que a região CA1 do hipocampo participa da aquisição da memória de localização de objetos em camundongos. Posteriormente, utilizou-se o modelo recém validado e o labirinto aquático para avaliar o efeito pró-mnemônico da co-administração de antagonistas dos receptores A1 e CB1. Esta interação melhora o aprendizado de camundongos em doses até 20 vezes menores do que aquelas utilizadas para produzir o mesmo efeito quando administradas isoladamente. Na sequência demonstrou-se que as ações da co-administração são mediadas, pelo menos em parte, pela liberação de glutamato e a interação deste com os receptores NMDA no hipocampo e no córtex pré-frontal. No último grupo de experimentos, demonstrou-se que os receptores A1 e CB1 do hipocampo interagem para modular a amnésia induzida por agonistas de ambos. Ou seja, o efeito amnésico do agonista A1 é bloqueado pelo antagonista CB1, enquanto que o prejuízo de aprendizado induzido pelo agonista CB1 é atenuado pelo agonista A1. Sugerindo que tanto o tônus adenosinérgico quanto o endocanabinóide interagem para a modulação da amnésia induzida por agonistas dos receptores CB1 e A1, respectivamente. Por fim, conclui-se que os sistemas adenosinérgico e endocanabinóide, através de seus receptores A1 e CB1, interagem para o controle de processos associados à memória espacial de camundongos. / The adenosinergic and endocannabinoid systems share different characteristics through the A1 and CB1 receptors. For example, both are densely expressed in areas such as the cerebellum, prefrontal cortex, and hippocampus. The binding of agonists to them activates Gi/o proteins and similar mechanisms of signal transduction. Functionally, A1 and CB1 receptor activation inhibits the release of different neurotransmitters. In animal models of spatial learning, A1 and CB1 receptor agonists and antagonists have been reported to impair and to facilitate learning and memory, respectively. Despite these evidences, there are no studies evaluating the interaction between both systems in spatial memory processes. Initially, we have done a pharmacological validation of the object-location task in mice. This task is sensitive to amnesic and pro-mnemonic drugs, and the expression of memory seems to be dependent on the CA1 hippocampus. In a second set of results, we have shown that coadministration of subeffective doses of A1 and CB1 antagonists improves acquisition of spatial learning evaluated either in the water maze or in the object-location task. This effect was dependent on glutamate release into the hippocampus and prefrontal cortex. The blockade of NMDA receptors in the CA1 hippocampus and prefrontal cortex counteracts the effects of the coadministration evaluated in the object-location task. This suggests that the simultaneous blockade of the adenosinergic and endocannabinoid tonuses might enhance memory, and that the mechanism of this effect is dependent on glutamate release into the hippocampus and prefrontal cortex. The last group of experiments evaluated the interaction between A1 and CB1 receptors in the amnesia induced by the agonists of both. The result suggests that the amnesia induced by an A1 agonist is blocked by a CB1 receptor antagonist. On the other hand, the learning deficits induced by the CB1 receptor agonist are attenuated by the A1 receptor activation. This suggests that the adenosinergic and endocannabinoid systems might modulate amnesia induced either by A1 or CB1 agonists. Finally, these results also suggest that the adenosinergic and endocannabinoid systems interact to modulate behavioral processes associated with spatial memory.

Orientador: Alessandra Alves de Souza / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T18:36:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Caserta_Raquel_M.pdf: 8932792 bytes, checksum: 642a7e654340f17e79b37b6fa4a560cc (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: É inquestionável a importância da participação da citricultura na economia brasileira. O Brasil é o maior exportador de suco concentrado do mundo. Em 2007 as exportações brasileiras quase alcançaram 400 milhões de caixas de laranja, retrato de uma cultura que gera uma diversidade enorme de empregos diretos e indiretos, movimentando também a indústria de insumos. O estado de São Paulo tem maior destaque nessa produção e no final dos anos 80 foi severamente prejudicado pela Clorose Variegada dos Citros (CVC), uma doença que acarreta danos da ordem de milhões de dólares por diminuir o tamanho dos frutos e, por conseqüência, a quantidade de suco produzido. Foi comprovado que a bactéria causadora da CVC é a Xylella fastidiosa, um fitopatógeno de crescimento limitado ao xilema. Devido a importância da citricultura para o estado de São Paulo, a X. fastidiosa teve seu genoma completo seqüenciado e foram encontrados diversos genes relacionados a adesão, muitos deles similares a patógenos de humanos e animais. Isso sugeriu que a adesão e a formação do biofilme fossem fatores essenciais para a sobrevivência da bactéria na planta. Essa hipótese é reforçada pelo fato de plantas sintomáticas apresentarem colônias de bactérias aderidas nas paredes dos vasos do xilema. Trabalhos posteriores comprovaram que sua colonização se dá pela formação de um biofilme que ocasiona o bloqueio dos vasos, dificultando a eficiência do transporte de água e seiva pela planta. Nesse contexto, o estudo da participação de proteínas de adesão, sejam elas fimbriais ou afimbriais, é fundamental para o entendimento da formação e estrutura do biofilme. Por apresentarem funções distintas, adesinas fimbriais e afimbriais são expressas em momentos diferentes durante a formação do biofilme. Diante do exposto acima, o objetivo desse trabalho foi monitorar a expressão de duas adesinas fimbriais e duas adesinas afimbriais de X. fastidiosa envolvidas com a formação do biofilme in vitro. Para tal, foram realizados Western blot e microscopia de fluorescência utilizando anticorpos desenvolvidos contra as proteínas alvo. Os resultados revelaram que adesinas fimbriais se expressam preferencialmente nas fases iniciais do bioflme, enquanto que adesinas afimbriais estão expressas nas fases mais tardias, quando o biofilme já apresenta traços de agregação celular. Esse padrão de expressão sugere que a adesão inicial da bactéria ao substrato seja mediada por proteínas fimbriais e a adesão célula a célula seja função de proteínas afimbriais. Além disso, uma maior ou menor quantidade de cada proteína se encontra expressa em todas as fases o biofilme, sugerindo haver uma regulação de expressão que resulta em interação biológica entre elas, a fim de manter a estabilidade e estruturação do biofilme. Com o objetivo de monitorar a expressão dessas adesinas in vivo, foram analisadas também secções ultrafinas de pecíolos de vinca, hibisco e citros infectados e apresentando sintomas da doença. Em todas as análises foi possível detectar a presença das proteínas alvo, comprovando que elas são necessárias para o processo de infecção da planta pela bactéria. Os resultados aqui apresentados demonstram que proteínas fimbriais e afimbriais, assim como em patógenos de humanos, são necessárias para a formação do biofilme de X. fastidiosa. Este é o único fitopatógeno cujo mecanismo de patogenicidade é a formação de um biofilme. Neste sentido, os resultados aqui apresentados são importantes no auxílio de possíveis controles de doenças formadas por biofilmes, uma vez que o tempo de expressão de cada adesina foi determinado, elas poderiam ser neutralizadas antes de desempenharem suas funções, quebrando a estabilidade do biofilme através da interrupção da interação entre as proteínas / Abstract: The importance of citriculture in Brazilian's economy is unquestionable. Brazil is the major exporter of concentrate juice in the world. In 2007, Brazilian exportations of orange almost reached 400 million boxes, reflecting the importance of a product that generates an enormous diversity of direct and indirect jobs, even helping the insums industry. In Brazil, São Paulo state has a great prominence in orange production. In the 80's, the citrus fields were severely harmed by Citrus Variegated Chlorosis (CVC), a disease that causes losses of million dollars since it affects the fruit size and, consequently, juice production. It was proved that the Xylella fastidiosa, a phytopathogen that grows limited to the xylem vessels, is the causal agent of CVC. Due to the importance of citriculture in the São Paulo state, the genome of X. fastidiosa was sequenced and there were found many genes related to adhesion, some of them similar to human and animal pathogens. This fact suggested that adhesion and biofilm formation were essential for the survey of the bacteria within the plant. This hypothesis is supported by the fact that symptomatic plants have colonies of bacteria adhered to the walls in xylem vessels. Subsequent works demonstrated that the colonization occurs through the formation of a biofilm that blocks the vessels, reducing the efficiency of water and sap transportation. In this context, the study of the role of the fimbrial or afimbrial adhesion proteins is fundamental to the elucidation of the biofilm structure and formation. These adhesins show different functions, and because of that they are not expressed at the same time during biofilm formation. In face of what was shown above, the aim of this work was to monitor the expression of two fimbrial and two non fimbrial adhesins involved in biofilm formation in vitro. Western blot and fluorescence microscopy using polyclonal antibodies developed against the target proteins were performed, and the results revealed that fimbrial adhesins are expressed preferentially at the initial phases of biofilm formation, while non fimbrial adhesins are expressed at the late phases, when the biofilm already presents cellular aggregation traits. This expression pattern suggests that the initial adhesion of the bacteria to the substrate is mediated by fimbrial adhesins and that the function of cell to cell adhesion is performed by non fimbrial adhesins. Besides, each protein studied is found more or less to be expressed during all stages of biofilm development, suggesting the existence of a regulatory mechanism that results in a biological interaction between these proteins, in order to keep the stability and structure of the biofilm. In order to accompany the expression of these adhesins in vivo, ultra thin sections of petioles of periwinkle, hibiscus and citrus infected by X. fastidiosa and presenting symptoms were prepared. All the sections showed the presence of the target proteins, suggesting that they are necessary to the infectious process of the plants. The results demonstrated that fimbrial and non fimbrial proteins, as well as in human pathogens, are necessary for the biofilm formation by X. fastidiosa. This is the only phytopathogen which requires the formation of a biofilm to cause the disease. In this way, the results obtained in this work may contribute with the development of possible approaches to control diseases caused by biofilm formation, once the expression profile of each adhesin was determined. In a possible attempt to prevent the symptoms, the interaction between these adhesins could be blocked, breaking the stability of biofilm / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular