Catharanthus roseus est une plante médicinale produisant divers types d’alcaloïdes indoliques monoterpéniques (AIM) d’intérêt en santé humaine. Ainsi, les AIM dimères comme la vinblastine et la vincristine sont utilisés en chimiothérapie anticancéreuse et les alcaloïdes monomères de type hétéroyohimbine présentent diverses activités pharmacologiques. La fabrication de ces molécules dans la plante est fort complexe. Elle requiert un haut niveau de compartimentation tissulaire et subcellulaire et met en jeu plus d’une trentaine d’étapes enzymatiques, dont certaines sont encore très mal connues. Dans ce contexte, l’objectif de la thèse a consisté à élucider plusieurs étapes enzymatiques de la voie de biosynthèse des AIM. Nos travaux ont permis de caractériser de nouvelles isoformes enzymatiques de la famille des cytochromes P450 ainsi que les réductases qui leur sont associées. Ils ont abouti à l’identification de nouvelles déshydrogénases et mis en évidence, in planta, leurs interactions avec la strictosidine synthase suggérant une biosynthèse orientée vers les divers alcaloïdes de type hétéroyohimbine. Enfin, en ayant recours à l’ingénierie métabolique, un segment de la voie de biosynthèse a été transféré dans la levure Saccharomyces cerevisiae, lui conférant la capacité de bio-transformer la tabersonine en vindoline, l’un des deux précurseurs finaux des alcaloïdes dimères. / Catharanthus roseus is a medicinal plant producing various types of monoterpene indole alkaloids (MIA) with a great interest in human health. Dimeric alkaloids such as vinblastine and vincristine are used in cancer chemotherapy and monomeric heteroyohimbine alkaloids exhibit various pharmacological activities. The production of these molecules in the plant is very complex. It requires a high level of tissular and subcellular compartmentalization and involves more than thirty enzymatic steps, some of which are largely unknown. In this context, the aim of this thesis was to elucidate several enzymatic steps of the MIA biosynthetic pathway. Our work allowed us to characterize new enzyme isoforms of cytochrome P450 and their associated reductases. They also resulted in the identification of new dehydrogenases and highlighted their interactions with the strictosidine synthase suggesting a directed biosynthesis towards various heteroyohimbine type of alkaloids. Finally, engineered yeast containing a segment of the MIA biosynthetic pathway was able to convert tabersonine into vindoline, one of the two final precursors of the dimeric alkaloids.

Catharanthus roseus est une plante tropicale de la famille des Apocynacées d’intérêt thérapeutique en raison de sa capacité à synthétiser des alcaloïdes indoliques monoterpéniques (AIM) utilisés en chimiothérapie anticancéreuse. La teneur en AIM in planta est très faible notamment en raison d’une haute compartimentalisation cellulaire et subcellulaire de la voie de biosynthèse. Si la compartimentalisation cellulaire était bien caractérisée, très peu de données de localisation subcellulaire in situ étaient disponibles au début de cette thèse. Une connaissance fine de cette compartimentalisation est cependant nécessaire pour identifier les transports inter-compartiment de métabolites intermédiaires, limitant potentiellement le flux métabolique, afin d’améliorer ensuite le rendement de biosynthèse des AIM par ingénierie métabolique. Dans ce contexte nous avons réalisé une étude exhaustive de la localisation subcellulaire des enzymes de cette voie par imagerie GFP dans des cellules de C. roseus transformées par biolistique permettant d’établir un nouveau modèle intégré d’organisation cellulaire et subcellulaire de la biosynthèse des AIM. / Catharanthus roseus is a tropical plant from the Apocynaceae family with a great therapeutic value due to its ability to synthesize monoterpene indole alkaloids (MIA) used in cancer treatment. The yields of these molecules in planta are very low due to a very high level of compartmentation of the biosynthetic pathway at both cellular and subcellular levels. While the cellular compartmentation was widely characterized, very few in situ subcellular localization data were available at the beginning of this PhD. An accurate knowledge of this compartmentation is necessary to identify intermediate metabolites transport events from one compartment to another one, in order to increase the MIA biosynthesis yield by metabolic engineering approaches. In this context we have proceed to the exhaustive study of the subcellular localization of these enzymes by in vivo GFP imaging in C. roseus cells transformed by biolistic. Potential interprotein interactions of these enzymes have also been studied by BiFC. Altogether, our results enabled us to draw an integrated model of the cellular and subcellular organization of MIA biosynthesis in situ.

Catharanthus roseus est une plante tropicale qui produit spécifiquement des alcaloïdes indoliques monoterpéniques (AIM) d’intérêt thérapeutique. Chez C. roseus, la branche terpénique incluant la voie du méthylérythritol phosphate (MEP) est considérée comme limitante et présente une régulation transcriptionnelle coordonnée en réponse aux hormones inductrices de l’accumulation alcaloïdique. Lors de ce travail, suite à des analyses bioinformatiques et à la caractérisation de promoteurs de gènes de la voie MEP, nous avons identifié de nouvelles familles de facteurs de transcription impliquées dans la régulation de la biosynthèse des AIM. Des membres de la famille des ZCT, des WRKY et des RR type B interagissent avec le promoteur du gène hds de la voie MEP et régulent son activité. Ces travaux ont permis d’approfondir les connaissances sur les réseaux transcriptionnels régulateurs de la biosynthèse des AIM. L’utilisation de ces nouveaux facteurs de transcription activateurs peut désormais être envisagée dans le cadre d’expériences d’ingénierie métabolique afin d’augmenter l’accumulation d’alcaloïdes d’intérêt pharmaceutique chez C. roseus. / Catharanthus roseus is a tropical plant producing specifically monoterpene indole alkaloids (MIA) of high interest due to their therapeutical values. In C. roseus cells, the terpenoid branch including the methyl erythritol phosphate pathway (MEP) provides the MIA terpenoid moiety and is regarded as limited for MIA biosynthesis. This branch presents a coordinated transcriptional regulation in response to hormonal signals leading to MIA production. In this context, bioinformatic analysises and functional characterization of MEP pathway gene promoters allowed the identification of new transcription factor families involved in the MIA pathway regulation. Members of ZCT proteins, WRKY and type B RR families specifically interact with the hds promoter from the MEP pathway and regulate its activity. This work permits to gain into insight the transcriptional network controlling the MIA biosynthesis. It is possible now to consider using transcription factor that act as activators and target genes from the terpenoid branch to increase the accumulation of alkaloids of pharmaceutical interest in C. roseus by metabolic engineering approaches.

Les alcaloïdes indoliques monoterpéniques (AIM) sont des molécules à propriétés anti-tumorales extraites de Catharanthus roseus. Leur coût de production et les besoins encore importants de ces médicaments en chimiothérapie, en font des cibles majeures pour la recherche de stratégies de production plus efficaces. L’objectif de ce travail vise à identifier de nouveaux facteurs de transcription (FT) régulateurs de la production des AIM. Cette étude porte plus particulièrement sur la caractérisation fonctionnelle et l’implication dans la régulation de la biosynthèse des AIM, de protéines de la famille des WRKY (CrWRKYs) et des protéines de type doigt de zinc (ZCTs) précédemment isolées au sein de l’EA2106 « Biomolécules et Biotechnologies Végétales ». Nos expériences ont révélé que, parmi ces protéines, CrWRKY22, CrWRKY32, ZCT1 et ZCT2 agissent en tant que facteurs de transcription et plus spécifiquement interagissent avec le promoteur du gène Crhds. Ce dernier code une enzyme de la voie du méthyl érythritol phosphate (MEP) considérée limitante pour la production des AIM. Ces travaux ont permis d’identifier de nouveaux FT ciblant la voie du MEP dont la régulation via les FT est encore peu élucidée à ce jour et d’envisager leur utilisation en ingénierie métabolique pour augmenter la production d’AIM par la modulation du flux terpénique chez C. roseus. / Monoterpene indole alkaloids (MIA) are molecules with anti-cancer properties from Catharanthus roseus. Their production cost and the important need in chemiotherapy make them major targets for the research of more efficient production strategies. The aim of this work is to identify new transcription factors (TF) that regulate MIA production. This study focuses especially on the functional characterization and the involvement in the MIA biosynthesis regulation, of proteins previously isolated in the EA2106 “Plant Biocompounds and Biotechnology” laboratory: 3 proteins that belong to the WRKY family (CrWRKYs) and 3 zinc finger proteins named ZCTs. Our experiments revealed that among them, CrWRKY22, CrWRKY32, ZCT1 and ZCT2 act as transcription factors and more specifically interact with the promoter of Crhds gene. Crhds encodes an enzyme of the methyl erythritol phosphate (MEP) pathway that is considered as limiting for MIA production. Our work allowed identifying new TFs targeting the MEP pathway those regulation through TFs is mostly unknown. Using such transcription factors in metabolic engineering could be now considered increasing MIA production by the modulation of terpenoid flux in C. roseus.