As lipases têm um papel importante no desenvolvimento da biotecnologia e são empregadas na química orgânica como biocatalisadores com alta regio- quimio- e enantiosseletividade. Além de permitir sínteses mais sustentáveis e que estão em concordância com os princípios da Química Verde. A resolução enzimática de aminas racêmicas tem se mostrado uma maneira eficiente de obter aminas enantiomericamente puras, que podem ser empregadas na síntese assimétrica de fármacos e agroquímicos. Neste trabalho a resolução enzimática de 4 aminas primárias sendo elas 2-amino-heptano 1, 2-metil-cicloexil amina 3, 1-metil-3-fenilpropilamina 2, 1,2,3,4-tetra-hidro-1-naftilamina 4, foram estudadas obtendo-se resultados relevantes. Para a 2-amino-heptano 1 resultados semelhantes aos da literatura foram obtidos com uma redução de 2,4 vezes no tempo reacional quando a resolução cinética foi em hexano na presença de CAL-B e acetato de etila como acilante obteve-se uma conversão na (R)-N-(1-metil-hexil)acetamida 4 de 42% e um excesso enantiomérico de 88% (tempo = 7h). Observaram-se também os efeitos da concentração de lipase no meio reacional, da temperatura e de diferentes solventes frente a 11 lipases. Os primeiros estudos de resolução cinética enzimática com a 2-metilcicloexil-amina 3 são apresentados neste trabalho com conversões de até 98% porém sem excesso enantiomérico. Uma outra característica das lipases é a capacidade de catalisar reações diferentes da sua função natural (promiscuidade), o que permite que elas catalisem reações de adição de Michael, além de suas reações normais que são a hidrólise e esterificação. A adição de Michael catalisada por lipases entre as 4 aminas primárias já citadas e acrilonitrila foi estudada com e sem a influência da irradiação micro-ondas, demonstrando a maior estabilidade de lipases imobilizadas sob irradiação micro-ondas. Os adutos de Michael obtidos (3-[(1-metil-hexil)amino]propanonitrila 9, 3-[(1-metil-3-fenilpropil) amino]propanonitrila 10, 3-[(2-metil cicloexil)amino]propanonitrila 11 e 3-(1,2,3,4-tetra-hidronaftaleno-1-amino)propanonitrila 12) foram sintetizados pela primeira vez com a metodologia onde foi utilizada a água, acrilonitrila e irradiação micro-ondas e os adutos 9, 10 e 11 não são descritos na literatura. Outro viés do trabalho foi a clonagem e expressão da álcool desidrogenase de Bacillus subtilis que foi clonada, expressa e purificada com sucesso. O interesse em tal enzima deve-se a resultados obtidos na literatura onde a utilização de células íntegras de B. subtilis apresentou a redução de cetonas a álcoois com alta enantiosseletividade. / Lipases present an important role in the development of biotechnology and are employed as biocatalysts in organic chemistry with high regio-, quimioand enantioselectivity. Besides allowing more sustainable syntheses that are consistent with the principles of Green Chemistry. The enzymatic resolution of amines has been shown to be an efficient way to obtain enantiomerically pure amines, which can be used in asymmetric synthesis of pharmaceuticals and agrochemicals. In this work the enzymatic resolution of 4 primary amines them being 2-amino-heptane textbf 1, 2-methyl-cyclohexyl amine 3, 1-methyl-3-phenylpropylamine 2 1.2 ,3,4-tetrahydro-1-naphthylamine 4 were studied by obtaining relevant results. For the 2-amino-heptane 1 promoted results similar to the literature and were obtained with a 2.4 times reduction of the reactional time when the kinetic resolution was in hexane in the presence of CAL-B and ethyl acetate as acylating obtained a conversion in (R)-N-(1-methyl-cyclohexyl) acetamide 4 by 42 % and an enantiomeric excess of 88 % (time = 7h). We studied the effects of the concentration of lipase in the reaction, temperature and solvent using 11 different lipases. The first studies of enzymatic kinetic resolution with 2-methyl-cyclohexyl- amine 3 are presented in this work with conversions up to 98% but without enantiomeric excess. The ability of lipases to catalyze reactions with different natural function (promiscuity) is an important property, which allows them to catalyze Michael addition reactions beyond their normal reactions, the hydrolysis and esterification. The Michael addition catalyzed by lipases between the four aforementioned primary amines and acrylonitrile was studied with and without the influence of microwave irradiation, demonstrating the greater stability of immobilized lipases under microwave irradiation. The Michael adducts obtained (3 - [(1-methylhexyl) amino] propanonitrile 9, 3 - [(1-methyl-3-phenylpropyl) amino] propanonitrile 10, 3 - [(2 - methyl cyclohexyl) amino] propanonitrile 11 and 3 - (1,2,3,4-tetrahydronaphthalene-1-amino) propanonitrile 12) were first synthesized with the method where water is used, acrylonitrile and microwave radiation, the adducts 9,10 and 11 are not described in the literature. Another investigation of this study was the cloning and expression of alcohol desidrogrenase of Bacillus subtilis which has been cloned, expressed and purified successfully. Interest in the enzyme due to results in the literature where the use of whole cells of B. subtilis showed the reduction of ketones with high enantioselectivity.

As lipases têm um papel importante no desenvolvimento da biotecnologia e são empregadas na química orgânica como biocatalisadores com alta regio- quimio- e enantiosseletividade. Além de permitir sínteses mais sustentáveis e que estão em concordância com os princípios da Química Verde. A resolução enzimática de aminas racêmicas tem se mostrado uma maneira eficiente de obter aminas enantiomericamente puras, que podem ser empregadas na síntese assimétrica de fármacos e agroquímicos. Neste trabalho a resolução enzimática de 4 aminas primárias sendo elas 2-amino-heptano 1, 2-metil-cicloexil amina 3, 1-metil-3-fenilpropilamina 2, 1,2,3,4-tetra-hidro-1-naftilamina 4, foram estudadas obtendo-se resultados relevantes. Para a 2-amino-heptano 1 resultados semelhantes aos da literatura foram obtidos com uma redução de 2,4 vezes no tempo reacional quando a resolução cinética foi em hexano na presença de CAL-B e acetato de etila como acilante obteve-se uma conversão na (R)-N-(1-metil-hexil)acetamida 4 de 42% e um excesso enantiomérico de 88% (tempo = 7h). Observaram-se também os efeitos da concentração de lipase no meio reacional, da temperatura e de diferentes solventes frente a 11 lipases. Os primeiros estudos de resolução cinética enzimática com a 2-metilcicloexil-amina 3 são apresentados neste trabalho com conversões de até 98% porém sem excesso enantiomérico. Uma outra característica das lipases é a capacidade de catalisar reações diferentes da sua função natural (promiscuidade), o que permite que elas catalisem reações de adição de Michael, além de suas reações normais que são a hidrólise e esterificação. A adição de Michael catalisada por lipases entre as 4 aminas primárias já citadas e acrilonitrila foi estudada com e sem a influência da irradiação micro-ondas, demonstrando a maior estabilidade de lipases imobilizadas sob irradiação micro-ondas. Os adutos de Michael obtidos (3-[(1-metil-hexil)amino]propanonitrila 9, 3-[(1-metil-3-fenilpropil) amino]propanonitrila 10, 3-[(2-metil cicloexil)amino]propanonitrila 11 e 3-(1,2,3,4-tetra-hidronaftaleno-1-amino)propanonitrila 12) foram sintetizados pela primeira vez com a metodologia onde foi utilizada a água, acrilonitrila e irradiação micro-ondas e os adutos 9, 10 e 11 não são descritos na literatura. Outro viés do trabalho foi a clonagem e expressão da álcool desidrogenase de Bacillus subtilis que foi clonada, expressa e purificada com sucesso. O interesse em tal enzima deve-se a resultados obtidos na literatura onde a utilização de células íntegras de B. subtilis apresentou a redução de cetonas a álcoois com alta enantiosseletividade. / Lipases present an important role in the development of biotechnology and are employed as biocatalysts in organic chemistry with high regio-, quimioand enantioselectivity. Besides allowing more sustainable syntheses that are consistent with the principles of Green Chemistry. The enzymatic resolution of amines has been shown to be an efficient way to obtain enantiomerically pure amines, which can be used in asymmetric synthesis of pharmaceuticals and agrochemicals. In this work the enzymatic resolution of 4 primary amines them being 2-amino-heptane textbf 1, 2-methyl-cyclohexyl amine 3, 1-methyl-3-phenylpropylamine 2 1.2 ,3,4-tetrahydro-1-naphthylamine 4 were studied by obtaining relevant results. For the 2-amino-heptane 1 promoted results similar to the literature and were obtained with a 2.4 times reduction of the reactional time when the kinetic resolution was in hexane in the presence of CAL-B and ethyl acetate as acylating obtained a conversion in (R)-N-(1-methyl-cyclohexyl) acetamide 4 by 42 % and an enantiomeric excess of 88 % (time = 7h). We studied the effects of the concentration of lipase in the reaction, temperature and solvent using 11 different lipases. The first studies of enzymatic kinetic resolution with 2-methyl-cyclohexyl- amine 3 are presented in this work with conversions up to 98% but without enantiomeric excess. The ability of lipases to catalyze reactions with different natural function (promiscuity) is an important property, which allows them to catalyze Michael addition reactions beyond their normal reactions, the hydrolysis and esterification. The Michael addition catalyzed by lipases between the four aforementioned primary amines and acrylonitrile was studied with and without the influence of microwave irradiation, demonstrating the greater stability of immobilized lipases under microwave irradiation. The Michael adducts obtained (3 - [(1-methylhexyl) amino] propanonitrile 9, 3 - [(1-methyl-3-phenylpropyl) amino] propanonitrile 10, 3 - [(2 - methyl cyclohexyl) amino] propanonitrile 11 and 3 - (1,2,3,4-tetrahydronaphthalene-1-amino) propanonitrile 12) were first synthesized with the method where water is used, acrylonitrile and microwave radiation, the adducts 9,10 and 11 are not described in the literature. Another investigation of this study was the cloning and expression of alcohol desidrogrenase of Bacillus subtilis which has been cloned, expressed and purified successfully. Interest in the enzyme due to results in the literature where the use of whole cells of B. subtilis showed the reduction of ketones with high enantioselectivity.

Neste trabalho, foi avaliada a reatividade de compostos orgânicos contendo boro frente a reações catalisadas por enzimas. Diferentes exemplos de álcoois secundários quirais contendo boro foram acetilados enantiosseletivamente pela lipase de Candida antarctica (CALB). Todas as reações ocorreram com excelente enantiosseletividade (E >200) e ambos os produtos acetilados, bem como os álcoois remanescentes foram obtidos com alto excesso enantiomérico (ee >99%). Além da resolução cinética enzimática, foi avaliado também o processo de resolução cinética dinâmica quimio-enzimática, empregando complexos de rutênio como agentes de racemização. Após estabelecer as condições adequadas para a reação, foi possível obter o produto acetilado de configuração-(R) com 83% de conversão, mantendo a enantiosseletividade observada na reação de resolução cinética enzimática. Como extensão ao trabalho realizado com os álcoois contendo boro, foi estudada a resolução cinética de aminas primárias quirais contendo boro. Foram avaliadas diversas condições reacionais para alcançar a máxima resolução cinética destas aminas via acilação enantiosseletiva catalisada pela lipase CALB. Excelente enantiosseletividade (E >200) e altos excessos enantioméricos (até >99%) foram obtidos utilizando acetato de etila tanto como reagente doador de acila como solvente da reação. Adicionalmente, foi investigada a reação de biorredução de cetonas pró-quirais contendo boro. Os melhores resultados foram obtidos com as enzimas álcool desidrogenases (ADHs) purificadas dos microorganismos Rhodococcus ruber e Lactobacillus brevis. A ADH de R. ruber (ADH-A) promoveu a biorredução das cetonas aos respectivos álcoois de configuração-(R) com excelente enantiosseletividade (ee >99%), enquanto a ADH de L. brevis (ADH-LB) catalisou a redução de alguns exemplos de cetonas aos respectivos álcoois de configuração-(S), também com excelente enantiosseletividade. / In this work, was evaluated the reactivity of boron-containing organic compounds in enzyme-catalyzed reactions. Different examples of boron-containing chiral secondary alcohols were resolved by enantioselective acetylation mediated by lipase from Candida. antarctica (CALB). All reactions showed excellent enantioselectivities (E >200) and both remaining substrates and acetylated product were obtained in high enantiomeric excesses (up to >99%). Besides the enzymatic kinetic resolution, the chemoenzymatic dynamic kinetic resolution was also evaluated, using ruthenium complexes as racemization agents. After establishing the best conditions, the acetylated (R)-product was obtained with 83% conversion, maintaining the high enantioselectivity observed in the enzymatic kinetic resolution. As an expansion of work with boron-containing alcohols, the kinetic resolution of boron-containing chiral amines was studied. Several reaction conditions were studied to achieve the kinetic resolution of boron-containing amines via enantioselective acylation mediated by CAL-B. Excellent enantioselectivity (E >200) and high enantiomeric excess (up to >99%) of both the remaining amines and amides were obtained using ethyl acetate as both acyl donor and the reaction solvent. Additionally, the bioreduction of pro-chiral boron-containing ketones was investigated. The best results were obtained with purified alcohol dehydrogenases (ADH) from Rhodococcus ruber and Lactobacillus brevis. The ADH from R. ruber (ADH-A) mediated the bioreduction of ketones to their respective (R)-alcohols with excellent enantioselectivity (ee >99%), while the ADH from L. brevis (ADH-LB) catalyzed the reduction of some ketones to their respective (S)-alcohols, also with excellent enantioselectivity (ee >99%).

Para a bioeletrocatálise de oxidação de etanol, a alteração da superfície eletródica e a otimização do processo de imobilização enzimática se fazem necessárias. Neste cenário, as fibras flexíveis de carbono (FFC) merecem destaque, pois além de sua superfície ser facilmente modificada devido à presença de carbono sp2, as mesmas possuem alta resistência mecânica e elasticidade, combinadas com a alta condutividade elétrica e térmica. Nesta tese de doutorado, apresenta-se como obter bioeletrodos de FFC modificadas com a enzima álcool desidrogenase (ADH) NAD-dependente, visando também aprimorar a oxidação da coenzima NADH (dinucleotídeo de nicotinamida e adenina). Os resultados mostram que quando as FCF são previamente submetidas a um tratamento oxidativo em meio ácido (KMnO4/H2SO4), obtém-se bioeletrodos estáveis, robustos e com alta área superficial. Além disso, observou-se que esses eletrodos possuem grupos funcionais contendo oxigênio que auxiliam na bioeletrocatálise de oxidação do etanol. Presume-se que presença de grupos quinonas seja responsável por facilitar a regeneração da coenzima, ou seja, estes grupos atuam decisivamente na oxidação do NADH. A alta qualidade dos bioeletrodos possibilitou manter a atividade catalítica da ADH por longo prazo, propriedade essa crucial para o estudo da oxidação do etanol acoplada à espectrometria de massas (DEMS). Devido a este estudo, foi possível observar concomitantemente a regeneração da coenzima (NADH -> NAD+) e a geração de acetaldeído como produto de bioeletroxidação do etanol, ambos em estado estacionário. Em suma, o estudo aqui apresentado introduz uma abordagem que combina não só o desenvolvimento de fibras de carbono tratadas quimicamente para aplicação em bioeletrocatálise, mas também um foco inédito no acoplamento entre a espectrometria de massas e a bioeletroquímica para a resolução de mecanismos enzimáticos. / Regarding the bioelectrocatalysis of the ethanol oxidation, the electrodic surface modification and the optimization of enzymatic immobilization are necessary. In this scenario, the flexible carbon fibers (FCF) are noteworthy, because besides their surface can be modified in an easy way due the presence of carbon sp2, they have high mechanical resistance and elasticity, combined with high electrical and thermal conductivity. In this doctoral thesis, it is presented how to obtain bioelectrodes of FFC modified with the enzyme alcohol dehydrogenase (ADH) NAD-dependent, as well as to improve the oxidation of the coenzyme NADH (nicotinamide adenine dinucleotide). The results show that when FCF is previously submitted to an oxidative treatment in acidic medium (KMnO4/H2SO4), stable, robust and high surface area bioelectrodes are obtained. In addition, it was observed that these electrodes have oxygen-containing functional groups that improve the bioelectrocatalysis of ethanol oxidation. There is proposed that the presence of quinone groups is responsible for facilitating the regeneration of the coenzyme, i. e., these groups act decisively in the oxidation of NADH. The high quality of the bioelectrodes allowed it to maintain the catalytic activity of the ADH for long term, property crucial for the study of the oxidation of ethanol coupled to mass spectrometry (DEMS). By using DEMS, there were possible to observe coenzyme regeneration and the generation of acetaldehyde as a bioelectrooxidation product of ethanol, both at steady state, which were simultaneously observed. In summary, the present study introduces an to an approach that combines not only the development of chemically treated carbon fibers for application in bioelectrocatalysis, but also an unprecedented focus on the coupling between mass spectrometry and bioelectrochemistry for the resolution of enzymatic mechanisms.

Membrane-bound NAD-independent alcohol dehydrogenase (NAD-independent ADH) from Acetobacter and Gluconobacter species has shown appreciable enantioselectivity on the oxidation of chiral primary and secondary alcohols. A NADIndependent alcohol dehydrogenase from mesophilic Acetobacter sp was isolated and characterized as a quinohaemprotein alcohol dehydrogenase QH-ADH. QHADH showed enantiopreference for the oxidation of (S)-enantiomer during the kinetic resolution of racemic secondary alcohols. Due to the growing interest for thermotolerant enzymes in the biocatalysis area, this study was performed to isolate acetic acid bacteria from vinegar factories in the northeast region of Brazil aiming to obtain a thermotolerant QH-ADH. Among the strains isolated, two showed characteristics of the Acetobacter genus (LBVE1 e LBVE4). Biomass production of the two strains were conduced on shaker flasks assays with three different ethanol concentrations as carbon source (10, 15 e 20 g/L) incubated in three different temperatures (30 35 e 37ºC). The highest biomass production for the two strains was obtained on the assays with 20 g/L ethanol, 30 ºC. However, both strains presented different growth conductions for the production of biomass highly active in NADindependent ADH. LBVE1 biomass produced on 10 g/L ethanol, 30ºC, showed the highest specific activity, 10.44 U/mg Proteín while the highest specific activity for LBVE4, 8.04 U/mg Proteín, was obtained on the biomass produced in assays with 15 g/L ethanol, 30 ºC. The results of the substrate specificity of the NAD-independent ADH present in the crude extract of both strains for selected primary and secondary alcohols. For primary alcohols, LBVE1 crude extract showed a decrease in the activity values with the rise of the carbon chain. Kinetic assays were performed to calculate apparent kinetics constants, using ethanol as substrate, for the NADindependent ADH present in the crude extract of both strains. LBVE1 crude extracts from cells grown in 10 and 20 g/L ethanol showed comparable values for Kmapp and VMax app. However, only extract from LBVE4 grown in 20 g/L ethanol had Kmapp value comparable to the one found for LBVE1 extracts analyzed. / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Alagoas / Álcool desidrogenase NAD-independente, enzima ligada a membrana, das espécies Acetobacter e Gluconobacter mostram apreciável enantioseletividade na oxidação de álcoois quirais primários e secundários. Em estudos anteriores, esta enzima foi isolada e caracterizada de espécies mesofílicas Acetobacter sp como uma quinohemoproteína álcool desidrogenase (QH-ADH). QH-ADH mostrou enantiopreferência pela oxidação do (S)-enantiômero durante a resolução cinética de álcoois secundários racêmicos. Devido ao crescente interesse por enzimas termotolerantes na área de biocatálise, este estudo foi conduzido com intuito de isolar bactérias termotolerantes do ácido acético de fábricas de vinagre na região nordeste do Brasil, almejando obter uma QH-ADH termotolerante. Dentre as espécies isoladas, duas mostraram características do gênero Acetobacter (LBVE1 e LBVE4). A produção de biomassa foi conduzida em agitador sob aeração de 200 rpm com três diferentes concentrações de etanol (10, 15 e 20 g/L) e incubadas em três temperaturas (30 35 e 37ºC). Os dois isolados apresentaram maior produção de biomassa nas condições quando cultivadas a 20 g/L etanol na 30ºC. Todavia, as condições para produção de uma biomassa ativa em álcool desidrogenase NADindependente variaram para as duas cepas. Cultivos de LBVE1 com 10 g/L de etanol, 30ºC, apresentou maior atividade específica cerca de 10,44 U/mgProteína. Enquanto que cultivos de LBVE4 mostrou atividade específica mais alta, 8,04 U/mgP nos cultivos a 15 g/L de etanol, 30ºC. As análises para investigar os perfis de especificidades para o substrato nos extratos brutos de LBVE1 e LBVE4, contendo ADH NAD-independente foram realizadas usando álcoois racêmicos com diferentes tamanhos de cadeia carbônica, dentre eles o rincoforol que é utilizado como feromônio. Também foram medidos os parâmetros cinéticos aparentes nos extratos brutos de ambas as cepas contendo atividade em ADH NAD-independente. Os extratos brutos células de LBVE1 cultivados 10 g/L e 20 g/L etanol apresentaram valores de Kmapp e VMax app comparáveis. Contudo, somente os extratos brutos de células de LBVE4 cultivados a 20 g/L etanol tiveram valores de Kmapp semelhantes aos encontrados para os extratos de células de LBVE1 estudados.

Submitted by Izabel Franco (izabel-franco@ufscar.br) on 2016-10-10T13:21:42Z No. of bitstreams: 1 TeseAM.pdf: 7680112 bytes, checksum: c8ecf6ee83f4312fa3be9569904c7b2f (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-20T19:45:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseAM.pdf: 7680112 bytes, checksum: c8ecf6ee83f4312fa3be9569904c7b2f (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-20T19:45:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseAM.pdf: 7680112 bytes, checksum: c8ecf6ee83f4312fa3be9569904c7b2f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-20T19:45:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseAM.pdf: 7680112 bytes, checksum: c8ecf6ee83f4312fa3be9569904c7b2f (MD5) Previous issue date: 2016-07-11 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / This study presents the development of a biosensor using a microcantilever stem and its detecting response through dynamic mode of atomic force microscopy (AFM). Responses of different methods for immobilization of alcohol dehydrogenase enzyme were investigated in order to accomplish a selective detection of ethanol, methanol and isopropanol, using as arrays: self-assembly monolayer (SAM) and others arrangements formed on Si and Si3N4 microcantilevers surface. In addition, we aimed to evaluate the influence of the biological element immobilization process in the analytical performance of the biosensor. The process to development of a biosensor began with the activation of its surface by means of thiols and silanes with different carbon length chains, however with the same amine terminal groups (NH2). The microcantilevers activation is only possible with the oxidation of its surface and to check this process, the "High-resolution Xray Photoelectron Spectroscopy (XPS)" technique was used. Activation of the surface was obtained using different methods for coating of microcantilevers made only with Si (100) and Si3N4. Subsequently to the oxidation process, the binding of the biomolecule to the surface activated was performed using the bifunctional agent glutaraldehyde. Microcantilevers with both sides coated by biomolecules were investigated and a tension effect of surface was observed at a 0,3 mL/L of the target analyte. By analyzing the performance of the biosensor for the determination of the target analyte, it was realized that APTES activation methodology for biosensors steam and self-assembled monolayers were the most suitable techniques for immobilizing the recognition biomolecule. With this preparation, the biosensor it showed less susceptible to humidity and the temperature variations, presenting a high quality factor, a faster response time, selectivity, sensitivity and durability. / Este trabalho apresenta o desenvolvimento de um biossensor, utilizando a haste de microcantilever e a detecção de sua resposta por intermédio do modo dinâmico da microscopia de força atômica (AFM). Foram investigadas as respostas de diferentes métodos para imobilização da enzima Álcool Desidrogenase, a fim de realizar a detecção seletiva de etanol, metanol e isopropanol, empregando como matrizes monocamadas auto-organizadas (SAM – Self Assembed Monolayer) e outros arranjos formados sobre a superfície de microcantilevers de Si e Si3N4. Além disso, objetivou-se a avaliação da influência do processo de imobilização do elemento biológico no desempenho analítico do biossensor. O processo de desenvolvimento do biossensor iniciou-se com a ativação de sua superfície por meio de deposição de tióis e silanos com diferentes comprimentos de cadeias carbônicas, mas com os mesmos grupos terminais amina (NH2). A ativação de microcantilevers somente é possível com a oxidação de sua superfície e para verificação desse processo foi empregada a técnica “High-resolution Xray Photoelectron Spectroscopy (XPS)”. A ativação da superfície foi obtida utilizando metodologias diferentes para o recobrimento dos microcantilevers construídos somente com Si (100) e Si3N4. Posteriormente ao processo de oxidação, segue-se a ligação da biomolécula à superfície ativada pela utilização do agente bifuncional Glutaraldeído. Foram investigados microcantilevers em que ambos os lados foram revestidos com as biomoléculas e, foi constatado o efeito da tensão superficial a partir de 0,3 mL/L do analito alvo. Ao analisar o desempenho do biossensor para a determinação do analito alvo, verificou-se que nos biossensores a metodologia de ativação por vapor de (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) e com montagem em monocamadas auto-organizada foi a mais adequada para a imobilização da biomolécula de reconhecimento, com esta preparação o biossensor foi menos susceptível a umidade relativa e variações de temperatura apresentando elevado fator de qualidade, menor período de tempo de resposta, seletividade, durabilidade e sensibilidade.

Neste trabalho, foi avaliada a reatividade de compostos orgânicos contendo boro frente a reações catalisadas por enzimas. Diferentes exemplos de álcoois secundários quirais contendo boro foram acetilados enantiosseletivamente pela lipase de Candida antarctica (CALB). Todas as reações ocorreram com excelente enantiosseletividade (E >200) e ambos os produtos acetilados, bem como os álcoois remanescentes foram obtidos com alto excesso enantiomérico (ee >99%). Além da resolução cinética enzimática, foi avaliado também o processo de resolução cinética dinâmica quimio-enzimática, empregando complexos de rutênio como agentes de racemização. Após estabelecer as condições adequadas para a reação, foi possível obter o produto acetilado de configuração-(R) com 83% de conversão, mantendo a enantiosseletividade observada na reação de resolução cinética enzimática. Como extensão ao trabalho realizado com os álcoois contendo boro, foi estudada a resolução cinética de aminas primárias quirais contendo boro. Foram avaliadas diversas condições reacionais para alcançar a máxima resolução cinética destas aminas via acilação enantiosseletiva catalisada pela lipase CALB. Excelente enantiosseletividade (E >200) e altos excessos enantioméricos (até >99%) foram obtidos utilizando acetato de etila tanto como reagente doador de acila como solvente da reação. Adicionalmente, foi investigada a reação de biorredução de cetonas pró-quirais contendo boro. Os melhores resultados foram obtidos com as enzimas álcool desidrogenases (ADHs) purificadas dos microorganismos Rhodococcus ruber e Lactobacillus brevis. A ADH de R. ruber (ADH-A) promoveu a biorredução das cetonas aos respectivos álcoois de configuração-(R) com excelente enantiosseletividade (ee >99%), enquanto a ADH de L. brevis (ADH-LB) catalisou a redução de alguns exemplos de cetonas aos respectivos álcoois de configuração-(S), também com excelente enantiosseletividade. / In this work, was evaluated the reactivity of boron-containing organic compounds in enzyme-catalyzed reactions. Different examples of boron-containing chiral secondary alcohols were resolved by enantioselective acetylation mediated by lipase from Candida. antarctica (CALB). All reactions showed excellent enantioselectivities (E >200) and both remaining substrates and acetylated product were obtained in high enantiomeric excesses (up to >99%). Besides the enzymatic kinetic resolution, the chemoenzymatic dynamic kinetic resolution was also evaluated, using ruthenium complexes as racemization agents. After establishing the best conditions, the acetylated (R)-product was obtained with 83% conversion, maintaining the high enantioselectivity observed in the enzymatic kinetic resolution. As an expansion of work with boron-containing alcohols, the kinetic resolution of boron-containing chiral amines was studied. Several reaction conditions were studied to achieve the kinetic resolution of boron-containing amines via enantioselective acylation mediated by CAL-B. Excellent enantioselectivity (E >200) and high enantiomeric excess (up to >99%) of both the remaining amines and amides were obtained using ethyl acetate as both acyl donor and the reaction solvent. Additionally, the bioreduction of pro-chiral boron-containing ketones was investigated. The best results were obtained with purified alcohol dehydrogenases (ADH) from Rhodococcus ruber and Lactobacillus brevis. The ADH from R. ruber (ADH-A) mediated the bioreduction of ketones to their respective (R)-alcohols with excellent enantioselectivity (ee >99%), while the ADH from L. brevis (ADH-LB) catalyzed the reduction of some ketones to their respective (S)-alcohols, also with excellent enantioselectivity (ee >99%).

Para a bioeletrocatálise de oxidação de etanol, a alteração da superfície eletródica e a otimização do processo de imobilização enzimática se fazem necessárias. Neste cenário, as fibras flexíveis de carbono (FFC) merecem destaque, pois além de sua superfície ser facilmente modificada devido à presença de carbono sp2, as mesmas possuem alta resistência mecânica e elasticidade, combinadas com a alta condutividade elétrica e térmica. Nesta tese de doutorado, apresenta-se como obter bioeletrodos de FFC modificadas com a enzima álcool desidrogenase (ADH) NAD-dependente, visando também aprimorar a oxidação da coenzima NADH (dinucleotídeo de nicotinamida e adenina). Os resultados mostram que quando as FCF são previamente submetidas a um tratamento oxidativo em meio ácido (KMnO4/H2SO4), obtém-se bioeletrodos estáveis, robustos e com alta área superficial. Além disso, observou-se que esses eletrodos possuem grupos funcionais contendo oxigênio que auxiliam na bioeletrocatálise de oxidação do etanol. Presume-se que presença de grupos quinonas seja responsável por facilitar a regeneração da coenzima, ou seja, estes grupos atuam decisivamente na oxidação do NADH. A alta qualidade dos bioeletrodos possibilitou manter a atividade catalítica da ADH por longo prazo, propriedade essa crucial para o estudo da oxidação do etanol acoplada à espectrometria de massas (DEMS). Devido a este estudo, foi possível observar concomitantemente a regeneração da coenzima (NADH -> NAD+) e a geração de acetaldeído como produto de bioeletroxidação do etanol, ambos em estado estacionário. Em suma, o estudo aqui apresentado introduz uma abordagem que combina não só o desenvolvimento de fibras de carbono tratadas quimicamente para aplicação em bioeletrocatálise, mas também um foco inédito no acoplamento entre a espectrometria de massas e a bioeletroquímica para a resolução de mecanismos enzimáticos. / Regarding the bioelectrocatalysis of the ethanol oxidation, the electrodic surface modification and the optimization of enzymatic immobilization are necessary. In this scenario, the flexible carbon fibers (FCF) are noteworthy, because besides their surface can be modified in an easy way due the presence of carbon sp2, they have high mechanical resistance and elasticity, combined with high electrical and thermal conductivity. In this doctoral thesis, it is presented how to obtain bioelectrodes of FFC modified with the enzyme alcohol dehydrogenase (ADH) NAD-dependent, as well as to improve the oxidation of the coenzyme NADH (nicotinamide adenine dinucleotide). The results show that when FCF is previously submitted to an oxidative treatment in acidic medium (KMnO4/H2SO4), stable, robust and high surface area bioelectrodes are obtained. In addition, it was observed that these electrodes have oxygen-containing functional groups that improve the bioelectrocatalysis of ethanol oxidation. There is proposed that the presence of quinone groups is responsible for facilitating the regeneration of the coenzyme, i. e., these groups act decisively in the oxidation of NADH. The high quality of the bioelectrodes allowed it to maintain the catalytic activity of the ADH for long term, property crucial for the study of the oxidation of ethanol coupled to mass spectrometry (DEMS). By using DEMS, there were possible to observe coenzyme regeneration and the generation of acetaldehyde as a bioelectrooxidation product of ethanol, both at steady state, which were simultaneously observed. In summary, the present study introduces an to an approach that combines not only the development of chemically treated carbon fibers for application in bioelectrocatalysis, but also an unprecedented focus on the coupling between mass spectrometry and bioelectrochemistry for the resolution of enzymatic mechanisms.

As biocélulas a combustível proporcionam meios de se obter energia de maneira mais sustentável, limpa e renovável e apresentam grande potencial para serem usadas como fontes de energia alternativas para dispositivos eletrônicos de baixa demanda energética. Esta dissertação investiga a bioeletro-oxidação de etanol pela enzima Álcool Desidrogenase (ADH) empregando-se bioânodos com polimerização simultânea do mediador (poli - verde de metileno) e polímero condutor (polipirrol). Uma vez preparado o bioânodo foram realizados estudos para verificar a oxidação do cofator (NADH), formação do produto da bio-oxidação de etanol, estabilidade e também estudos visando aumentar a eficiência energética gerada empregando nanotubos de carbono para aumento de área eletroquímicamente ativa e melhor comunicação com os sítios ativos das enzimas. Foi também preparada uma biocélula completa sem membrana polimérica visando diminuir resistência de transferência de prótons do sistema, com a configuração final constituída de ADH/NAD+, etanol, Lacase/O2 com e sem MWCNT. O bioânodo se mostrou relativamente estável, apresentando um decaimento médio de 36% do valor inicial da densidade de potência após 20 semanas de estocagem. Quando operado em condição contínua (tempo = 4h, E (V)= ½ PCA), o decaimento foi de 39% e de 66% em 12 horas de operação. Os valores de densidade de potência foram melhorados com a adição de MWCNTs sobre o suporte de C antes da eletropolimerização do filme simultâneo, em pH 8,9, obteve-se 275 + 12 ?W cm-2. A eletrólise para este sistema mostrou a formação de acetaldeído com conversão de 18% de etanol. Para a biocélula completa, os melhores resultados foram com a presença de MWCNTs no bioânodo, obtendo-se uma potência de 12,5 +0,9 ?W cm-2. Os resultados obtidos são bastante promissores comparado com a literatura atual e mostram que esse sistema pode ser empregado para construção de BFC. / Biofuel cells provide the means to obtain energy in a more sustainable, clean, and renewable way and have great potential as alternative energy sources for low-energy electronic devices. This dissertation investigates ethanol bioelectrooxidation by the enzyme Alcohol Dehydrogenase (ADH) at bioanodes with simultaneous polymerization of the mediator (polymethylene green) and conductive polymer (polypyrrole). After preparing the bioanode, we investigated cofactor (NADH) oxidation, the ethanol biooxidation product,and bioanode stability. We also conducted studies to increase the generated energy efficiency by using carbon nanotubes to augment the electrochemically active area and to improve communication with the enzyme active sites. We also prepared a complete biofuel cell without polymer membrane to decrease the system proton transfer resistance: the final configuration consisted of ADH / NAD +, ethanol, Laccase , and O2 with or without MWCNTs. The bioanode was relatively stable. The mean decay was 36% of the initial power density after 20 weeks of storage. When the bioanode was operated in continuous condition (time = 4h, E (V) = ½ PCA), the decay was 39% and 66% in 12 hours of operation. The power density values increased upon addition of MWCNTs to the C-support before simultaneous film electropolymerization at pH 8.9, to give 275 + 12 ?W cm-2. Under electrolysis conditions, this system produced acetaldehyde and converted 18% of ethanol. For the complete biofuel cell, the best results were with the presence of MWCNTs in the bioanode, which provided a power of 12.5 +0.9 ?W cm-2. The results obtained here are quite promising if compared to the current literature and show that this system can be used to construct a BFC.

Diferentes estratégias têm sido propostas a fim de melhorar o desempenho dos bioeletrodos utilizados nas biocélulas a combustíveis e nos biossensores. Por examplo, a funcionalização de eletrodos de carbono tem sido feita para esse fim. Neste estudo, propomos o desenvolvimento de fibras flexíveis de carbono (FFCs) funcionalizadas com grupos quinona e modificados com álcool desidrogenase (ADH) NAD-dependente para obter bioeletrodos para uma bio-eletrocatálise eficiente de etanol. Grupos quinona na superfície das FFCs foram obtidas utilizando o tratamento oxidativo com permanganato e também pelo ancoramento eletroquímico de antraquinona: ambas metodologias resultaram em bioeletrodos para a eletro-oxidação de NADH que pode aumentar a bio-eletrocatálise do etanol. De acordo dados espectroscópicos, microscópicos, e eletroquímicos, defeitos contendo grupos C=O nos eletrodos de FFCs são atribuídos à melhora na oxidação do NADH, aumentando a bio-eletrocatálise do etanol. Para se investigar o papel dos grupos quinona na eletro-oxidação do NADH, propomos uma configuração experimental baseado na espectroscopia de ressonância paramagnética de elétrons em modo operando (operando EPR). Com essa técnica, fomos capaz de mostrar a correlação entre o número de elétrons livres desemparelhados, a concentração superficial de quinonas e a oxidação do NADH com controle eletroquímico. Correlação para a concentração de spins revela um aumento no número de elétrons desemparelhados livres com o aumento do sobrepotencial aplicado e a oxidação do NADH, o que corrabora com a hipótese de que grupos quinona podem afetar a eletrocatálise rumo à oxidação do NADH a NAD+. É vislumbrado que operando EPR pode fornecer infromação útil para provar a dinâmica da transferência de elétrons em superfície de carbono e possa ser extendida a outros sistemas bioeletroquímicos. / There are several strategies to improve the performance of bioelectrodes applied in biosensors and biofuel cells. For instance, surface functionalization of the carbon-based electrodes has been used to this intend. Herein, we propose the development of flexible carbon fibers (FCFs) functionalized with quinone groups and modified with NAD-dependent alcohol dehydrogenase (ADH) to obtain bioelectrodes for efficient ethanol bio-electrocatalysis. Quinones groups on FCFs surfaces were obtained by using oxidative treatment with permanganate, and also by electrochemical grafting of anthraquinone: both these methodologies result in bioelectrodes for the electro-oxidation of NADH that can improve the ethanol bio-electrocatalysis. Based on spectroscopic, microscopic and electrochemical data, defects containing C=O groups on FCFs electrodes are attributed to improve the NADH oxidation, enhancing the ethanol bio-electrocatalysis. In order to investigate the role of quinone groups on the NADH electro-oxidation, we propose an experimental setup based on operando electron paramagnetic resonance spectroscopy (operando EPR). With this technique, we are able to show a correlation among the number of free unpaired electrons, surface concentration of quinones and NADH oxidation under electrochemical control. Correlation for the spin concentration reveals an increasing number of free unpaired electrons with increasing applied overpotential and NADH oxidation, which corroborates the hypothesis that quinone groups can act as electrocatalysts towards the oxidation of NADH to NAD+. It is glimpsed that operando EPR can provide useful information in probing the electron transfer dynamics on a carbon surface and may be extended to others bioelectrochemical systems.