Le canal TRPM8 a été mis en évidence en tant que récepteur au froid au sein des neurones sensoriels des ganglions rachidiens dorsaux (DRG) et trigéminaux. Il est activé par le froid (<28°C) ainsi que par des molécules au pouvoir réfrigérant (menthol, iciline ou eucalyptol). Au niveau périphérique, ce canal est détecté, en outre, au niveau des cellules épithéliales prostatiques saines et cancéreuses. Si plusieurs travaux se sont attachés à déterminer ses modes d’activation, au début de cette thèse, aucune équipe ne s’était intéressée à rechercher des modulateurs physiologiques de ce canal, autres que le froid, aussi bien au niveau sensoriel que prostatique. Partant du constat que la thermosensation se voit altérée au cours de certaines situations physiologique (stress, traitements hormonaux, âge et sexe), nous avons étudié une possible régulation de ce récepteur au froid par les voies de signalisation empruntées par certains neuromodulateurs et hormones.Nos résultats mettent en évidence trois nouvelles voies de régulation de TRPM8 mettant en jeu les androgènes, les agonistes des récepteurs muscariniques et alpha2A adrénergiques. Nos données se confirment au sein des cellules épithéliales prostatiques et des neurones sensoriels. Ces travaux nous permettent d’avancer une possible explication des variabilités inter-individuelles ainsi que des différences due l’âge, au sexe ou face à des situations de stress vis-à-vis de la perception du froid. Enfin, nos résultats nous permettent également de proposer des pistes pour l’établissement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour des pathologies associant le canal TRPM8 telles que l’allodynie au froid et le cancer de la prostate. / TRPM8 is known as a cold receptor expressed in the subset of dorsal root ganglion (DRG) and trigeminal (TG) sensory neurons which are activated by cooling temperatures (<28°C) or by chemical imitators of cooling sensation (menthol, icilin and eucalyptol). While screening for a new marker of prostate carcinoma, Larisa Tsavaler et al. detected TRPM8 channel expression in normal and cancer prostate epithelial cells. Expression of trpm8 gene is androgeno-dependent and change during cancer development. Even though many studies investigated the role of TRPM8 as a cold receptor and described its activation mechanisms, at the beginning of this work no research team had published any information about TRPM8 physiological modulators other than cold, be it in prostate or sensory neurons. Since several works reported modifications of thermosensation during physiological situations such as stress, hormonal therapy, age and gender, we investigated a possible regulation of the cold receptor by neuromodulators, hormones and their signalization pathways. Our results demonstrate three new regulatory mechanisms for TRPM8 involving respectively a new non genomic androgenic, a muscarinic or an alpha2A adrenergic receptors pathway.Our data are confirmed in two physiological models, epithelial prostate cells and dorsal root ganglia neurons. This work leads us to propose a possible explanation for variations which could be accounted for during stress, gender, as well as inter- and intra-individual disparity in thermosensation. Finally, our results could help establishing new therapeutic strategies for pathologies involving TRPM8 such as cold allodynia and prostate cancer.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Les douleurs chroniques, inflammatoire ou neuropathique, se traduisent par un état d'hypersensilité douloureuse. Cet état se manifeste par des douleurs spontanées et des douleurs provoquées, soit par une stimulation normalement non douloureuse (allodynie), soit par une stimulation douloureuse provoquant une sensation exagérée (hyperalgésie). Les traitements actuels ne sont souvent que partiellement efficaces et peuvent s'accompagner d'effets secondaires importants. Quel sont les mécanismes de ces symptômes douloureux et donc les cibles thérapeutiques potentielles pour de nouveaux médicaments ? Utilisant des approches comportementales, pharmacologiques, électrophysiologiques, anatomo-fonctionnelles, moléculaires et microscopiques, nous avons caractérisé les mécanismes segmentaires de la douleur spontanée et l'allodynie mécanique statique (douleur provoquée par une légère pression cutanée). En utilisant le modèle de douleur provoquée par l'injection sous-cutanée (s.c.) de capsaïcine dans la face chez le rat, nous avons évalué (1) le rôle de l'inhibition GABAAergique et des dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) (2) l'implication d'interneurones spécifiques exprimant l'isoforme γ de la protéine kinase C (PKCγ) localisés dans les couche II interne (IIi) et III externe (IIIe), et (3) les propriétés de ces interneurones, dans le sous-noyau caudal du trijumeau. L'immunohistochimie anti-phospho-ERK1/2 révèle que deux circuits neuronaux différents sont mis en jeu lors de la douleur spontanée et de l'allodynie mécanique statique après injection s.c. de capsaïcine. Le premier implique des neurones uniquement dans les couches superficielles (I et II externe (IIe)) et le second, des neurones dans les couches I, IIe, IIi et IIIe, dont les interneurones PKCγ. Comme après injection s.c. de capsaïcine, l'injection intracisternale (i.c.) d'un donneur de ROS ou d'un inhibiteur des récepteurs GABAA induit une allodynie mécanique statique et l'activation neuronale associée impliquant les interneurones PKCγ. Ces deux phénomènes sont supprimés par l'inhibition pharmacologique de ROS ou de la PKCγ, avant injection s.c. de capsaïcine, alors que la douleur spontanée subsiste. Les microscopies optique et électronique montrent que ces interneurones PKCγ (1) expriment les récepteurs GABAA et glycine et (2) ne reçoivent de projections directes que de fibres afférentes de type A. La PKCγ est majoritairement localisée au niveau de la membrane cytoplasmique, où elle forme souvent des clusters perisynaptique. Nos résultats suggèrent qu'une allodynie mécanique statique se manifeste lorsque des circuits polysynaptiques locaux spécifiques, incluant les interneurones PKCγ, sont désinhibés par réduction de l'inhibition GABAAergique, vraisemblablement provoquée par une libération de ROS suite à une stimulation intense des fibres afférentes nociceptives. Des mécanismes spécifiques semblent donc exister pour chaque symptôme douloureux, représentant autant de cibles pour un traitement particulier de chacun d'eux. / Inflammatory or neuropathic chronic pain is characterized by persistent pain hypersensitivity. This includes spontaneous pain (pain experienced in the absence of any obvious peripheral stimulus), hyperalgesia (an increased responsiveness to noxious stimuli) and allodynia (pain in response to normally innocuous stimuli). Much of the currently available clinical treatment is only partially effective and may be accompanied by distressing side effects. What are the mechanisms underlying these pain symptoms and therefore the putative targets for new drugs? Using behavoural, pharmacological, electrophysiological, anatomo-functional, molecular and microscopic techniques, we have characterized the segmental mechanisms of spontaneous pain and static mechanical allodynia (pain produce by a light pressure). Using the facial capsaicin pain model in rats, we evaluated (1) the role of GABAAergique inhibition and reactive oxygen species (ROS), (2) the involvement of specific interneurons which express the γ isoform of protein kinase C (PKCγ) and are localized in the inner part of laminae II (IIi) and the outer part of lamina III (IIIe), and (3) the properties of these PKCγ interneurons in the medullary dorsal horn (MDH). Phospho-ERK1/2 immunochemsitry reveals that two different neuronal circuits are involved in the manifestation of spontaneous pain and static méchanical allodynia after subcutaneous (s.c.) injection of capsaicin. The first includes neurons exclusively located in the most superficial laminae (I and outer part of lamina II (IIe)) and the second, neurons in laminae I, IIe, IIi and IIIe, including PKCγ interneurons. As after s.c. capsaicin, intracisternal (i.c.)injection of a ROS donor or a GABAA receptor inhibitor induces static mechanical allodynia and associated activation of the local circuit. Conversely, these two phenomenons, but not spontaneous pain, are suppressed following i.c. injection of ROS scavenger and PKCγ inhibitors before s.c. capsaicin. Light and electron microscopies show that PKCγ interneurons (1) express both GABAA and glycine receptors, and (2) only receive direct inputs from A-fiber primary afferents. PKCγ is mostly localized on cytoplasmic membranes where it often clusters close to synaptic clefts. Our results suggest that static mechanical allodynia is expressed when specific local polysynaptic circuits, including PKCγ interneurons, are unmasked by disrupted GABAAergic inhibition, likely produced by ROS release following a strong activation of C-fiber nociceptive primary afferents. Specific mechanisms appear to be involved in these different pain symptoms, each of them being a possible target for new drugs aimed specifically at these symptoms.

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Les syndromes douloureux chroniques, inflammatoires ou neuropathiques, se caractérisent par une hypersensiblitité douloureuse, sous forme de douleurs spontanées et d’allodynie et d’hyperalgésie. L’isoforme γ de la protein kinase C (PKCγ), concentrée dans un type spécifique d’interneurones de la couche II interne (IIi) de la corne dorsale de la moelle ou du sous-noyau caudal du trijumeau (Sp5C) est impliqué dans mécanismes centraux de l’allodynie mécanique, une condition dans laquelle le toucher provoque une douleur. Nous avons utilisé des techniques comportementales et immunohistochimiques dans le système trigéminal.Le rôle de la PKCγ dans le développement de l’allodynie mécanique est bien établi après lésion nerveuse périphérique. Par contre, il l’est beaucoup moins dans l’allodynie d’origine inflammatoire. Nous avons testé l’hypothèse que l’allodynie mécanique persistante à la suite d’une inflammation périphérique provoquée par l’adjuvent complet de Freund (‘complete Freund’s adjuvant’ ou CFA) est bien due à une activation de la PKCγ. L’injection sous-cutanée de CFA au niveau de la zone d’insertion des vibrisses induit une allodynie persistante spécifiquement statique. L’immunomarquage phopho-ERK1/2 montre que l’expression de cette allodynie s’accompagne d’une activation d’interneurones des couches I-IIe et IIi-IIIe, dont des interneurones PKCγ de la couche IIi. Cette allodynie statique est supprimée par l’application intracisternale de l’antagoniste PKCγ, KIG31-1, avant l’injection de CFA, mais pas 3 jours après l’injection de CFA. Ainsi, comme pour l’allodynie mécanique neuropathique, l’activation de la PKCγ est nécessaire au développement de l’allodynie mécanique inflammatoire.Nous avons aussi examiné si l’activation de la PKCγ est suffisante pour le développement de l’allodynie mécanique. L’injection intracisternale de phorbol ester, 12,13-dibutyrate (PDBu), un activateur de la PKCγ, induit simultanément une allodynie mécanique statique et dynamique de la face. L’immunoréactivité phospho-ERK1/2 révèle que l’expression de ces deux allodynies mécaniques s’accompagne de la même activation d’interneurones des couches I-IIe et IIi-IIIe, dont des interneurones PKCγ de la couche IIi . Les effets de l’application de PDBu sont bloqués par l’application simultanée de KIG31-1.L’activation de la PKCγ seule est suffisante pour que se développe une allodynie mécanique, à la fois statique et dynamique. On sait que les interneurones PKCγ de la couche IIi sont directement activés par des afférences myélinisées mécaniques non nociceptives. Le niveau d’activation de la PKCγ contrôlerait la transmission de cette information vers les neurones de projection de la couche I, et donc la transformation du toucher en douleur. / Inflammatory and neuropathic chronic pain syndromes are characterized by pain hypersensitivy, manifest as spontaneous pain, allodynia and hyperalgesia. The γ isoform of protein kinase C (PKCγ), which is concentrated in a specific class of interneurons within inner lamina II (IIi) of the spinal (SDH) and medullary (MDH) dorsal horns, has been implicated in the central mechanisms underlying mechanical allodynia, a condition wherein touch produces pain. We used behavioral and immunohistochemical techniques in the trigeminal system.Whereas there is clear evidence for the involvement of PKCγ in neuropathic mechanical allodynia, that for the involvement of PKCγ in inflammatory mechanical allodynia is still controversial. We investigated the involvement of PKCγ into the persistent mechanical allodynia induced by complete Freund’s adjuvant (CFA) inflammation. Subcutaneous injection of CFA into the vibrissa pad of rats induced a persistent selectively static mechanical allodynia. Monitoring neuronal activity within medullary dorsal horn (MDH) with phospho-ERK1/2 immunoreactivity showed that activation of both laminae I-IIo and IIi-IIIo neurons, including lamina IIi PKCγ-expressing interneurons, was associated with the expression of static mechanical allodynia. Intracisternal injection of the selective PKCγ antagonist, KIG31-1, prevented CFA-induced static mechanical allodynia only when it was injected before, but not 3 days after, CFA injection. These results show that, as for neuropathic mechanical allodynias, PKCγ activation is necessary for inflammatory mechanical allodynia.We also examined whether PKCγ activation in naïve animals is sufficient for the establishment of mechanical allodynia. Intracisternal injection of the phorbol ester, 12,13-dibutyrate (PDBu), concomitantly induced static and dynamic facial mechanical allodynias Monitoring neuronal activity within MDH with phospho-ERK1/2 immunoreactivity revealed that the same activation of both laminae I-IIo and IIi-IIIo neurons, including lamina IIi PKCγ-expressing interneurons, was associated with the manifestation of both mechanical allodynias. PDBu-induced mechanical allodynias and associated neuronal activations were all prevented by intracisternal KIG31-1.Our findings reveal that PKCγ activation is sufficient for the development of static and dynamic mechanical allodynias. Lamina IIi PKCγ interneurons have been shown to be directly activated by low-threshold mechanical inputs carried by myelinated afferents. The level of PKCγ activation might thus gate the transmission of innocuous mechanical inputs to lamina I, nociceptive output neurons, thus turning touch into pain.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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À ce jour, on estime que 60% des cancers , tous types confondus, formeront des métastases qui vont se loger dans les os. Bien que des avancées majeures aient été réalisées dans la détection et le traitement du cancer, dans le cas du cancer des os les soins ne sont habituellement que palliatifs et la douleur toujours grandissante. Parmi les douleurs cancéreuses, celle causée par le cancer des os est la plus commune mais aussi la plus difficile à traiter. À ce jour, les antalgiques de la famille des alcaloïdes (i.e. la morphine et ses dérivés) demeurent la meilleure thérapie pour combattre la douleur due au cancer des os, et ce même si leur utilisation prolongée entraîne des épisodes de tolérance analgésique. Cependant, dans le cas d'un cancer avancé la dose de narcotiques requise pour lutter adéquatement contre la douleur intense est généralement limitée par l'apparition d'effets indésirables qui, s'ils ne sont pas contrôlés adéquatement, poussent plusieurs patients à abandonner leurs traitements. La majorité des analgésiques opioïdergiques utilisés en clinique ont pour cible le récepteur opioïde mu, MOPR. Ce récepteur est aussi responsable de la majorité des effets indésirables associés à la prise de narcotiques. Plusieurs données importantes recueillies au cours des dernières années indiquent que l'activation du récepteur opioïde delta, DOPR, ne semble pas entraîner les effets secondaires qu'on associe habituellement aux narcotiques. Nous pensons ainsi que DOPR , pourrait être une cible thérapeutique intéressante pour réduire la douleur due au cancer, plus particulièrement celle due au cancer des os. Ce projet a donc pour but de déterminer si les agonistes sélectifs du récepteur DOPR peuvent représenter une avenue intéressante pour le traitement de la douleur cancéreuse dans un modèle animal de douleur cancéreuse. La douleur provoquée par le cancer des os a été induite chez le rat Sprague-Dawley par l'injection de cellules cancéreuses originaires d'une tumeur mammaire de rat (MRMT-1) dans la cavité médullaire du fémur. Quartorze jours après l'implantation des cellules cancéreuses dans le fémur, l'administration intrathécale de l'agoniste delta, deltorphine II, a renversé significativement l'allodynie. De plus, nous avons démontré que la deltorphine II soulageait la douleur inflammatoire et cancéreuse de façon comparable. Dans cette étude, nous avons confirmé les effets analgésiques d'un agoniste sélectif des récepteurs opioïdes delta, delorphine II, administré par la voie intrathécale. Les résultats de cette étude montrent, pour la première fois, l'effet analgésique spinale de la deltorphine II dans un modèle de douleur osseuse chez le rat.