Many different chemicals are used in the everyday life, like detergents and pharmaceuticals. However, their production has a big impact on health and environment as much of the raw materials are not renewable and the standard ways of production in many cases includes toxic and environmentally hazardous components. As the population and as the life standard increases all over the planet, the demand for different important chemicals, like pharmaceuticals, will increase. A way to handle this is to apply the concept of Green chemistry, where biocatalysis, in the form of enzymes, is a very good alternative. Enzymes do not normally function in industrial processes and needs modifications through protein engineering to cope in such conditions. To be able to efficiently improve an enzyme, there is a need to understand the mechanism and characteristics of that enzyme. Acyloins (α-hydroxy ketones) are important building blocks in the synthesis of pharmaceuticals. In this thesis, the enzyme alcohol dehydrogenase A (ADH-A) from Rhodococcus ruber has been in focus, as it has been shown to display a wide substrate scope, also accepting aryl-substituted alcohols. The aim has been to study the usefulness of ADH-A as a biocatalyst towards production of acyloins and its activity with aryl-substituted vicinal diols and to study substrate-, regio-, and enantioselectivity of this enzyme. This thesis is based on four different papers where the focus of the first has been to biochemically characterize ADH-A and determine its mechanism, kinetics and its substrate-, regio-, and enantioselectivity. The second and third paper aims towards deeper understanding of some aspects of selectivity of ADH-A. Non-productive binding and its importance for enantioselectivity is studied in the second paper by evolving ADH-A towards increased activity with the least favored enantiomer through protein engineering. In the third paper, regioselectivity is in focus, where an evolved variant displaying reversed regioselectivity is studied. In the fourth and last paper ADH-A is studied towards the possibility to increase its activity towards aryl-substituted vicinal diols, with R-1-phenyl ethane-1,2-diol as the model substrate, and the possibility to link ADH-A with an epoxide hydrolase to produce acyloins from racemic epoxides.

Diferentes estratégias têm sido propostas a fim de melhorar o desempenho dos bioeletrodos utilizados nas biocélulas a combustíveis e nos biossensores. Por examplo, a funcionalização de eletrodos de carbono tem sido feita para esse fim. Neste estudo, propomos o desenvolvimento de fibras flexíveis de carbono (FFCs) funcionalizadas com grupos quinona e modificados com álcool desidrogenase (ADH) NAD-dependente para obter bioeletrodos para uma bio-eletrocatálise eficiente de etanol. Grupos quinona na superfície das FFCs foram obtidas utilizando o tratamento oxidativo com permanganato e também pelo ancoramento eletroquímico de antraquinona: ambas metodologias resultaram em bioeletrodos para a eletro-oxidação de NADH que pode aumentar a bio-eletrocatálise do etanol. De acordo dados espectroscópicos, microscópicos, e eletroquímicos, defeitos contendo grupos C=O nos eletrodos de FFCs são atribuídos à melhora na oxidação do NADH, aumentando a bio-eletrocatálise do etanol. Para se investigar o papel dos grupos quinona na eletro-oxidação do NADH, propomos uma configuração experimental baseado na espectroscopia de ressonância paramagnética de elétrons em modo operando (operando EPR). Com essa técnica, fomos capaz de mostrar a correlação entre o número de elétrons livres desemparelhados, a concentração superficial de quinonas e a oxidação do NADH com controle eletroquímico. Correlação para a concentração de spins revela um aumento no número de elétrons desemparelhados livres com o aumento do sobrepotencial aplicado e a oxidação do NADH, o que corrabora com a hipótese de que grupos quinona podem afetar a eletrocatálise rumo à oxidação do NADH a NAD+. É vislumbrado que operando EPR pode fornecer infromação útil para provar a dinâmica da transferência de elétrons em superfície de carbono e possa ser extendida a outros sistemas bioeletroquímicos. / There are several strategies to improve the performance of bioelectrodes applied in biosensors and biofuel cells. For instance, surface functionalization of the carbon-based electrodes has been used to this intend. Herein, we propose the development of flexible carbon fibers (FCFs) functionalized with quinone groups and modified with NAD-dependent alcohol dehydrogenase (ADH) to obtain bioelectrodes for efficient ethanol bio-electrocatalysis. Quinones groups on FCFs surfaces were obtained by using oxidative treatment with permanganate, and also by electrochemical grafting of anthraquinone: both these methodologies result in bioelectrodes for the electro-oxidation of NADH that can improve the ethanol bio-electrocatalysis. Based on spectroscopic, microscopic and electrochemical data, defects containing C=O groups on FCFs electrodes are attributed to improve the NADH oxidation, enhancing the ethanol bio-electrocatalysis. In order to investigate the role of quinone groups on the NADH electro-oxidation, we propose an experimental setup based on operando electron paramagnetic resonance spectroscopy (operando EPR). With this technique, we are able to show a correlation among the number of free unpaired electrons, surface concentration of quinones and NADH oxidation under electrochemical control. Correlation for the spin concentration reveals an increasing number of free unpaired electrons with increasing applied overpotential and NADH oxidation, which corroborates the hypothesis that quinone groups can act as electrocatalysts towards the oxidation of NADH to NAD+. It is glimpsed that operando EPR can provide useful information in probing the electron transfer dynamics on a carbon surface and may be extended to others bioelectrochemical systems.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:55:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JODIE DO AMARAL SODARIO.pdf: 8284737 bytes, checksum: 0998005f311495779270bf94c7d0d236 (MD5) Previous issue date: 2016-03-15 / Oral cavity cancers are considered a public health problem throughout the world and represent the sixth most common cancer. The main risk factors include tobacco, alcohol, micronutrient deficiency and the human papillomavirus (HPV). The metabolism of alcohol depends on the alcohol dehydrogenase (ADH), a family of enzymes with high frequency of genetic polymorphisms that give different individuals a wide range of susceptibility to metabolites. Thus, different genetic polymorphisms in ADH can interfere with the individual risk of cancer associated with alcohol consumption. The aim of this case-control study was to evaluate the frequency of SNP (SNP: single nucleotide polymorphism) in ADH1B gene in 61 patients with cancer of the oral cavity and in 66 healthy controls. The molecular study employed methods including polymerase chain reaction (PCR) associated to restriction fragment analysis (RFLP). The frequencies obtained for the genetic polymorphisms were calculated and compared in both groups, as well as the possible association between these polymorphisms and the characteristics of tumors. The results showed a higher prevalence of these tumors in the male population (74.3%), at ages above 45 years (88.5%), smokers (85.2%) and alcoholic (82.0%). Among the prognostic factors evaluated, the advanced stage (III and IV) was observed in 73.8% of cases and the involvement of regional lymph nodes in 39.3% of cases. Allele frequencies for ADH polymorphism R48H on group of cases were L = 82.8 and A = 17.2%, while in the control group were 79.4% and G = A = 20.6%. The genotypic frequencies obtained for the case group were AA = 16.0%; GA = 2.0% and GG = 81.0%, while for the control group, genotype frequencies were AA = 15.0%; GA = 12.0% and GG = 74.0%. The overall survival evaluated for the group was 49.9%. Significant differences in allele and genotype frequencies were observed between the groups or between the prognostic aspects evaluated. Epidemiological data from the oral cavity cancer have shown worrying trends, stressing the importance of promoting more studies related to this particular type of cancer. / Os cânceres de cavidade oral são considerados um problema de saúde pública em todo o mundo e representam a sexta neoplasia mais comum. Os principais fatores de risco incluem o tabaco, álcool, deficiência de micronutrientes e o Papilomavírus humano (HPV). O metabolismo do álcool depende da álcooldesidrogenase (ADH), uma família de enzimas com alta frequência de polimorfismos genéticos, que conferem aos diferentes indivíduos uma grande variação de suscetibilidade aos seus metabólitos. Assim, diferentes polimorfismos genéticos na ADH podem interferir no risco individual ao câncer associado ao etilismo. O objetivo deste estudo caso-controle foi avaliar a frequência de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP: single nucleotide polymorphism) no gene ADH1B em 61 pacientes com câncer de cavidade oral e em 66 controles saudáveis. O estudo empregou métodos moleculares incluindo a reação em cadeia da polimerase (PCR) associada à análise de fragmentos de restrição (RFLP). As frequências obtidas para os polimorfismos genéticos foram calculadas e comparadas nos dois grupos, bem como as possíveis associações entre esses polimorfismos e as características dos tumores. Os resultados mostraram uma maior prevalência desses tumores na população masculina (85,2%), em idades acima de 45 anos (88,5%), tabagistas (85,2%) e etilistas (82,0%). Dentre os fatores prognósticos avaliados, o estádio avançado (III e IV) foi observado em 73,8% dos casos e o comprometimento de linfonodos regionais em 39,3% dos casos. As frequências alélicas para o polimorfismo ADH R48Hno grupo de casos foram G=82,8 e A=17,2%, enquanto no grupo controle foram G=79,4% e A=20,6%. As frequências genotípicas obtidas para o grupo de casos foram AA=16,0%; GA=2,0% e GG=81,0%, enquanto que para o grupo controle, as frequências genotípicas foram AA=15,0%; GA=12,0% e GG=74,0%. A sobrevida global avaliada para o grupo foi de 49,9%. Diferenças significativas nas frequências alélicas e genotípicas não foram observadas entre os grupos e nem entre os aspectos prognósticos avaliados. Dados epidemiológicos do câncer de cavidade oral têm mostrado tendências preocupantes, alertando para a importância de se promover maiores estudos relacionados a este tipo particular de câncer.

O carcinoma epidermóide é uma neoplasia que pode ter origem do revestimento mucoso de vários sítios das vias aerodigestivas superiores, sendo a língua o sítio primário com maior incidência. Entre os fatores de risco para a doença estão a idade, as mutações genômicas, o hábito tabagista e principalmente o consumo de etanol. O etanol é considerado um agente cocarcinogênico no processo de desenvolvimento do câncer de boca. Por outro lado, o acetaldeído, subproduto da oxidação do etanol, é tóxico e participa diretamente na carcinogênese. Assim, polimorfismos genéticos que alteram a oxidação de etanol para acetaldeído promovendo seu acúmulo podem alterar o risco de câncer oral. Os resultados sugerem que pacientes portadores do polimorfismo do gene ADH1C Ile350Val possuem maior risco de tornarem-se etilistas crônicos (OR=2,0199), mas o risco de desenvolverem câncer não é alterado quando comparado aos não portadores. Já os portadores dos polimorfismos nos genes ADH1B Arg47His (OR=0,3445), CY2E1 (ins) (OR=0,3261) e ALDH2 (GA) (OR=0,4811) apresentaram menores riscos de desenvolverem câncer oral, mas estes polimorfismos não estavam associados ao risco de tornarem-se etilistas crônicos. Observou-se também uma possível interação entre a baixa atividade da enzima ALDH2 e a expressão do gene CYP2E1 como um fator protetor no desenvolvimento do câncer de boca. Entretanto, há necessidade de mais estudos para comprovar esses achados / Squamous cell carcinoma is a neoplasm that may originate from the mucosal tissue from various sites of the upper aerodigestive tract, the tongue being the primary site with the highest incidence. Among the risk factors for the disease are age, genomic mutations, smoking habit, and especially the consumption of ethanol. Ethanol is considered a co-carcinogenic agent in the development of oral cancer. Moreover, acetaldehyde, ethanol oxidation product, is toxic and is directly involved in carcinogenesis. Thus, genetic polymorphisms that alter the oxidation of ethanol to acetaldehyde by promoting its accumulation can alter the risk of oral cancer. The results suggest that patients with the ADH1C Ile350Val polymorphism have increased risk of becoming chronic drinkers (OR = 2.0199), but the risk of developing cancer is not changed when compared to non carriers. Since the carriers of polymorphisms in genes ADH1B Arg47His (OR = 0.3445), CY2E1 (ins) (OR =0.3261) and ALDH2 (GA) (OR = 0.4811) lower risk of developing oral cancer, but these polymorphisms were not associated with risk of becoming chronic drinkers .There was also a possible interaction between the low activity of the enzymeALDH2 and CYP2E1 gene expression as a protective factor in the development of oral cancer. However, we need more studies to confirm these findings

Submitted by Ricardo Cedraz Duque Moliterno (ricardo.moliterno@uefs.br) on 2015-07-27T23:03:07Z No. of bitstreams: 1 Disserta??o - Iv?n Sergio Col?s Gonzalez.pdf: 1019601 bytes, checksum: a974e9e520faa565d9469e1ff902ceed (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-27T23:03:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Disserta??o - Iv?n Sergio Col?s Gonzalez.pdf: 1019601 bytes, checksum: a974e9e520faa565d9469e1ff902ceed (MD5) Previous issue date: 2013-09-30 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Funda??o de Amparo ? Pesquisa do Estado da Bahia - FAPEB / In this work was investigated the biocatalytic action of fungus Periconia hispidula to perform reduction reactions of aromatic prochiral carbonyl compounds. Firstly, the influence of the reaction parameters (medium, time, amount of substrate, forms to use the biocatalyst) over the conversion rate and enantiomeric excess in the reduction of acetophenone was investigated. After the determination of the growth curve, the incubation time prior to addition of substrate, was evaluated (4 and 7 days). For 4 days of preincubation time, the best conversion rate to obtain the (S)-1-phenylethanol with e.e of 98% were achieved. Two types of biocatalysts were evaluated: growing cells and resting cells. The best results were obtained with growing cells. By comparing the results obtained from potato-dextrose (BD) culture medium and potato-dextrose (BD) supplemented with Fe 2+, BD medium supplemented with Fe 2+ (0.02 g / L) was selected. The influence of the amount of acetophenone (20 to 200 ?L) was also examined to evaluate the toxicity of the substrate. Quantities of the substrate higher than 100 ?L (0.1%) decreased also conversion rate but the enantiomeric excess. The applicability of this biocatalyst was also evaluated to reduce acetophenone derivates compounds such as 2, 3 and 4-nitroacetophenone, 2, 3 and 4-methylacetophenone? 2, 3 and 4-methoxyacetophenone, 2, 3 and 4-bromoacetophenone, 2, 3 and 4-fluoracetophenone, 2, 4-dimethylacetophenone, 2, 5-dimethylacetophenone? 4-ethylacetophenone, octanophenone, 1-indanone and 2-indanone. Chiral alcohols were obtained with conversion rates from 8% upto higher than 99% and the enantiomeric excess between 54% up to 100%, indicating that the fungus Periconia hispidula is a promising estereoselctive biocatalyst for use in processes for reducing carbonyl compounds. / Neste trabalho foi investigada a a??o biocatal?tica do fungo Periconia hispidula em rea??es de redu??o de compostos carbon?licos arom?ticos pr?-quirais. A influ?ncia de par?metros reacionais (meio, tempo, quantidade de substrato, forma de utiliza??o do biocatalisador) na convers?o e enantioseletividade da redu??o de acetofenona foi inicialmente avaliada. A partir da curva de crescimento, determinou-se o tempo de incuba??o pr?vio a adi??o de substrato (4 e 7 dias). Os melhores resultados de convers?o para a obten??o do (S)-1-feniletanol, com excesso enantiom?rico (e.e) de 98% foram atingidos ap?s quatro dias de incuba??o pr?via do micro-organismo. Duas formas de utiliza??o do biocatalisador foram avaliadas: c?lulas em crescimento e c?lulas em repouso. Os melhores resultados de convers?o foram obtidos com as c?lulas em crescimento. Pela compara??o entre meios de cultura batata-dextrose (BD) e batata-dextrose (BD) suplementado com Fe2+) selecionou-se o meio BD suplementado com Fe2+ (0,02 g/L). A influ?ncia da quantidade de acetofenona (entre 20 ?L e 200 ?L) tamb?m foi analisada com o objetivo de avaliar a toxicidade do substrato. Verificou-se que quantidades de substrato maiores a 100 uL (0,1%) levaram a queda da convers?o e da enantioseletividade. O biocatalisador tamb?m foi testado frente a 23 cetonas pr?-quirais: 2, 3 e 4-nitroacetofenona; 2, 3 e 4-metilacetofenona; 2, 3 e 4-metoxiacetofenona; 2, 3 e 4-bromoacetofenona; 2, 3 e 4-fluoracetofenona; 2,4-dimetilacetofenona; 2,5-dimetilacetofenona; 4-etilacetofenona, octanofenona, 1?indanona e 2-indanona. As convers?es dos alco?is quirais oscilaram entre 8% e 100% com excessos enantiom?ricos de 54 at? mais de 99%, demonstrando que o fungo Periconia hispidula ? um biocatalisador estereosseletivo promissor para aplica??o em processos de redu??o de compostos carbon?licos.

Biocélulas a combustível (BFCs) são definidas como dispositivos bioeletroquímicos que utilizam componentes biológicos, como enzimas ou microrganismos, para converter energia química em energia elétrica. Neste estudo, reporta-se o desenvolvimento de um bioeletrodo composto por fibras flexíveis de carbono (FFC) modificadas com a enzima álcool desidrogenase (ADH), o qual foi utilizado juntamente com a levedura Saccharomyces cerevisiae , sendo enzima e microrganismos usados como biocatalisadores cooperativos para bioprodução e oxidação de etanol. A glicose é oxidada pelas células de levedura sob condições anaeróbias, e o etanol formado pela fermentação alcóolica é, em seguida, oxidado a acetaldeído pela enzima ADH. A oxidação de etanol pela ADH resulta ainda, na redução da molécula de nicotinamida adenina dinucleotídeo, NAD+ a NADH. Posteriormente, o NADH formado nessa reação é eletroquimicamente oxidado a NAD+ na superfície do bioeletrodo de FFC baseado em ADH (FFC-ADH). Avaliou-se a influência da temperatura e do pH na bioeletrocatálise de etanol pela ADH e a melhor resposta obtida foi em 40 ºC e pH 8,5. Além disso, obteve-se uma excelente correlação linear entre os valores de concentração de etanol e densidade de corrente, indicando que a resposta bioeletrocatalítica da ADH é diretamente proporcional à concentração de etanol produzido a partir da fermentação. O conceito de que microrganismos e enzimas podem trabalhar cooperativamente para produzir uma nova classe de bioeletrodos, foi introduzido nesse trabalho. Por fim, demonstrou-se, que o bioeletrodo cooperativo pode ser aplicado com sucesso em uma BFC, utilizando o biocátodo de difusão de gás contendo a enzima bilirrubina oxidase (BOx) imobilizada em sua superfície. / Biofuel cells (BFCs) are defined as bioelectrochemical devices that use biological components, such as enzymes or microorganisms, to convert chemical energy into electric energy. In this study, we report the development of a bioelectrode composed of flexible carbon fibers (FCF) modified with the enzyme alcohol dehydrogenase (ADH) together with Saccharomyces cerevisiae yeast, being enzyme and microorganisms used as cooperative biocatalysts for bioproduction and oxidation of ethanol. Glucose is oxidized by the yeast cells in anaerobic conditions, and ethanol is produced through alcoholic fermentation and then it is oxidized to acetaldehyde by the ADH enzyme. The ethanol oxidation by ADH also results in the reduction of the nicotinamide adenine dinucleotide molecule, NAD+ to NADH. Subsequently, the NADH produced in this reaction is electrochemically oxidized to NAD+ on the surface of the FCF bioelectrode based on ADH (FCF-ADH). The influence of temperature and pH on the bioelectrocatalysis of ethanol was evaluated and the best performance was found at 40 ºC and pH 8.5. Additionally, the results demonstrated an excellent linear correlation between the ethanol concentration and the current generated, which indicates that the bioelectrocatalytic response of ADH is directly proportional to concentration of ethanol produced from the fermentation. The present study has introduced the concept that microorganisms and enzymes can work cooperatively to produce a new class of bioelectrodes. Finally, it has been demonstrated that the cooperative bioelectrode can be applied successfully to BFC using a gas-diffusion biocathode containing the bilirubin oxidase enzyme (BOx) immobilized on its surface.

Nesta dissertação de mestrado foram estudadas duas bactérias, Sphingobacterium sp e Arthrobacter atrocyaneus, produtoras de enzimas álcool desidrogenases que se mostraram capazes de catalisar reações de oxidação enantiosseletiva de alcoóis secundários racêmicos. Inicialmente foram avaliados alguns parâmetros para a realização da resolução cinética do (RS)-1-feniletanol, assim como quantidade de substrato, biomassa das bactérias (Sphingobacterium sp e Arthrobacter atrocyaneus) e tempo reacional necessário para a oxidação completa de um dos enantiômeros do substrato. Nas reações com a bactéria Sphingobacterium sp (R1AC23) observou-se a presença de álcool desidrogenase com alta atividade catalítica, porém com moderada enantiosseletividade, pois em alguns casos observou-se a oxidação completa dos alcoóis para-substituídos derivados do (RS)-1- feniletanol a suas correspondentes cetonas. Com o estudo das reações do (RS)-1-feniletanol e a bactéria Arthrobacter atrocyaneus (R1AF57) determinou-se os principais parâmetros reacionais para alcançar uma excelente resolução cinética. Sendo assim, aplicou-se essa metodologia para diferentes alcoóis secundários em dois meios reacionais diferentes: com células em crescimento e com células ressuspensas em tampão fosfato. A atividade catalítica foi mais eficiente com as células em crescimento com conversões próximas de 50% e excesso enantiomérico >99% na maioria dos casos, destacando-se os derivados do (RS)-1-feniletanol para e meta substituídos. Empregou-se a Arthrobacter atrocyaneus em testes de resolução cinética dinâmica (RCD). Como durante as reações de oxidação um co-produto é uma cetona, estudou-se o emprego in situ do NaBH4 como redutor desse composto. Com isso, tem-se um ciclo reacional de oxidação-redução. Sendo assim, por estereoinversão, foi possível alcançar rendimentos maiores que 50% do álcool enantiomericamente puro. Com o (RS)-1-(4-metilfenil)-etanol como substrato, obteve-se o álcool enantiomericamente puro com rendimento de 79% e excesso enantiomérico >99% / In this dissertation two bacterial strains were studied, Arthrobacter atrocyaneus and Sphingobacterium sp, which are alcohol dehydrogenases producers that were able to catalyse racemic secondary alcohols enantioselective oxidation. Initially, some reaction parameters to carry out the kinetic resolution of (RS)-1- phenylethanol were evaluated, such as substrate amount, bacterial biomass (Arthrobacter atrocyaneus and Sphingobacterium sp) and the reaction time for complete oxidation of one enantiomer of the substrate. In the reactions with Sphingobacterium sp (R1AC23) was observed the presence of alcohol dehydrogenase with high catalytic activity and moderate selective. Therefore, in some cases, the total oxidation of the both enantiomers of (RS)-1- phenylethanol para-substitued derivatives to the corresponding ketones were observed. By studying the reactions of (RS)-1-phenylethanol and Arthrobacter atrocyaneus (R1AF57), the reaction parameters to achieve excellent kinetic resolution were determined. Therefore, this methodology was applied to different secondary alcohols under two different reaction media: with growing cells and resting cells in phosphate buffer. The catalytic activity was more efficient with growing cells. The conversions were next to 50% and enantiomeric excess> 99% in most of the cases, especially those reactions with alcohols derived from (RS)- 1-phenylethanol para and meta substituted. Arthrobacter atrocyaneus was employed in dynamic kinetic resolution (DKR). As during the oxidation reactions, a ketone co-product is obtained, the use of NaBH4 was studied to reduce this compound in situ. Thus, an oxidation-reduction reactional cycle was achieved. Then, by estereoinversion it was possible to achieve yields higher than 50% of the pure enantiomerically alcohol. With (RS)-1-(4-methylphenyl)-ethanol as substrate, enantiomeric excess > 99% and yield 79% of pure enantiomerically alcohol was obtained

Biocélulas a combustível (BFCs) são definidas como dispositivos bioeletroquímicos que utilizam componentes biológicos, como enzimas ou microrganismos, para converter energia química em energia elétrica. Neste estudo, reporta-se o desenvolvimento de um bioeletrodo composto por fibras flexíveis de carbono (FFC) modificadas com a enzima álcool desidrogenase (ADH), o qual foi utilizado juntamente com a levedura Saccharomyces cerevisiae , sendo enzima e microrganismos usados como biocatalisadores cooperativos para bioprodução e oxidação de etanol. A glicose é oxidada pelas células de levedura sob condições anaeróbias, e o etanol formado pela fermentação alcóolica é, em seguida, oxidado a acetaldeído pela enzima ADH. A oxidação de etanol pela ADH resulta ainda, na redução da molécula de nicotinamida adenina dinucleotídeo, NAD+ a NADH. Posteriormente, o NADH formado nessa reação é eletroquimicamente oxidado a NAD+ na superfície do bioeletrodo de FFC baseado em ADH (FFC-ADH). Avaliou-se a influência da temperatura e do pH na bioeletrocatálise de etanol pela ADH e a melhor resposta obtida foi em 40 ºC e pH 8,5. Além disso, obteve-se uma excelente correlação linear entre os valores de concentração de etanol e densidade de corrente, indicando que a resposta bioeletrocatalítica da ADH é diretamente proporcional à concentração de etanol produzido a partir da fermentação. O conceito de que microrganismos e enzimas podem trabalhar cooperativamente para produzir uma nova classe de bioeletrodos, foi introduzido nesse trabalho. Por fim, demonstrou-se, que o bioeletrodo cooperativo pode ser aplicado com sucesso em uma BFC, utilizando o biocátodo de difusão de gás contendo a enzima bilirrubina oxidase (BOx) imobilizada em sua superfície. / Biofuel cells (BFCs) are defined as bioelectrochemical devices that use biological components, such as enzymes or microorganisms, to convert chemical energy into electric energy. In this study, we report the development of a bioelectrode composed of flexible carbon fibers (FCF) modified with the enzyme alcohol dehydrogenase (ADH) together with Saccharomyces cerevisiae yeast, being enzyme and microorganisms used as cooperative biocatalysts for bioproduction and oxidation of ethanol. Glucose is oxidized by the yeast cells in anaerobic conditions, and ethanol is produced through alcoholic fermentation and then it is oxidized to acetaldehyde by the ADH enzyme. The ethanol oxidation by ADH also results in the reduction of the nicotinamide adenine dinucleotide molecule, NAD+ to NADH. Subsequently, the NADH produced in this reaction is electrochemically oxidized to NAD+ on the surface of the FCF bioelectrode based on ADH (FCF-ADH). The influence of temperature and pH on the bioelectrocatalysis of ethanol was evaluated and the best performance was found at 40 ºC and pH 8.5. Additionally, the results demonstrated an excellent linear correlation between the ethanol concentration and the current generated, which indicates that the bioelectrocatalytic response of ADH is directly proportional to concentration of ethanol produced from the fermentation. The present study has introduced the concept that microorganisms and enzymes can work cooperatively to produce a new class of bioelectrodes. Finally, it has been demonstrated that the cooperative bioelectrode can be applied successfully to BFC using a gas-diffusion biocathode containing the bilirubin oxidase enzyme (BOx) immobilized on its surface.

Nesta dissertação de mestrado foram estudadas duas bactérias, Sphingobacterium sp e Arthrobacter atrocyaneus, produtoras de enzimas álcool desidrogenases que se mostraram capazes de catalisar reações de oxidação enantiosseletiva de alcoóis secundários racêmicos. Inicialmente foram avaliados alguns parâmetros para a realização da resolução cinética do (RS)-1-feniletanol, assim como quantidade de substrato, biomassa das bactérias (Sphingobacterium sp e Arthrobacter atrocyaneus) e tempo reacional necessário para a oxidação completa de um dos enantiômeros do substrato. Nas reações com a bactéria Sphingobacterium sp (R1AC23) observou-se a presença de álcool desidrogenase com alta atividade catalítica, porém com moderada enantiosseletividade, pois em alguns casos observou-se a oxidação completa dos alcoóis para-substituídos derivados do (RS)-1- feniletanol a suas correspondentes cetonas. Com o estudo das reações do (RS)-1-feniletanol e a bactéria Arthrobacter atrocyaneus (R1AF57) determinou-se os principais parâmetros reacionais para alcançar uma excelente resolução cinética. Sendo assim, aplicou-se essa metodologia para diferentes alcoóis secundários em dois meios reacionais diferentes: com células em crescimento e com células ressuspensas em tampão fosfato. A atividade catalítica foi mais eficiente com as células em crescimento com conversões próximas de 50% e excesso enantiomérico >99% na maioria dos casos, destacando-se os derivados do (RS)-1-feniletanol para e meta substituídos. Empregou-se a Arthrobacter atrocyaneus em testes de resolução cinética dinâmica (RCD). Como durante as reações de oxidação um co-produto é uma cetona, estudou-se o emprego in situ do NaBH4 como redutor desse composto. Com isso, tem-se um ciclo reacional de oxidação-redução. Sendo assim, por estereoinversão, foi possível alcançar rendimentos maiores que 50% do álcool enantiomericamente puro. Com o (RS)-1-(4-metilfenil)-etanol como substrato, obteve-se o álcool enantiomericamente puro com rendimento de 79% e excesso enantiomérico >99% / In this dissertation two bacterial strains were studied, Arthrobacter atrocyaneus and Sphingobacterium sp, which are alcohol dehydrogenases producers that were able to catalyse racemic secondary alcohols enantioselective oxidation. Initially, some reaction parameters to carry out the kinetic resolution of (RS)-1- phenylethanol were evaluated, such as substrate amount, bacterial biomass (Arthrobacter atrocyaneus and Sphingobacterium sp) and the reaction time for complete oxidation of one enantiomer of the substrate. In the reactions with Sphingobacterium sp (R1AC23) was observed the presence of alcohol dehydrogenase with high catalytic activity and moderate selective. Therefore, in some cases, the total oxidation of the both enantiomers of (RS)-1- phenylethanol para-substitued derivatives to the corresponding ketones were observed. By studying the reactions of (RS)-1-phenylethanol and Arthrobacter atrocyaneus (R1AF57), the reaction parameters to achieve excellent kinetic resolution were determined. Therefore, this methodology was applied to different secondary alcohols under two different reaction media: with growing cells and resting cells in phosphate buffer. The catalytic activity was more efficient with growing cells. The conversions were next to 50% and enantiomeric excess> 99% in most of the cases, especially those reactions with alcohols derived from (RS)- 1-phenylethanol para and meta substituted. Arthrobacter atrocyaneus was employed in dynamic kinetic resolution (DKR). As during the oxidation reactions, a ketone co-product is obtained, the use of NaBH4 was studied to reduce this compound in situ. Thus, an oxidation-reduction reactional cycle was achieved. Then, by estereoinversion it was possible to achieve yields higher than 50% of the pure enantiomerically alcohol. With (RS)-1-(4-methylphenyl)-ethanol as substrate, enantiomeric excess > 99% and yield 79% of pure enantiomerically alcohol was obtained

O carcinoma epidermóide é uma neoplasia que pode ter origem do revestimento mucoso de vários sítios das vias aerodigestivas superiores, sendo a língua o sítio primário com maior incidência. Entre os fatores de risco para a doença estão a idade, as mutações genômicas, o hábito tabagista e principalmente o consumo de etanol. O etanol é considerado um agente cocarcinogênico no processo de desenvolvimento do câncer de boca. Por outro lado, o acetaldeído, subproduto da oxidação do etanol, é tóxico e participa diretamente na carcinogênese. Assim, polimorfismos genéticos que alteram a oxidação de etanol para acetaldeído promovendo seu acúmulo podem alterar o risco de câncer oral. Os resultados sugerem que pacientes portadores do polimorfismo do gene ADH1C Ile350Val possuem maior risco de tornarem-se etilistas crônicos (OR=2,0199), mas o risco de desenvolverem câncer não é alterado quando comparado aos não portadores. Já os portadores dos polimorfismos nos genes ADH1B Arg47His (OR=0,3445), CY2E1 (ins) (OR=0,3261) e ALDH2 (GA) (OR=0,4811) apresentaram menores riscos de desenvolverem câncer oral, mas estes polimorfismos não estavam associados ao risco de tornarem-se etilistas crônicos. Observou-se também uma possível interação entre a baixa atividade da enzima ALDH2 e a expressão do gene CYP2E1 como um fator protetor no desenvolvimento do câncer de boca. Entretanto, há necessidade de mais estudos para comprovar esses achados / Squamous cell carcinoma is a neoplasm that may originate from the mucosal tissue from various sites of the upper aerodigestive tract, the tongue being the primary site with the highest incidence. Among the risk factors for the disease are age, genomic mutations, smoking habit, and especially the consumption of ethanol. Ethanol is considered a co-carcinogenic agent in the development of oral cancer. Moreover, acetaldehyde, ethanol oxidation product, is toxic and is directly involved in carcinogenesis. Thus, genetic polymorphisms that alter the oxidation of ethanol to acetaldehyde by promoting its accumulation can alter the risk of oral cancer. The results suggest that patients with the ADH1C Ile350Val polymorphism have increased risk of becoming chronic drinkers (OR = 2.0199), but the risk of developing cancer is not changed when compared to non carriers. Since the carriers of polymorphisms in genes ADH1B Arg47His (OR = 0.3445), CY2E1 (ins) (OR =0.3261) and ALDH2 (GA) (OR = 0.4811) lower risk of developing oral cancer, but these polymorphisms were not associated with risk of becoming chronic drinkers .There was also a possible interaction between the low activity of the enzymeALDH2 and CYP2E1 gene expression as a protective factor in the development of oral cancer. However, we need more studies to confirm these findings