L’approche Module X a été créée dans le but de concevoir de petits peptides modulateurs ayant des propriétés allostériques. Module X reproduit de petites parties des portions extracellulaires flexibles des récepteurs. Ces petits peptides vont interagir en s’interposant entre deux sous unités ou entre deux régions de la même sous-unité qui interagissent par des liens hydrogènes, des ponts salins ou des liens disulfure. Ces régions sont spécialement choisies à l’extérieur du domaine de liaison du ligand orthostérique et sont situées dans les régions inter domaines, la portion juxta membranaire ou dans les boucles. Étant donné que les boucles sont exposées durant les changements de conformation, une séquence peptidique reproduisant certaines régions de ces boucles pourrait s’insérer à un endroit approprié dans la structure où se lier à son partenaire de signalisation dans le complexe protéique, ce qui aurait comme effet de déplacer l’équilibre de l’ensemble vers un état particulier et modulerait ainsi la signalisation. De cette façon, certaines voies de signalisation pourraient être partiellement inhibées tandis que d’autres voies ne seraient pas touchées puisque le ligand orthostérique pourrait toujours se lier au récepteur. Dans une première étude, nous avons conçu des peptides inhibiteurs du récepteur de l’interleukine 1 (IL-1R/IL-1RAcP) plus précisément en reproduisant des régions flexibles de la protéine accessoire, sous-unité signalisatrice du récepteur. IL-1 est un médiateur majeur de l’inflammation, mais le seul antagoniste disponible est l’analogue naturel de IL-1, IL-1Ra qui compétitionne avec IL-1 pour le site de liaison sur le récepteur. Nous avons conçu plusieurs peptides à partir des boucles de la protéine accessoire. Un de ces peptides, rytvela (101.10) a démontré des propriétés de non-compétitivité et de sélectivité fonctionnelle caractéristiques des modulateurs allostériques. 101.10 bloque la prolifération des thymocytes et la synthèse de PGE2 avec un IC50 de 1 nM mais une efficacité de 100 % et 45 % respectivement et ne déplace pas IL-1 radioactif dans des essais de radioliaisons. De plus, 101.10 n’a qu’un effet minime sur l’affinité de IL-1 pour son récepteur. 101.10 démontre, de plus, une activité inhibitrice in vivo dans des modèles d’inflammation de l’intestin chez le rat (efficacité supérieure aux corticostéroïdes et à IL-1Ra) et de dermatite chez la souris de même que dans un modèle d’hyperthermie induite par IL-1. La deuxième étude démontre que Module X peut être utilisé pour concevoir des inhibiteurs pour une autre grande famille de récepteurs : les récepteurs couplés aux protéines G. La vasopressine joue un rôle important dans l’équilibre hydro-osmotique et un moindre rôle dans la vasomotricité. Six peptides ont été conçus à partir de régions juxta membranaires du récepteur de la vasopressine V2R. Le peptide le plus actif, VRQ397 (IC50 = 0,69 nM dans un modèle de vasorelaxation du crémastère), a démontré de la sélectivité fonctionnelle en inhibant la synthèse de prostacycline mais sans inhiber l’activation de la protéine Gs et la génération d’ AMP cyclique. Le peptide VRQ397 ne pouvait déplacer le ligand naturel AVP marqué radioactivement; de même VRQ397 radioactif ne se liait que sur V2R et non pas sur d’autres récepteurs de la même famille tel que V1R (récepteur de la vasopressine de type I). Ces études décrivent la caractérisation de petits peptides modulateurs de la signalisation de IL-1R et V2R et présentant des propriétés de modulateurs allostériques. / The Module X approach was conceived to generate small allosteric peptides that do not (by definition) compete with the natural ligand to inhibit or modulate signalling. Orthosteric inhibition blocks the entire signalling pathways while allosteric modulators will bind to another site on the target and show functional selectivity. By reproducing parts of the flexible regions (loops) of two receptors, the IL-1 and vasopressin receptors, we generated small peptides that showed allosteric properties. To prove our concept we started with a pro-inflammatory target: IL-1 receptor. Interleukin (IL)-1 is a major pro-inflammatory cytokine which interacts with the IL-1 receptor I (IL-1RI) complex, composed of IL-1RI and IL-1R accessory protein (IL-1RacP) subunits. Presently, there are no small antagonists of the IL-1RI complex. Given this void, we derived 15 peptides from loops of IL-1RacP, which are putative interactive sites with the IL-1RI subunit. Here we substantiate the merits of one of these peptides, rytvela (we termed, 101.10), as an inhibitor of IL-1R and describe its properties consistent with those of an allosteric negative modulator. 101.10 (IC50  1 nM) blocked human thymocyte proliferation in vitro, and demonstrated robust in vivo effects in models of hyperthermia and inflammatory bowel disease as well as topically in contact dermatitis, superior to corticosteroids and IL-1ra; 101.10 did not bind to IL-1RI deficient cells and was ineffective in vivo in IL-1RI knockout mice. Importantly, characterization of 101.10, revealed non-competitive antagonist actions and functional selectivity by blocking certain IL-1R pathways while not affecting others. The second study involved a representative of the biggest family of membrane proteins: G-protein coupled receptors. Vasopressin type 2 receptor (V2R) exhibits mostly important properties for hydro-osmotic equilibrium and to a lesser extent on vasomotricity. Drugs currently acting on this receptor are analogs of the natural neuropeptide, vasopressin (AVP), and hence are competitive ligands. Six peptides reproducing juxtamembranous regions of V2R were designed and screened; the most effective peptide, CRAVKY (labelled VRQ397), was characterized. VRQ397 was potent (IC50 = 0.69 ± 0.25 nM) and fully effective in inhibiting V2R-dependent physiological function (specifically DDAVP-induced cremasteric vasorelaxation; this physiological functional assay was utilized to avoid overlooking interference of specific signaling events). Dose-response profile revealed non-competitive property of VRQ397; correspondingly, VRQ397 bound specifically to V2R-expressing cells, could not displace its natural ligand, AVP, but modulated AVP binding kinetics (dissociation rate). VRQ397 exhibited pharmacological permissiveness on V2R-induced signals as it inhibited DDAVP-induced PGI2 generation, but not that of cAMP or recruitment of — arrestin2. Consistent with in vitro and ex vivo effects as a V2R antagonist, VRQ397 displayed anticipated in vivo aquaretic efficacy. Findings describe the discovery of potent and specific small (peptide) antagonists of IL-1RI and V2R with properties in line with an allosteric negative modulator.

L’approche Module X a été créée dans le but de concevoir de petits peptides modulateurs ayant des propriétés allostériques. Module X reproduit de petites parties des portions extracellulaires flexibles des récepteurs. Ces petits peptides vont interagir en s’interposant entre deux sous unités ou entre deux régions de la même sous-unité qui interagissent par des liens hydrogènes, des ponts salins ou des liens disulfure. Ces régions sont spécialement choisies à l’extérieur du domaine de liaison du ligand orthostérique et sont situées dans les régions inter domaines, la portion juxta membranaire ou dans les boucles. Étant donné que les boucles sont exposées durant les changements de conformation, une séquence peptidique reproduisant certaines régions de ces boucles pourrait s’insérer à un endroit approprié dans la structure où se lier à son partenaire de signalisation dans le complexe protéique, ce qui aurait comme effet de déplacer l’équilibre de l’ensemble vers un état particulier et modulerait ainsi la signalisation. De cette façon, certaines voies de signalisation pourraient être partiellement inhibées tandis que d’autres voies ne seraient pas touchées puisque le ligand orthostérique pourrait toujours se lier au récepteur. Dans une première étude, nous avons conçu des peptides inhibiteurs du récepteur de l’interleukine 1 (IL-1R/IL-1RAcP) plus précisément en reproduisant des régions flexibles de la protéine accessoire, sous-unité signalisatrice du récepteur. IL-1 est un médiateur majeur de l’inflammation, mais le seul antagoniste disponible est l’analogue naturel de IL-1, IL-1Ra qui compétitionne avec IL-1 pour le site de liaison sur le récepteur. Nous avons conçu plusieurs peptides à partir des boucles de la protéine accessoire. Un de ces peptides, rytvela (101.10) a démontré des propriétés de non-compétitivité et de sélectivité fonctionnelle caractéristiques des modulateurs allostériques. 101.10 bloque la prolifération des thymocytes et la synthèse de PGE2 avec un IC50 de 1 nM mais une efficacité de 100 % et 45 % respectivement et ne déplace pas IL-1 radioactif dans des essais de radioliaisons. De plus, 101.10 n’a qu’un effet minime sur l’affinité de IL-1 pour son récepteur. 101.10 démontre, de plus, une activité inhibitrice in vivo dans des modèles d’inflammation de l’intestin chez le rat (efficacité supérieure aux corticostéroïdes et à IL-1Ra) et de dermatite chez la souris de même que dans un modèle d’hyperthermie induite par IL-1. La deuxième étude démontre que Module X peut être utilisé pour concevoir des inhibiteurs pour une autre grande famille de récepteurs : les récepteurs couplés aux protéines G. La vasopressine joue un rôle important dans l’équilibre hydro-osmotique et un moindre rôle dans la vasomotricité. Six peptides ont été conçus à partir de régions juxta membranaires du récepteur de la vasopressine V2R. Le peptide le plus actif, VRQ397 (IC50 = 0,69 nM dans un modèle de vasorelaxation du crémastère), a démontré de la sélectivité fonctionnelle en inhibant la synthèse de prostacycline mais sans inhiber l’activation de la protéine Gs et la génération d’ AMP cyclique. Le peptide VRQ397 ne pouvait déplacer le ligand naturel AVP marqué radioactivement; de même VRQ397 radioactif ne se liait que sur V2R et non pas sur d’autres récepteurs de la même famille tel que V1R (récepteur de la vasopressine de type I). Ces études décrivent la caractérisation de petits peptides modulateurs de la signalisation de IL-1R et V2R et présentant des propriétés de modulateurs allostériques. / The Module X approach was conceived to generate small allosteric peptides that do not (by definition) compete with the natural ligand to inhibit or modulate signalling. Orthosteric inhibition blocks the entire signalling pathways while allosteric modulators will bind to another site on the target and show functional selectivity. By reproducing parts of the flexible regions (loops) of two receptors, the IL-1 and vasopressin receptors, we generated small peptides that showed allosteric properties. To prove our concept we started with a pro-inflammatory target: IL-1 receptor. Interleukin (IL)-1 is a major pro-inflammatory cytokine which interacts with the IL-1 receptor I (IL-1RI) complex, composed of IL-1RI and IL-1R accessory protein (IL-1RacP) subunits. Presently, there are no small antagonists of the IL-1RI complex. Given this void, we derived 15 peptides from loops of IL-1RacP, which are putative interactive sites with the IL-1RI subunit. Here we substantiate the merits of one of these peptides, rytvela (we termed, 101.10), as an inhibitor of IL-1R and describe its properties consistent with those of an allosteric negative modulator. 101.10 (IC50  1 nM) blocked human thymocyte proliferation in vitro, and demonstrated robust in vivo effects in models of hyperthermia and inflammatory bowel disease as well as topically in contact dermatitis, superior to corticosteroids and IL-1ra; 101.10 did not bind to IL-1RI deficient cells and was ineffective in vivo in IL-1RI knockout mice. Importantly, characterization of 101.10, revealed non-competitive antagonist actions and functional selectivity by blocking certain IL-1R pathways while not affecting others. The second study involved a representative of the biggest family of membrane proteins: G-protein coupled receptors. Vasopressin type 2 receptor (V2R) exhibits mostly important properties for hydro-osmotic equilibrium and to a lesser extent on vasomotricity. Drugs currently acting on this receptor are analogs of the natural neuropeptide, vasopressin (AVP), and hence are competitive ligands. Six peptides reproducing juxtamembranous regions of V2R were designed and screened; the most effective peptide, CRAVKY (labelled VRQ397), was characterized. VRQ397 was potent (IC50 = 0.69 ± 0.25 nM) and fully effective in inhibiting V2R-dependent physiological function (specifically DDAVP-induced cremasteric vasorelaxation; this physiological functional assay was utilized to avoid overlooking interference of specific signaling events). Dose-response profile revealed non-competitive property of VRQ397; correspondingly, VRQ397 bound specifically to V2R-expressing cells, could not displace its natural ligand, AVP, but modulated AVP binding kinetics (dissociation rate). VRQ397 exhibited pharmacological permissiveness on V2R-induced signals as it inhibited DDAVP-induced PGI2 generation, but not that of cAMP or recruitment of — arrestin2. Consistent with in vitro and ex vivo effects as a V2R antagonist, VRQ397 displayed anticipated in vivo aquaretic efficacy. Findings describe the discovery of potent and specific small (peptide) antagonists of IL-1RI and V2R with properties in line with an allosteric negative modulator.