La Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1) est cause par l'expansion anormale d'un triplet CTG dans la partie 3'UTR du gène DMPK, entrainant l'agrégation du transcrit mutant dans des inclusions ribonucléoprotéiques appelées foci. D'après plusieurs études structurales sur des courtes répétitions CUG, il a été proposé que les expansions CUG se replient en une structure en tige-boucle qui interfère avec l'activité de plusieurs facteurs lié au métabolisme de l'ARN et altère leur fonction cellulaire. Le facteur d'épissage muscleblind-like 1 (MBNL1) a été identifié par sa capacité à interagir avec les répétitions CUG. In vivo, ces répétitions entrainent la séquestration de cette protéine aboutissant en une déplétion nucléaire. Un autre facteur d'épissage, la CUG Binding protein (CUGBP1), est également impliqué dans la pathologie. Au lieu d'être séquestré par les répétitions, la stabilité protéique de CUGBP1 est augmentée dans les tissus DM1 entrainant un gain d'activité pour ce facteur. La séquestration de MBNL1 et la stabilisation de CUGBP1 résultent en la dérégulation de l'épissage alternatif de plusieurs transcrits musculaires et du cerveau et la réexpression d'isoformes protéiques fœtales dans les tissus adultes. Cependant, de récentes études suggèrent que d'autres facteurs ou voies de signalisation que celles faisant intervenir MBNL1 et CUGBP1 pourraient être impliquées dans la pathologie DM1.Le but de mon travail de thèse a été d'identifier de nouveaux facteurs ayant la capacité d'interagir avec les répétitions CUG. A l'aide d'une purification sur chromatographie d'affinité utilisant un ARN contenant 95 répétitions CUG comme appât, nous avons identifié l'ARN hélicase p68/DDX5. p68 fait partie de la famille des protéines DEAD-box, caractérisée par un core protéique conservé constitué de neufs domaines hautement conservés, dont le motif DEAD, à l'origine du nom de ces protéines. p68 est impliquée dans de nombreux aspects du métabolisme de l'ARN, dont la transcription, l'épissage, l'export, la traduction et la dégradation des ARN. Nous avons montré, que p68 colocalise avec les foci CUG dans un modèle cellulaire exprimant la partie 3'UTR du gène DMPK contenant de longues répétitions CTG. Nous avons identifié que p68 augmente l'interaction de MBNL1 sur les répétitions CUG et une structure secondaire particulière d'un élément régulateur de l'ARN pré-messager cardiac Troponin T (TNNT2), dont l'épissage est dérégulé dans la pathologie. L'insertion de mutations dans le core de l'hélicase de p68 abolit l'effet de p68 sur la fixation de MBNL1 ainsi que la colocalisation de p68 avec les expansions CUG in vivo, suggérant que le remodelage des structures secondaires ARN de manière ATP-dépendante par p68 facilite l'interaction de MBNL1. Nous trouvons également que la compétence de p68 pour réguler l'inclusion de l'exon alternatif 5 de TNNT2 dépend de l'intégrité des sites de fixation de MBNL1.Nous proposons que p68 agit comme un modificateur de l'activité de MBNL1 sur ces cibles d'épissage ainsi que sur les expansions CUG à l'origine de la pathologie.

La dernière étape de la cytocinèse, l'abscission, consiste en la coupure du pont intercellulaire reliant les deux cellules filles à la suite de la contraction de l'anneau acto-myosique. Comme toutes les étapes de la division cellulaire, l'abscission doit être régulée dans l'espace et dans le temps afin qu'elle intervienne au bon endroit et au bon moment. Mon travail de doctorat a porté sur l'étude de la régulation dans le temps de l'abscission par l'environnement des cellules filles, en particulier par les forces de traction exercées par les cellules sur le pont intercellulaire. En utilisant une combinaison d'approches permettant de contrôler le confinement spatial 2D des cellules filles, de mesurer les forces exercées par les cellules au cours de la cytocinèse et de micro-manipuler le pont intercellulaire, j'ai montré que, de façon contre-intuitive, une tension exercée au niveau du pont retardait l'abscission et qu'au contraire la relâche de cette tension induisait l'abscission. De plus, la régulation temporelle de l'abscission par les facteurs environnementaux des cellules filles implique les protéines des " Endosomal Sorting Complex Required for Transport III " (ESCRT-III), machinerie centrale de l'abscission. Enfin, des expériences préliminaires suggèrent que cette régulation serait importante pour le maintien de l'intégrité tissulaire et la morphogenèse au cours du développement.

Le bactériophage T5 est un virus infectant E. Coli. L'assemblage et la maturation de sa capsidecomportent plusieurs étapes critiques pour la formation des virions lors du cycle infectieux.Parmi ces étapes, j'ai étudié les processus d'expansion et de décoration de la capside de T5.L'expansion implique d'importantes réorganisations conformationnelles des 775 sous-unités de laprotéine pb8 composant la capside, conduisant au doublement du volume de la capside qui peutalors contenir le génome du phage. J'ai déterminé des conditions physico-chimiques permettantd'induire l'expansion de la capside in vitro, puis j'ai effectué des expériences de SAXS résoluesdans le temps montrant que l'expansion est un processus hautement coopératif, qui conduit, en uneétape, à un état final remarquablement stable. D'autre part, j'ai réalisé une étude fonctionnelle de laprotéine de décoration pb10, montrant que sa fixation est un marqueur de l'expansion. Enfin l'étudestructurale de pb10 menée par SAXS a permis de déterminer un modèle à basse résolution de sonenveloppe moléculaire.

Les bases fondamentales de la biologie suggèrent que tous les organismes actuels partagent un dernier ancêtre commun, le cenancêtre. Dès que la comparaison moléculaire des organismes des trois domaines du vivant (archées, bactéries et eucaryotes) est devenue possible, d'importants débats ont émergé sur l'habitat du cenancêtre, son rapprochement des origines de la vie, sa nature unique ou communautaire et ses relations avec les trois domaines du vivant. Cependant, jusqu'à il y a peu les informations disponibles sur les organismes modernes n'étaient pas suffisantes pour décrire précisément sa biologie. Notamment, la découverte chez les archées de membranes dont les composants principaux, les phospholipides, sont synthétisés par des mécanismes très différents de ceux des bactéries et les eucaryotes a conduit à proposer que chaque mécanisme de synthèse des phospholipides soit apparu indépendamment dans les lignées modernes. Dans ces hypothèses le cenancêtre aurait été dépourvu de phospholipides et, donc, de membranes. Cela met en cause la nature cellulaire du cenancêtre, qui semblait pourtant soutenue par d'autres indices indirects. Ces contradictions posent la question de l'existence de traces dans les organismes modernes d'une synthèse des phospholipides chez le cenancêtre. Dans cette thèse j'ai profité de l'explosion récente des données génomiques pour répondre à cette question. Il avait déjà montré que des membres de deux superfamilles protéiques universelles pouvaient avoir synthétisé de façon non spécifique chez le cenancêtre les énantiomères de glycérol phosphate servant d'ossature aux phospholipides. Les phospholipides archéens sont composés d'isoprénoïdes et les bactériens et eucaryotes d'acides gras. J'ai donc étudié l'évolution des voies de synthèse de ces molécules ainsi que celle de l'assemblage de tous les composants dans des phospholipides. Mes résultats montrent que la voie de synthèse des isoprénoïdes des eucaryotes et une voie hypothétique de synthèse des acides gras chez les archées avaient probablement des ancêtres moins spécifiques chez le cenancêtre. Une partie au moins de la machinerie d'assemblage des phospholipides semble aussi avoir été présente chez le cenancêtre.Ceci suggère que le cenancêtre avait probablement des mécanismes peu spécifiques de synthèse des phospholipides et que les différences entre les membranes actuelles sont dues à la spécialisation de la machinerie ancestrale dans chaque lignée. Mes observations soulignent aussi l'importance d'étudier le cenancêtre à partir des informations issues des organismes actuels pour éviter toute confusion avec les origines de la vie.

Ce travail avait pour objectif : 1) évaluer le portage de gamétocytes et leur génotype avant et après le traitement d'une part, et d'étudier leur infectivité ; 2) exprimer le domaine catalytique (PfMCA1-cd-Sc) de la métacaspase de Plasmodium falciparum (PfMCA1) chez la levure et 3) tester in vitro l'activité antiplasmodiale de nouvelles molécules synthétiques dérivées des pyrano et ferro-quinoléines sur des clones de laboratoire 3D7 et Dd2. Pour cela, le test in vivo de 28 jours de l'OMS, les marqueurs moléculaires de résistance et le " direct feeding " ont été utilisés pour le premier objectif. La culture des levures, l'expression des protéines de la métacaspase 1 de Plasmodium falciparum, le western blot, le test de prolifération et de survie, et les marqueurs de mort cellulaire ont servi pour le second objectif et enfin, la culture parasitaire et tests in vitro par la méthode de fluorimétrie au Sybr Green I ont permis l'évaluation de l'activité antiplasmodiale de nouvelles molécules. Nous avons démontré que les gamétocytes post-traitement étaient porteurs de mutations ponctuelles et plus infectants dans le groupe chloroquine ; que l'expression hétérologue du domaine catalytique de la métacaspase de Plasmodium falciparum (PfMCA1) dans la levure Saccharomyces cerevisiae entraînait une mort clonale de type apoptotique et un retard de croissance dépendant de l'activité VAD-Protéase et enfin, que les substitues aromatiques à base de pyrimidine ou de benzylméthylamine ferrocène révèlent une activité satisfaisante par rapport à la méthoxyéthylidene sur les clones 3D7 et Dd2.

Geotrichum candidum est une levure hémiascomycète ubiquitaire longtemps considérée comme un champignon filamenteux. C'est l'une des levures les plus fréquemment trouvées dans les fromages dans les quelles elle contribue à l'affinage. Dans le cadre du projet ANR ALIA Food Microbiomes en partenariat avec des industriels fromagers et producteur de levain, nous avons caractérisé l'espèce G. candidum par une étude phylogénétique et placé de manière non ambigüe G. candidum parmi les levures hémiascomètes. Une analyse MLST a permis de séparer les souches étudiées en deux groupes. Le premier contient essentiellement des souches environnementales tandis que le second ne contient que des souches isolé du fromage. Cela suggère une certaine sélection ou spécialisation d'un groupe de souche dans la fabrication du fromage. Une méthode de typage inter LTR plus discriminante a permis de typer l'ensemble des souches et peut fournir aux industriels un outil robuste pour le suivi d'une souche en production. Le génome de G. candidum CLIB 918 = ATCC 204307 a été séquencé. Les premières analyses ont mis en évidence des discontinuités évolutives parmi les gènes qui le composent. Parmi les 6802 gènes identifiés, 315 gènes présentent des orthologues chez les champignons filamenteux et non chez les levures. Cela suggère que durant l'évolution, G. candidum a conservé un grand nombre de gènes qui a été perdu chez les autres levures ou en a reçu certain par transfert horizontal de gènes. L'existence de ce même type de gènes chez d'autre levure ayant une position basale dans l'arbre des hémiascomycètes, suggère que G. candidum et ces levures ont une position intermédiaire lors de la transition évolutive champignon vers levure. Il est à noter que certains d'entre eux sont impliqués dans le métabolisme et pourraient jouer un rôle dans l'adaptation de cette levure à la fabrication du fromage.

Le nickel est connu pour son utilisation dans la préparation d'alliages réputés peu sensibles à la contamination bactérienne, très utilisés dans les secteurs agro-alimentaires et médicaux. Cependant, les bactéries apparaissent capables d'adhérer même à ce type de matériau et de le coloniser sous forme de biofilms. Les biofilms sont des communautés de micro-organismes, adhérant entre eux et à une surface, grâce à la sécrétion d'une matrice adhésive offrant une protection contre la dessiccation, les défenses de l'hôte et un grand nombre d'agents antimicrobiens. Ces biofilms manifestent des propriétés de multirésistances aux biocides qui causent des problèmes sanitaires majeurs dans les installations hospitalières et industrielles. D'importantes modifications de l'expression génétique accompagnent la vie en biofilm et induisent des caractères spécifiques dont des résistances accrues aux biocides et la production de facteurs de virulence. Parmi ces derniers, les curli, qui sont un composé protéique majeur de la matrice extracellulaire chez les bactéries Escherichia coli et Salmonella spp., jouent un rôle clé dans la formation de biofilms sur surfaces inertes et biologiques. Ce travail a consisté à explorer la contribution de la vie en biofilm à la survie des bactéries Escherichia coli K-12 productrices de curli en présence de nickel. Pour cela, l'effet physiologique d'ions solubles de nickel sur la survie des bactéries a été testé sur des supports inertes en polystyrène ou en acier. Nous avons montré que des concentrations sub-inhibitrices de nickel induisent une augmentation de l'épaisseur et de la densité du biofilm. Cet effet ne dépend pas des modifications physico-chimiques de la surface cellulaire par le nickel, ni de l'activité de la seule pompe d'efflux à nickel connue d'E. coli, RcnA. Par contre, le nickel à faible concentration induit l'expression des curli, ainsi que leur production. C'est donc via l'activation transcriptionnelle des gènes codant les curli que l'augmentation du biofilm par le nickel se produit. Ce travail s'est également appliqué à rechercher la nature du relais gouvernant la mise en place des curli en réponse à la présence de nickel. Aucun des régulateurs principaux de l'expression des curli ne joue un rôle décisif. Nos résultats nous conduisent à suggérer que l'effet du nickel repose sur un phénomène global de réponse au stress oxydant dont le mécanisme reste à déterminer.

La famille de protéines kinases SNF1/AMPK/SnRK1 (levure/mammifères/plantes) est un régulateur central du métabolisme cellulaire chez l'ensemble des eucaryotes, activant le catabolisme et inhibant l'anabolisme en réponse au stress. Ces hétérotrimères sont composés d'une sous-unité catalytique (kinase α) et de deux sous-unités régulatrices (β et γ). De très nombreux travaux sur l'AMPK (AMP-activated Kinase) chez les mammifères ont révélé l'incroyable complexité de cette voie de signalisation impliquant des régulateurs en amont et une pléthore de cibles.Chez les plantes, les cibles connues de SnRK1 (" SNF1-Related Kinase 1 ") comprennent des facteurs de transcription, imposant une reprogrammation transcriptomique importante, et des enzymes clés du métabolisme telles que la Sucrose Phosphate Synthase et la Nitrate Reductase, conduisant, comme chez l'animal, au contrôle de l'homéostasie énergétique. Toutefois, les mécanismes de régulation de ces complexes sont eux très peu connus.Dans une première partie, nous avons recherché des métabolites capables d'influencer l'activité de SnRK1. L'enrichissement rapide d'extraits végétaux en complexes SnRK1 d'Arabidopsis thaliana, couplé à des mesures spécifiques d'activité kinase in vitro, nous ont permis de montrer que l'ADP, l'AMP et le citrate étaient des inhibiteurs forts de ces enzymes. Ces résultats nous ont permis d'établir un modèle physiologique dans lequel les complexes SnRK1 répondent à la fois au statut carboné de la cellule mais également aux niveaux globaux des adénylates.Dans une seconde partie, nous nous sommes intéressés aux kinases amont AtSnAK1 et AtSnAK2 (activatrices des sous-unités catalytiques AtSnRK1α1). Des essais kinases sur protéines recombinantes ont permis de mettre en évidence de nouveau un effet inhibiteur des adénylates sur l'activité de ces protéines, suggérant que l'ensemble de la voie SnAK/SnRK1 répond à des signaux énergétiques. De plus, la caractérisation de mutants perte-de-fonction a révélé un rôle important des kinases AtSnAK1 et 2 dans la transition hétérotrophie/autotrophie des jeunes plantules.Enfin, nous avons caractérisé un lien inédit chez les plantes entre homéostasie énergétique et prolifération cellulaire en montrant que les kinases AtSnRK1 sont capables de phosphoryler et inhiber les orthologues KRP6 et KRP7 de l'inhibiteur du cycle cellulaire de mammifères p27KIP1.Un modèle global des fonctions de cette kinase à l'échelle de la plante entière et de son développement est proposé en intégrant ces résultats aux connaissances actuelles sur les complexes SnRK1.

Les déshydrogénases sont faiblement actives en présence de fortes concentrations (> 50 % (v/v)) de liquides ioniques (LIs) miscible à l'eau et les raisons précises de cette inactivation ne sont pas connues. La structure de la formiate déshydrogénase de Candida boidinii (FDH) en présence de ces LIs miscibles à l'eau a été étudiée par atténuation de fluorescence par de l'iode ou de l'acrylamide. Une concentration critique, la CILc ("Critical Ionic Liquid concentration"), au dessus de laquelle la fluorescence n'est pas exploitable, est déterminée. Elle se situe entre 30 et 40 % (v/v) des LIs de cette étude. Les LIs s'avèrent être de forts agents dénaturants : les constantes d'atténuation de fluorescence en présence de LI sont de 1,4 à 2 fois plus importantes qu'en présence d'urée. La FDH a été modifiée chimiquement par des cations analogues aux cations des LIs afin de la préserver de l'interaction avec les LIs. Les enzymes modifiées par des cations de plus petite taille présentent une importante activité résiduelle (30-45%) en présence de 70% (v/v) de LI tandis que l'enzyme sauvage est inactive. En présence de 30% (v/v) de LI, l'efficacité catalytique (kcat/KM) des enzymes modifiées augmente de 1,3 à 3,6 fois et la constante de Michaelis (KM) diminue de 1,7 à 4,6 fois suivant le cation utilisé. Selon la taille du cation greffé, le temps de demi-vie des enzymes modifiées augmente de 3 à 5 fois en solution tamponnée. Enfin, la structure des enzymes modifiées est préservée en présence de 40% (v/v) de LI tandis que l'enzyme native commence à se dénaturer. La technique d'évolution dirigée a également été utilisée. A ce jour, 987 mutants ont été criblés. Un mutant (M60) présente une activité résiduelle de 35% à 70% (v/v) de LI tandis que l'enzyme sauvage est inactive. Ce dernier porte deux mutations, N187S et T321S, situées à la surface de la structure protéique. En présence de 30 % (v/v) de LI, le mutant 60 fixe les substrats avec des valeurs de de KMNAD et de KDN3 (N3 est l'azide, un inhibiteur compétitif du formiate) 2 fois plus faibles que celles de l'enzyme sauvage.

The depiction of the phylogenetic structure of the genus Frankia is still troublesome and the evolutionary forces guiding the speciation, dispersion and diversity are not well documented. The current phylogeny has been defined on the basis of the comparative analysis of the 16S rRNA gene sequence while de genomospecies definition is still subjected to DNA-DNA hybridization trials. Aiming to bring to light the genomic variability of the genus and its translation into the ecological and specific diversity, our studies consisted in, firstly, evaluating the specific diversity within the genus and the ability of the Amplified Fragment Length Polymorphism technique (AFLP) to describe Frankia genomospecies and their phylogenetic liaisons. Moreover this technique was also tested for the study of the non isolated Frankia directly in the actinorhizal nodules. Secondly, we defined a MLSA (Multilocus Sequence analysis) scheme which allowed us to establish a phylogeny of the genus by using a hundred of strains and for the first time to describe the phylogenetic divergence of a group of non culturable strains exhibiting the particular ability (phenotype) of sporulating in planta (Sp+). The Sp+ strains are distributed into two divergent clades whose structure is highly correlated to the host genotype. The importance of genetic markers having impact over ecology of the strains has been revised. In this regard we have studied the phylogenetic analysis and the occurrence of the genetic components for the siderophore production and of the sodF gene in Frankia.