Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-09-02T14:54:35Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO - Alinny R Isaac - 2016.pdf: 2520039 bytes, checksum: 294508e64fe5208cfd8d2b48f9465be5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T14:54:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO - Alinny R Isaac - 2016.pdf: 2520039 bytes, checksum: 294508e64fe5208cfd8d2b48f9465be5 (MD5) Previous issue date: 2016-02-16 / CNPq / Ácidos graxos essenciais da família ômega-3 são cruciais durante o desenvolvimento cerebral atuando na transcrição gênica e sobre mecanismos epigenéticos, influenciando a gênese e diferenciação de neurônios e astrócitos. Por outro lado, evidências têm mostrado que a desnutrição materno-proteica pode modificar negativamente padrões epigenéticos do genoma fetal. O presente estudo investigou se uma razão ômega-6/ômega-3 (n-6/n-3) favorável na dieta materna pode influenciar alterações pós-traducionais em histonas de células neurais da prole, mesmo em uma condição de deficiência em proteínas e outros micronutrientes. Ratas Wistar foram mantidas em uma dieta com deficiência multifatorial (Dieta Básica Regional – DBR) possuindo, entretanto, uma baixa razão n-6/n-3 em relação a dieta controle, 30 dias antes do acasalamento e durante a gestação. Embriões de 16 dias de gestação e neonatos de 0 a 3 dias pós-natais foram utilizados para a realização de culturas corticais de neurônios e astrócitos, respectivamente. Acetilação de H3K9 e dimetilação de H3K4 e H3K27 foram avaliados por imunocitoquímica e citometria de fluxo. Análises por densitometria ótica mostraram aumento nos níveis de H3K4me2 nos astrócitos do grupo malnutrido (Mn) (27115±9892 P < 0.005) em relação ao grupo nutrido (N) (22583±6194) e nenhuma alteração nos níveis de H3K9Ac (Mn: 27401±10248 vs. N: 30034±10423) ou H3K27me2 (Mn: 16693±4842 vs. N: 16187 ±3378). Tratamento das culturas com um inibidor de histona acetiltransferase (HAT), promoveu uma redução da acetilação de maneira dose dependente menor nos astrócitos do grupo malnutrido em relação ao nutrido. Através de análises por citometria de fluxo não observaram-se diferenças entre as grupos (H3K9Ac - Mn: 13217± 6821 vs. N:14620± 6515 / H3K4me2 - Mn: 22917± 14938 vs. N: 25956± 14258). Por outro lado, o tratamento dos astrócitos por 24 horas com 100μM de DHA promoveu um aumento de 60% na acetilação de H3K9 do grupo malnutrido. Análise de western blot para GFAP mostrou que ambos os grupos apresentam a expressão predominante da isoforma fosforilada desta proteína com 50kDa. Imunocitoquímica para H3K9Ac em neurônios mostrou um aumento nos níveis de fluorescência no grupo malnutrido (Mn: 30107±6789 vs. N: 25257±7562, P = 0.0075), e nenhuma diferença entre os grupos em relação à H3K4me2 (Mn: 23203±7059 vs. N: 22654± 5376). Não houve ativação do fator de transcrição gênica NK-kB nestas células. O perfil de ácidos graxos do leite materno no estômago dos neonatos foi avaliado por cromatografia gasosa, mostrando que a razão ácido linoleico/ácido alfa-linolênico da DBR é mantida. H3K9Ac e H3K4me2 estão envolvidos no aumento da transcrição de genes relacionados à gênese e diferenciação de astrócitos e neurônios. Nossos resultados indicam uma possível relação entre a razão favorável de n-6/n-3 presente na DBR sobre a promoção da transcrição gênica, mesmo em um contexto de baixa proteína. Além disso, sugere-se que o DHA esteja atuando sobre a acetilação, mantendo-a estável, em função da sua influência sobre as enzimas que atuam nesse processo. / Omega-3 essential fatty acids play key roles during brain development acting on gene transcription and epigenetic mechanisms influencing the genesis and differentiation of neurons and astrocytes. On the other hand, evidence has shown that maternal protein malnutrition may negatively change epigenetic patterns of the fetal genome. The present study investigated whether a low and favorable ômega-6/ômega-3 (n-6/n-3) ratio on maternal diet may induce histone post-translational changes in neural cells of the offspring, even in a condition of protein and micronutrients deficiency. Wistar rats were maintained on a diet with multifactorial deficiency (Regional Basic Diet-RBD) containing, however, a low n-6/n-3 ratio compared to the control diet, 30 days prior to mating and during gestation. Embryos of 16 days and newborns from 0 to 3 postnatal days were used to obtain cortical neuron and astrocyte primary cultures, respectively. Acetylation of H3K9 and dimethylation of H3K4 and H3K27 were evaluated by flow cytometry and immunocytochemistry. The results of optical density showed increased levels of H3K4me2 in astrocytes of the malnourished group (Mn) (27115 ± 9892; P <0.005) when compared to the nourished group (N) (22583 ± 6194). On the other hand, no change in the H3K9Ac (Mn: 27401 ± 10248 vs. N: 30034 ± 10423) or H3K27me2 (Mn: 16693 ± 4842 vs. N: 16187 ± 3378) were observed. Treatment of astrocyte cultures with an inhibitor of histone acetyltransferase (HAT), was able to decrease acetylation in a dose-dependent manner; however, this decay was less intense in astrocytes of the malnourished group compared to the nourished. Through analysis by flow cytometry no intergroup differences (H3K9Ac - Mn: 13217± 6821 vs. N: 14620 ± 6515 / H3K4me2 - Mn: 22917± 14938 vs. N: 25956± 14258). On the other hand, the treatment of astrocytes by 24 h with 100 μM DHA increased ~60% H3K9 acetylation levels of astrocytes in the malnourished group. Western blot analysis for GFAP showed in both groups the predominant expression of the phosphorylated isoform with 50 kDa. Immunocytochemistry for H3K9Ac and H3K4me2 in neurons indicated an increase in the levels of H3K9Ac fluorescence in the malnourished group (Mn: 30107 ± 6789 vs. N: 25257 ± 7562, P=0.0075) and no intergroup difference in the H3K4me2 (Mn: 23203 ± 7059 vs. N: 22654 ± 5376). No activation of the transcription factor NK-kB gene was found in these cells. The fatty acid profile of the breast milk in the stomach of newborns was evaluated by gas chromatography, showing that the linoleic/alpha-linolenic ratio present in the RBD is maintained. H3K9ac and H3K4me2 are involved in the increased transcription of genes related to the genesis and differentiation of astrocytes and neurons. In this way, the results obtained in this study points to a possible contribution of low n-6/n-3 present in the RBD on promotion of gene transcription, even in a context of low protein. In addition, it is suggested that DHA is acting on the acetylation, keeping it stable, probably due a potential influence on the enzymes involved in this process.