Hintergrund: Akute Nierenschädigung (AKI) nach einem herzchirurgischen Eingriff unter Einsatz der Herz-Lungenmaschine ist eine häufige und schwerwiegende Komplikation und erhöht die Morbidität und Mortalität. NGAL (Neutrophiles Gelatine-assoziiertes Lipocalin) und Hämoxygenase-1 (HO-1) sind renale Biomarker mit protektiver Wirkung. Ziel der Studie war, um den Zusammenhang zwischen NGAL und HO-1 und der Inzidenz von AKI nach Herzoperationen zu untersuchen. Patienten und Methode: In dieser prospektiven Kohortenstudie wurden 150 erwachsene herzchirurgische Patienten untersucht. HO-1- und NGAL-Messungen wurden mittels ELISA durchgeführt. In uni- und multivariaten Analysen wurde der Zusammenhang zwischen Biomarkern und AKI untersucht. Ergebnisse: Insgesamt 35 Patienten (23,5%) entwickelten AKI in den ersten 48 postoperativen Stunden. Die Konzentrationen von NGAL und HO-1 waren bei ICU-Ankunft im Vergleich zum Ausgangswert höher (p<0.001 für NGAL bzw. HO-1). Bei Patienten, die AKI entwickelten, wurde 24 Stunden nach der Operation ein zusätzlicher Anstieg der Serum-HO-1-Konzentration beobachtet, während bei Patienten, die später keine AKI entwickelten, die Serum-HO-1-Konzentrationen abnahmen (AKI: 12.75 [8.69-34-35] vs. keine AKI: 8.30 [4.13-15.60] ng/ml, p=0.031). In der multivariaten Analyse wurde eine unabhängige Beziehung der Serum-HO-1-Konzentration 24 Stunden nach der Operation mit der Entwicklung einer AKI innerhalb 48 Stunden postoperativ gefunden (p=0.043, OR 1.053, 95% CI: 1.002-1.007). Zusammenfassung: Die Kinetik der HO-1-Serumkonzentrationen nach einer Herzoperation und der Zusammenhang der HO-1-Konzentration mit der Entwicklung von AKI liefert neue Informationen über die potenzielle Nützlichkeit von HO-1 als Biomarker. / Background: Acute kidney injury (AKI) is a serious complication after cardiac surgery that is associated with increased mortality and morbidity. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) and heme oxygenase-1 (HO-1) are renal biomarkers with protective, anti-inflammatory properties. The aim of the study was to evaluate the association between NGAL and HO-1 and the incidence of AKI after cardiac surgery. Patients and methods: In the present study, we used data from a prospective cohort study of 150 adult cardiac surgical patients. HO-1 and NGAL measurements were performed by ELISA. In univariate and multivariate analyses, the association between biomarkers and AKI was investigated. Results: In total, 35 patients (23,5%) developed AKI during the first 48 hours after surgery. NGAL and HO-1 levels were higher at ICU arrival as compared to baseline (P<0.001 for NGAL and HO-1). NGAL levels were significantly higher in patients who developed AKI within 48 hours (960 [614–1,262] pg/mL vs 600 [461–783] pg/mL, P<0.001), while HO-1 levels did not differ (P=0.88) at this time point. In patients developing AKI, an additional increase of serum HO-1 levels 24 hours after surgery was observed, whereas in patients who subsequently did not develop AKI, serum HO-1 levels decreased (AKI: 12.75 [8.69–34.35] ng/mL vs no AKI: 8.30 [4.13–15.60] ng/mL, P=0.031). We found an independent relationship of serum HO-1 levels 24 hours after surgery with the development of AKI (P=0.043, OR 1.053, 95% CI: 1.002–1.107). Conclusion: The association of the second HO-1 burst 24 hours after CBP might help to distinguish between the causality of AKI in patients undergoing CBP, thus helping to adapt patient stratification and management.

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Die akute Nierenschädigung nach herzchirurgischen Eingriffen ist eine häufige und schwerwiegende Komplikation. Eine Verbesserung der intraoperativen Myokardprotektion und dadurch eine mögliche Reduktion der Nierenschädigung kann unter anderem durch die Wahl einer geeigneten Kardioplegielösung beeinflusst werden. Bisher gibt es jedoch keine Untersuchungen hinsichtlich des Effekts verschiedener eingesetzter Kardioplegielösungen auf die Niere. Im Rahmen dieser Studie wurden drei Kardioplegielösungen hinsichtlich des Effekts auf die akute Nierenschädigung im kardialen Ischämie-Reperfusions-Modell untersucht. Deutsche Landrassenschweine (50-60 kg) wurden nach 40-minütiger Äquilibrierung und medianer Sternotomie für 90 min einem elektiven Herzstillstand bei Hypothermie (34°C) ausgesetzt. Es erfolgte eine Randomisierung in drei Gruppen zu je 10 Tieren. Zur Initiierung der Kardioplegiephase erhielten die Tiere entweder Custodiol®, die neuere Custodiol® N-Lösung oder Custodiol® supplementiert mit 1,2 mg/L Ciclosporin A. Nach 120 min Reperfusion wurden Serum und Nierenbiopsien entnommen. Über den gesamten Versuchsablauf wurden die Versuchstiere mittels hämodynamischen Monitorings und Blutgasanalysen engmaschig überwacht. Das Nierengewebe wurde histologisch, immunhisto- und proteinbiochemisch hinsichtlich morphologischer Veränderungen, hypoxischem und nitrosativem Stress und Apoptose analysiert. In Serum- und Nierenzelllysaten wurden Biomarker der akuten Nierenschädigung mittels ELISA quantifiziert. Weiterhin wurde die Aktivität verschiedener Enzyme bestimmt, die an der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies beteiligt sind. Die hämodynamischen Parameter wie Blutdruck und Herzfrequenz waren in allen drei Versuchsgruppen vergleichbar. Die Hämoglobinkonzentration war in allen drei Gruppen nach Beginn der Kardioplegie niedriger als zu Versuchsbeginn, kehrte in der Custodiol® N- und Custodiol®/Ciclosporin-A-Gruppe jedoch nach der Reperfusion wieder auf das jeweilige Ausgangsniveau zurück, während die Konzentration in der Custodiol®-Gruppe bis zum Versuchsende niedriger war. In der Custodiol® N-Gruppe kam es später als in den beiden anderen Gruppen zu einem Anstieg der Laktatkonzentration. In allen Gruppen war ab der Gabe der Kardioplegielösung eine Hyponatriämie und eine Hyperkaliämie zu verzeichnen. Die Chloridkonzentration sank in der Custodiol®- und der Custodiol®/Ciclosporin-A-Gruppe ab Kardioplegiebeginn, in der Custodiol® N-Gruppe erst nach der Kardioplegiephase. Die Calciumkonzentration war in der Custodiol® N-Gruppe den gesamten Versuch über konstant, während sie in der Custodiol®- und der Custodiol®/Ciclosporin-A-Gruppe sank. Die histologische Untersuchung des Nierengewebes ergab keine Unterschiede zwischen den Gruppen hinsichtlich der glomerulären Morphologie, während die Zellgröße der proximalen Tubuli in der Custodiol®/Ciclosporin-A-Gruppe kleiner war als in der Custodiol®-Gruppe. Es zeigte sich außerdem ein statistischer Trend für kleinere Durchmesser der proximalen Tubuli in der Custodiol® N- und Custodiol®/Ciclosporin-A-Gruppe im Vergleich zur Custodiol®-Gruppe. Hinsichtlich hypoxischer und nitrosativer Effekte gab es keine Unterschiede zwischen den Gruppen. Es war jedoch ein statistischer Trend für eine niedrigere Nitrotyrosinkonzentration in den Glomeruli bzw. eine höhere Konzentration in den Intermediärtubuli der Custodiol® N-Gruppe im Vergleich zur Custodiol®-Gruppe erkennbar. Die Enzymaktivitäten der NADPH-Oxidase, der Superoxiddismutase und der Katalase zeigten keine signifikanten Unterschiede im Vergleich der Gruppen. Auch die Konzentration der Biomarker der akuten Nierenschädigung Neutrophilengelatinase-assoziiertes Lipocalin, Fettsäurebindungsprotein-1 und Cystatin C waren zwischen den Gruppen vergleichbar. Der bezüglich der Caspase-unabhängigen Apoptose quantifizierte Apoptose-induzierende Faktor zeigte keine Unterschiede zwischen den Gruppen auf, während die Konzentration des an der Caspase-abhängigen Apoptose beteiligten Cytochrom C in der Custodiol® N-Gruppe signifikant niedriger war als in der Custodiol®-Gruppe. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen vergleichbare Effekte der drei untersuchten Kardioplegielösungen. Es ist möglich, dass im Rahmen einer akuten Nierenschädigung bei herzchirurgischen Eingriffen die Herzfunktion und die daraus resultierende Endorganperfusion die entscheidenden Faktoren darstellen. Es gibt jedoch Hinweise dafür, dass im Vergleich zu Custodiol® die neue Custodiol® N-Lösung bzw. die Supplementierung von Custodiol® mit Ciclosporin A bessere Auswirkungen auf die Myokardprotektion und dadurch indirekt auch auf die Niere hat.:I Inhaltsverzeichnis 1 Einführung 1 1.1 Entwicklung und Bedeutung der extrakorporalen Zirkulation in der Herzchirurgie 1 1.2 Kardioplegie und kardioplegische Lösungen 1 1.3 Eigenschaften der verwendeten Kardioplegielösungen 3 1.3.1 Custodiol® 3 1.3.2 Custodiol® N 4 1.3.3 Custodiol® plus Ciclosporin A 6 1.4 Pathophysiologie der Schädigung durch extrakorporale Zirkulation 6 1.5 Akute Nierenschädigung bei herzchirurgischen Operationen 7 1.5.1 Definition und Inzidenz der akuten Nierenschädigung 7 1.5.2 Assoziation der intraoperativen Nierenschädigung mit Mortalität 8 1.5.3 Pathophysiologie der akuten Nierenschädigung 8 1.5.4 Biomarker einer akuten Nierenschädigung 10 1.5.5 Ansätze zur Prävention einer akuten Nierenschädigung 11 2 Fragestellung und Zielsetzung 12 3 Materialien und Methoden 13 3.1 Materialien und Geräte 13 3.2 Versuchstiere 16 3.3 Studiendesign 16 3.4 Versuchsablauf 17 3.4.1 Anästhesie, Beatmung und Medikation 17 3.4.2 Operative Vorbereitung und Äquilibrierungsphase 20 3.4.3 Einleitung der Kardioplegie 20 3.4.4 Extrakorporale Zirkulation mit Herz-Lungen-Maschine – Ischämiephase 20 3.4.5 Reperfusionsphase 21 3.4.6 Intraoperatives Monitoring 21 3.4.7 Probenentnahme und Konservierung 22 3.5 Probenaufbereitung 23 3.5.1 Histologie 23 3.5.2 Proteinextraktion von Nierengewebe in RIPA-Puffer 24 3.5.3 Proteinextraktion von Nierengewebe in Proteasepuffer 24 3.5.4 Proteinkonzentrationsbestimmung von Nierengewebelysaten 25 3.6 Hämatoxylin-Eosin-Färbung 26 3.7 Immunhistochemie 26 3.8 Analyse der histologischen Präparate 28 3.9 Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest (ELISA) 28 3.10 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 30 3.11 Western Blot 32 3.11.1 Blotting 32 3.11.2 Applikation der Antikörper 33 3.11.3 Chemilumineszenzdetektion 34 3.11.4 Stripping und Blocken einer Membran 34 3.11.5 Referenzprotein und densitometrische Auswertung 35 3.12 Enzymaktivitätsbestimmungen 35 3.12.1 NADPH-Oxidase 36 3.12.2 Superoxiddismutase (SOD) 36 3.12.3 Katalase 37 3.13 Statistische Analysen 38 4 Ergebnisse 39 4.1 Gruppencharakteristika und Hämodynamik 39 4.2 Hämoglobinkonzentration 41 4.3 Laktatkonzentration 42 4.4 Elektrolyte 43 4.4.1 Natrium 43 4.4.2 Kalium 43 4.4.3 Calcium 44 4.4.4 Chlorid 45 4.5 Histologische Veränderungen 46 4.5.1 Histologie der Glomeruli 46 4.5.2 Histologie der proximalen Tubuli 48 4.6 Translokation des Hypoxie-induzierten Faktors 1 (HIF-1) 49 4.7 Expression von Nitrotyrosin 50 4.8 Quantifizierung von Enzymaktivitäten 51 4.8.1 Aktivität der NADPH-Oxidase 51 4.8.2 Aktivität der Superoxiddismutase 52 4.8.3 Aktivität der Katalase 53 4.9 Quantifizierung von Biomarkern einer Nierenschädigung im Serum 53 4.9.1 Neutrophilengelatinase-assoziiertes Lipocalin (NGAL) 53 4.9.2 Fettsäurebindungsprotein 1 (FABP-1) 54 4.9.3 Cystatin C 55 4.10 Induktion der Caspase-abhängigen Apoptose 55 4.10.1 Expression von Cytochrom C in Nierengewebe 55 4.10.2 Konzentration von Cytochrom C im Nierengewebe 56 4.11 Induktion der Caspase-unabhängigen Apoptose 57 4.11.1 Translokation des Apoptose-induzierenden Faktors (AIF) 57 4.11.2 Expression des Apoptose-induzierenden Faktors (AIF) im Nierengewebe 58 5 Diskussion 60 5.1 Pathophysiologie der akuten Nierenschädigung im Rahmen von herzchirurgischen Eingriffen 60 5.2 Evaluation der akuten Nierenschädigung im Rahmen von herzchirurgischen Eingriffen durch Transfer in ein Großtiermodell 61 5.3 Elektrolyt- und Hämoglobinkonzentrationen im zeitlichen Verlauf 62 5.4 Hypoxie und Zellschädigung 63 5.5 Oxidativer und nitrosativer Stress 65 5.6 Apoptose 66 5.7 Limitationen 66 5.8 Fazit und Ausblick 67 6 Zusammenfassung 69 7 Literaturverzeichnis 71 8 Anlagen 80 9 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 84 10 Lebenslauf 85 11 Publikation 87 12 Vorträge 87 13 Danksagung 88

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Signaling pathways of regulated necrosis, such as necroptosis and ferroptosis, contribute to acute kidney injury (AKI), but the role of pyroptosis is unclear. Pyroptosis is mediated by the pore-forming protein gasdermin D (GSDMD). Here, we report a specific pattern of GSDMD-protein expression in the peritubular compartment of mice that underwent bilateral ischemia and reperfusion injury (IRI). Along similar lines, the GSDMD-protein expression in whole kidney lysates increased during the first 84 h following cisplatin-induced AKI. Importantly, unlike whole kidney lysates, no GSDMD-protein expression was detectable in isolated kidney tubules. In IRI and cisplatin-induced AKI, GSDMD-deficient mice exhibited hypersensitivity to injury as assessed by tubular damage, elevated markers of serum urea, and serum creatinine. This hypersensitivity was reversed by a combined deficiency of GSDMD and the necroptosis mediator mixed lineage kinase domain-like (MLKL). In conclusion, we demonstrate a non-cell autonomous role for GSDMD in protecting the tubular compartment from necroptosis-mediated damage in IRI.

The progressively increasing prevalence of the Metabolic Syndrome (MetS) has emerged as a major global health concern since the MetS is associated with an increased risk for cardiovascular morbidity and mortality. Central obesity represents a key feature of the MetS and is strongly related to all MetS comorbidities. Dysregulation of adipose tissue-derived proteins, so called adipokines, has been implied to partially contribute to these effects. Recently, fibroblast growth factor-21 (FGF-21) has been introduced as a novel insulin sensitizing and weight reducing adipokine with potential therapeutic properties. However, data on FGF-21 elimination are rather limited. Therefore, FGF-21 regulation in relation to renal function has been investigated in a patient population with chronic kidney disease (CKD, study population 1), as well as one with acute kidney impairment (study population 2). In study population 1 (n = 499), patients were distributed into five CKD subgroups according to estimated glomerular filtration rate (eGFR). Median FGF-21 serum concentrations progressively increased from CKD stage 1 to stage 5 and highest values of FGF-21 were detected in stage 5 (1: 86.4 ng/l; 2: 206.4 ng/l; 3: 289.8 ng/l; 4: 591.3 ng/l; 5: 1918.1 ng/l). Furthermore, eGFR remained the strongest predictor for FGF-21 levels in multivariate analysis. For study population 2 (n = 32), blood samples were obtained before elective unilateral partial or total nephrectomy, as well as within 30 hours after surgery. In this population FGF-21 levels significantly increased after surgery (325.0 ng/l) as compared to before surgery (255.5 ng/l). Furthermore, relative changes of FGF-21 were independently and positively predicted by relative changes of creatinine in this cohort. These results are in accordance with the hypothesis that FGF-21 is eliminated by the kidneys and that the extent of kidney dysfunction substantially contributes to serum FGF-21 levels. However, additional animal experiments and prospective clinical studies are needed to further elucidate the role of the kidneys in FGF-21 physiology.

The progressively increasing prevalence of the Metabolic Syndrome (MetS) has emerged as a major global health concern since the MetS is associated with an increased risk for cardiovascular morbidity and mortality. Central obesity represents a key feature of the MetS and is strongly related to all MetS comorbidities. Dysregulation of adipose tissue-derived proteins, so called adipokines, has been implied to partially contribute to these effects. Recently, fibroblast growth factor-21 (FGF-21) has been introduced as a novel insulin sensitizing and weight reducing adipokine with potential therapeutic properties. However, data on FGF-21 elimination are rather limited. Therefore, FGF-21 regulation in relation to renal function has been investigated in a patient population with chronic kidney disease (CKD, study population 1), as well as one with acute kidney impairment (study population 2). In study population 1 (n = 499), patients were distributed into five CKD subgroups according to estimated glomerular filtration rate (eGFR). Median FGF-21 serum concentrations progressively increased from CKD stage 1 to stage 5 and highest values of FGF-21 were detected in stage 5 (1: 86.4 ng/l; 2: 206.4 ng/l; 3: 289.8 ng/l; 4: 591.3 ng/l; 5: 1918.1 ng/l). Furthermore, eGFR remained the strongest predictor for FGF-21 levels in multivariate analysis. For study population 2 (n = 32), blood samples were obtained before elective unilateral partial or total nephrectomy, as well as within 30 hours after surgery. In this population FGF-21 levels significantly increased after surgery (325.0 ng/l) as compared to before surgery (255.5 ng/l). Furthermore, relative changes of FGF-21 were independently and positively predicted by relative changes of creatinine in this cohort. These results are in accordance with the hypothesis that FGF-21 is eliminated by the kidneys and that the extent of kidney dysfunction substantially contributes to serum FGF-21 levels. However, additional animal experiments and prospective clinical studies are needed to further elucidate the role of the kidneys in FGF-21 physiology.