The aim of this thesis was to investigate the prognostic role of the proliferation markers cyclin B1 and Phosphorylated Histone 3 (PPH3) in breast cancer (BC). In paper I we used an experimental study design, we compared women dying early from their BC with women free from relapse more than eight years after initial diagnosis. All women had stage I, node-negative and hormone receptor positive disease. None had received adjuvant chemotherapy. We found that low-risk node negative patients with high expression of cyclin B1 had a significantly worse outcome than patients with low expression of cyclin B1. In paper II a population-based case control study was performed to further investigate the prognostic value of cyclin B1. One hundred and ninety women who died from BC were defined as cases and 190 women alive at the time for the corresponding case’s death were defined as controls. Inclusion criteria were tumor size 50 mm, no lymph node metastases, and no adjuvant chemotherapy. Two investigators evaluated the stainings independently. Cyclin B1 was found to be a prognostic factor for BC death that could identify high-risk patients with a good to very good reproducibility. Paper III aimed to investigate the role of proliferation in male breast cancer (MBC). One hundred and ninety-seven MBC tumors were stained for cyclin A, B1, D1 and Ki67. Overexpression of cyclin A and B1 and elevated mitotic count were predictive of breast cancer death. Ki67 was re-evaluated and different cut-offs were used, but no prognostic value could be demonstrated. On the other hand high levels of cyclin D1 were associated with better outcome in MBC. In paper IV we applied the immunohistochemichal panel suggested from international guidelines to the same patient material as in paper II, to discriminate luminal A from luminal B BC. We wanted to evaluate if different cut-off values of Ki67, cyclin A or B1 could more clearly separate luminal A from B. Cyclin A, B1 and Ki67 (cut-off 20%) could detect difference in outcome between these subtypes with cyclin A showing greater prognostic value. The aim of paper V was to examine the prognostic role of PPH3 compared to the proliferation markers Ki67, cyclin A and cyclin B1 with focus on ER positive disease. PPH3 was found to be a prognostic factor for breast cancer death but in the multivariate analysis including all proliferation markers, only cyclin A remained a prognostic factor. Finally, we conclude that both cyclin B1 and PPH3 are prognostic factors for breast cancer death, but are outperformed by cyclin A in ER positive patients. In male breast cancer prognostic factors need to be further studied.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-09-02T14:54:35Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO - Alinny R Isaac - 2016.pdf: 2520039 bytes, checksum: 294508e64fe5208cfd8d2b48f9465be5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T14:54:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO - Alinny R Isaac - 2016.pdf: 2520039 bytes, checksum: 294508e64fe5208cfd8d2b48f9465be5 (MD5) Previous issue date: 2016-02-16 / CNPq / Ácidos graxos essenciais da família ômega-3 são cruciais durante o desenvolvimento cerebral atuando na transcrição gênica e sobre mecanismos epigenéticos, influenciando a gênese e diferenciação de neurônios e astrócitos. Por outro lado, evidências têm mostrado que a desnutrição materno-proteica pode modificar negativamente padrões epigenéticos do genoma fetal. O presente estudo investigou se uma razão ômega-6/ômega-3 (n-6/n-3) favorável na dieta materna pode influenciar alterações pós-traducionais em histonas de células neurais da prole, mesmo em uma condição de deficiência em proteínas e outros micronutrientes. Ratas Wistar foram mantidas em uma dieta com deficiência multifatorial (Dieta Básica Regional – DBR) possuindo, entretanto, uma baixa razão n-6/n-3 em relação a dieta controle, 30 dias antes do acasalamento e durante a gestação. Embriões de 16 dias de gestação e neonatos de 0 a 3 dias pós-natais foram utilizados para a realização de culturas corticais de neurônios e astrócitos, respectivamente. Acetilação de H3K9 e dimetilação de H3K4 e H3K27 foram avaliados por imunocitoquímica e citometria de fluxo. Análises por densitometria ótica mostraram aumento nos níveis de H3K4me2 nos astrócitos do grupo malnutrido (Mn) (27115±9892 P < 0.005) em relação ao grupo nutrido (N) (22583±6194) e nenhuma alteração nos níveis de H3K9Ac (Mn: 27401±10248 vs. N: 30034±10423) ou H3K27me2 (Mn: 16693±4842 vs. N: 16187 ±3378). Tratamento das culturas com um inibidor de histona acetiltransferase (HAT), promoveu uma redução da acetilação de maneira dose dependente menor nos astrócitos do grupo malnutrido em relação ao nutrido. Através de análises por citometria de fluxo não observaram-se diferenças entre as grupos (H3K9Ac - Mn: 13217± 6821 vs. N:14620± 6515 / H3K4me2 - Mn: 22917± 14938 vs. N: 25956± 14258). Por outro lado, o tratamento dos astrócitos por 24 horas com 100μM de DHA promoveu um aumento de 60% na acetilação de H3K9 do grupo malnutrido. Análise de western blot para GFAP mostrou que ambos os grupos apresentam a expressão predominante da isoforma fosforilada desta proteína com 50kDa. Imunocitoquímica para H3K9Ac em neurônios mostrou um aumento nos níveis de fluorescência no grupo malnutrido (Mn: 30107±6789 vs. N: 25257±7562, P = 0.0075), e nenhuma diferença entre os grupos em relação à H3K4me2 (Mn: 23203±7059 vs. N: 22654± 5376). Não houve ativação do fator de transcrição gênica NK-kB nestas células. O perfil de ácidos graxos do leite materno no estômago dos neonatos foi avaliado por cromatografia gasosa, mostrando que a razão ácido linoleico/ácido alfa-linolênico da DBR é mantida. H3K9Ac e H3K4me2 estão envolvidos no aumento da transcrição de genes relacionados à gênese e diferenciação de astrócitos e neurônios. Nossos resultados indicam uma possível relação entre a razão favorável de n-6/n-3 presente na DBR sobre a promoção da transcrição gênica, mesmo em um contexto de baixa proteína. Além disso, sugere-se que o DHA esteja atuando sobre a acetilação, mantendo-a estável, em função da sua influência sobre as enzimas que atuam nesse processo. / Omega-3 essential fatty acids play key roles during brain development acting on gene transcription and epigenetic mechanisms influencing the genesis and differentiation of neurons and astrocytes. On the other hand, evidence has shown that maternal protein malnutrition may negatively change epigenetic patterns of the fetal genome. The present study investigated whether a low and favorable ômega-6/ômega-3 (n-6/n-3) ratio on maternal diet may induce histone post-translational changes in neural cells of the offspring, even in a condition of protein and micronutrients deficiency. Wistar rats were maintained on a diet with multifactorial deficiency (Regional Basic Diet-RBD) containing, however, a low n-6/n-3 ratio compared to the control diet, 30 days prior to mating and during gestation. Embryos of 16 days and newborns from 0 to 3 postnatal days were used to obtain cortical neuron and astrocyte primary cultures, respectively. Acetylation of H3K9 and dimethylation of H3K4 and H3K27 were evaluated by flow cytometry and immunocytochemistry. The results of optical density showed increased levels of H3K4me2 in astrocytes of the malnourished group (Mn) (27115 ± 9892; P <0.005) when compared to the nourished group (N) (22583 ± 6194). On the other hand, no change in the H3K9Ac (Mn: 27401 ± 10248 vs. N: 30034 ± 10423) or H3K27me2 (Mn: 16693 ± 4842 vs. N: 16187 ± 3378) were observed. Treatment of astrocyte cultures with an inhibitor of histone acetyltransferase (HAT), was able to decrease acetylation in a dose-dependent manner; however, this decay was less intense in astrocytes of the malnourished group compared to the nourished. Through analysis by flow cytometry no intergroup differences (H3K9Ac - Mn: 13217± 6821 vs. N: 14620 ± 6515 / H3K4me2 - Mn: 22917± 14938 vs. N: 25956± 14258). On the other hand, the treatment of astrocytes by 24 h with 100 μM DHA increased ~60% H3K9 acetylation levels of astrocytes in the malnourished group. Western blot analysis for GFAP showed in both groups the predominant expression of the phosphorylated isoform with 50 kDa. Immunocytochemistry for H3K9Ac and H3K4me2 in neurons indicated an increase in the levels of H3K9Ac fluorescence in the malnourished group (Mn: 30107 ± 6789 vs. N: 25257 ± 7562, P=0.0075) and no intergroup difference in the H3K4me2 (Mn: 23203 ± 7059 vs. N: 22654 ± 5376). No activation of the transcription factor NK-kB gene was found in these cells. The fatty acid profile of the breast milk in the stomach of newborns was evaluated by gas chromatography, showing that the linoleic/alpha-linolenic ratio present in the RBD is maintained. H3K9ac and H3K4me2 are involved in the increased transcription of genes related to the genesis and differentiation of astrocytes and neurons. In this way, the results obtained in this study points to a possible contribution of low n-6/n-3 present in the RBD on promotion of gene transcription, even in a context of low protein. In addition, it is suggested that DHA is acting on the acetylation, keeping it stable, probably due a potential influence on the enzymes involved in this process.

Analyse fonctionnelle de la protéine Enhancer of Zeste, SlEZ2, chez la tomate, Solanum lycopersicumLes protéines Polycomb, initialement découvertes chez la drosophile, ont récemment caractérisées chez les plantes où elles remplissent des fonctions essentielles au cours du développement de la plante. Chez la drosophile, les protéines polycomb (PcG) agissent sous forme de trois complexes multi-protéiques : PRC1, PRC2 et PhoRC. Seulement, deux de ces complexes ont été identifiés chez les plantes : un orthologue fonctionnel du complexe PRC1 (PRC1-like) et PRC2. Le complexe PRC2 maintien la chromatine dans un état condensé et intervient dans le contrôle du développement des fleurs, des graines, des fruits et des feuilles. Chez la tomate Solanum lycopersicum, le complexe PRC2 est composé de trois protéines polycomb : SlEMF2 (EMbryotic Flower), SlFIE (Fertilization Independent Endosperm) and SlE(Z) (Enhancer of Zeste). Les protéines SlE(Z) portent l’activité histone méthyl transférase qui permet la mise en place de la marque répressive H3K27me3. Chez la plante modèle, Arabidopsis thaliana, cette marque joue un rôle essentiel au cours du développement de la plante Afin d’étudier le rôle du complexe PRC2 dans le développement du fruit et de la plante de tomate, et plus particulièrement de la protéine SlE(Z), nous avons identifié trois gènes codant les protéines SlE(Z) : SlEZ1, SlEZ2 et SlEZ3. Au laboratoire, il a récemment été montré que la protéine SlEZ1 intervient au cours du développement floral (How Kit et al., 2010). L’objectif de ce travail est de déterminer la fonction de la protéine SlEZ2 au cours du développement du fruit et de la plante de tomate. Pour cela, nous avons analysé des plantes transgéniques sous exprimant le gène SlEZ2, orthologue au gène CURLY LEAF d’A. thaliana, par stratégie RNAi. Ce travail indique que la protéine SlEZ2 est impliquée dans la croissance de la plante de tomate, ainsi que dans le développement des feuilles, des fleurs et des fruits. Les plantes transgéniques présentent des phénotypes pléiotropes tels que des fleurs et des feuilles modifiées, un fort taux d’avortement des fruits, des fruits de texture et de couleur altérées ainsi qu’une réduction de la taille des plantes. De plus, nous avons identifiés quatre gènes ciblés par la protéine SlEZ2 dont l’expression est dérégulée dans les feuilles. Il s’agit de deux gènes à MADS box, TAG1 et TAGL1, ainsi que de deux gènes KNOX, LeT6 et TKN4. / Functional analysis SlEZ2, a tomato Enhancer of zeste proteinPolycomb proteins, first discovered in Drosophila, have been identified in plants and play essential functions in plant development. In Drosophila, polycomb proteins (PcG) acts as a complex and three have been identified: PRC1, PRC2 and PhoRC. However, only two polycomb complexes have been identified in plants: like-PCR1 and PRC2. The PCR2 complex maintain chromatin in a closed state and control flower, seed, fruit and leaf development.In tomato Solanum lycopersicum, PRC2 is composed by three polycomb proteins SlEMF2 (EMbryotic Flower), SlFIE (Fertilization Independent Endosperm) and SlE(Z) (Enhancer of Zeste)(Enhancer of Zeste). SlE(Z) proteins have a methyltransferase activity that puts in place an repressive epigenetic mark a trimethylation of lysine 27 histone 3. In plant model, Arabidopsis thaliana, this mark plays an essential role in plant development but little is known about PRC2 role in plant and fruit development of tomato. In order to unravel the function of the E(z) protein in the control of tomato fruit and plant development, we have characterized three E(z) encoding genes, namely SlEz1, SlEz2 and SlEZ3. In a recent work, we reported that SlEZ1 protein plays a role in flower development (How Kit at al., 2010). The aim of this present study was to determine the function of the SlEZ2 protein in plant and fruit development. We present our results focusing on RNAi transgenic plants which underexpressed SlEZ2 gene, homologue of Curly Leaf Arabidopsis gene. This analysis indicates that SlEZ2 protein is implicated in tomato plant growth and affects also leaf, flower and fruit development. Phenotypes include abnormal flowers and leafs, fruit development abortion, altered fruit colour and texture and plant of reduced size. Moreover, we characterize four target genes of SlEZ2 genes in leaves which present a deregulated expression : TAG1, TAGL1, LeT6 and TKN4.

Os camarões do gênero Atya Leach, 1816 são os maiores camarões da família Atyidae, sendo que as 13 espécies reconhecidas estão distribuídas em rios e riachos das regiões tropicais e subtropicais da América (vertentes atlântica e pacífica) e oeste da África. O primeiro relato de uma Atya ocorreu no séc. XVII e, desde então, novas espécies foram descritas e descrições prévias revisadas, produzindo um histórico de instabilidade e reclassificações. Embora ao longo do séc. XX revisões taxonômicas tenham estabilizado a sistemática do gênero, a variabilidade morfológica e distribuição geográfica trans-ístmica da espécie A. innocous gerou questionamentos. Além disso, mais recentemente trabalhos de filogenia molecular da família Atyidae que incluíram representantes de Atya suscitaram questões em relação à sistemática do gênero (possível não monofilia) e de algumas espécies como A. gabonensis, A. margaritacea e A. scabra. Visto que o uso de marcadores moleculares nunca foi empregado para a delimitação das espécies de Atya e que seu uso de forma complementar à morfologia poderia aperfeiçoar a sistemática do gênero, o objetivo do presente estudo foi avaliar por meio de dados moleculares as hipóteses taxonômicas das espécies A. gabonensis, A. innocous, A. margaritacea e A. scabra. Sequências dos genes mitocondriais 16S e Citocromo Oxidase I e gene nuclear Histona 3 foram geradas por meio de protocolos de extração e sequenciamento de DNA a partir do tecido de espécimes obtidos em empréstimos/doações. Potenciais espécies evidenciadas pelas análises de similaridade nucleotídicas (distâncias genéticas), compartilhamento de caracteres em um contexto evolutivo (reconstruções filogenéticas), Automatic Barcode Gap Discovery, Poisson Tree Processes e Generalized Mixed Yule Coalescence foram confrontadas com as hipóteses taxonômicas específicas atuais. A avaliação sistemática com dados moleculares aqui realizada, adicionalmente às informações morfológicas existentes na literatura sustentaram A. gabonensis como uma espécie de distribuição anfi-atlântica, mas não corroborou a hipótese de A. innocous como uma espécie trans-ístmica. Assim, o uso do nome A. innocous para as populações do Mar do Caribe e A. tenella para aquelas restritas ao Pacífico é sugerido. A espécie A. margaritacea, distribuída ao longo da costa pacífica da América foi considerada uma espécie válida e distinta de A. scabra, amplamente distribuída na vertente atlântica da América do Sul, África e Mar do Caribe. Contudo, é discutida a possibilidade de uma espécie críptica restrita no Golfo do México existir. Adicionalmente, o conhecimento existente e pertinente para futuros estudos de sistemática e taxonomia sobre os camarões do gênero Atya foram sumarizados e são apresentados. / The genus Atya Leach, 1816 shrimps are the largest of the Atyidae family, and the 13 acknowledge species are geographically distributed in rivers and stream in the tropical and subtropical regions of America (Atlantic and Pacific drainages) and West Africa. The first registry of an Atya was in the XVII century and since then new species were described and previous description revised in an eventful taxonomic historic. Although throughout the XX century taxonomic revisions stabilized the genus systematics, the morphological variability and the trans-isthmic geographic distribution of A. innocous caused questioning. Moreover, molecular phylogenetic studies that included Atya representatives raised doubt on the genus systematics (possibly non-monophyletism) and some species A. gabonensis A. margaritacea and A. scabra hypothesis. As molecular markers have never been used concerning Atya species delimitation complementary to the morphology and it could improve the genus systematics, the goal of this study was to evaluate with molecular markers the taxonomic hypothesis of the species A. gabonensis, A. innocous, A. margaritacea e A. scabra. Sequences of the mitochondrial genes 16S and Cytochrome Oxidase I and nuclear gene Histone 3 were generated by means of DNA extraction and sequence protocols from specimens obtained in loans/donations. Putative species evidenced by the analysis of nucleotide similarity (genetic distances), character sharing (phylogenetic reconstitutions), Automatic Barcode Gap Discovery, Poisson Tree Processes and Generalized Mixed Yule Coalescence were compared to the prevailing taxonomic hypothesis. The systematic evaluation with the molecular data of this study, in addition with the morphological information in the literature sustain A. gabonensis as an amphi-atlantic distributed species, but do not corroborated A. innocous hypothesis as an trans-isthmian species. In this sense, the use of A. innocous stricto sensu for the Caribbeans Sea populations and A. tenella to that restricted to the pacific drainage of America is suggested. Atya margaritacea, distributed along the pacific drainage of America, is considered a valid species distinct from A. scabra, widespread distributed in the Atlantic drainage of America and Africa, besides Caribbean Sea. However, the possibility of a cryptic species in the Gulf of Mexico population is discussed. Aditionally, the relevant knowledge to future systematic and taxonomy studies about the shrimps of the genus Atya were summarized and are shown.

Os camarões do gênero Atya Leach, 1816 são os maiores camarões da família Atyidae, sendo que as 13 espécies reconhecidas estão distribuídas em rios e riachos das regiões tropicais e subtropicais da América (vertentes atlântica e pacífica) e oeste da África. O primeiro relato de uma Atya ocorreu no séc. XVII e, desde então, novas espécies foram descritas e descrições prévias revisadas, produzindo um histórico de instabilidade e reclassificações. Embora ao longo do séc. XX revisões taxonômicas tenham estabilizado a sistemática do gênero, a variabilidade morfológica e distribuição geográfica trans-ístmica da espécie A. innocous gerou questionamentos. Além disso, mais recentemente trabalhos de filogenia molecular da família Atyidae que incluíram representantes de Atya suscitaram questões em relação à sistemática do gênero (possível não monofilia) e de algumas espécies como A. gabonensis, A. margaritacea e A. scabra. Visto que o uso de marcadores moleculares nunca foi empregado para a delimitação das espécies de Atya e que seu uso de forma complementar à morfologia poderia aperfeiçoar a sistemática do gênero, o objetivo do presente estudo foi avaliar por meio de dados moleculares as hipóteses taxonômicas das espécies A. gabonensis, A. innocous, A. margaritacea e A. scabra. Sequências dos genes mitocondriais 16S e Citocromo Oxidase I e gene nuclear Histona 3 foram geradas por meio de protocolos de extração e sequenciamento de DNA a partir do tecido de espécimes obtidos em empréstimos/doações. Potenciais espécies evidenciadas pelas análises de similaridade nucleotídicas (distâncias genéticas), compartilhamento de caracteres em um contexto evolutivo (reconstruções filogenéticas), Automatic Barcode Gap Discovery, Poisson Tree Processes e Generalized Mixed Yule Coalescence foram confrontadas com as hipóteses taxonômicas específicas atuais. A avaliação sistemática com dados moleculares aqui realizada, adicionalmente às informações morfológicas existentes na literatura sustentaram A. gabonensis como uma espécie de distribuição anfi-atlântica, mas não corroborou a hipótese de A. innocous como uma espécie trans-ístmica. Assim, o uso do nome A. innocous para as populações do Mar do Caribe e A. tenella para aquelas restritas ao Pacífico é sugerido. A espécie A. margaritacea, distribuída ao longo da costa pacífica da América foi considerada uma espécie válida e distinta de A. scabra, amplamente distribuída na vertente atlântica da América do Sul, África e Mar do Caribe. Contudo, é discutida a possibilidade de uma espécie críptica restrita no Golfo do México existir. Adicionalmente, o conhecimento existente e pertinente para futuros estudos de sistemática e taxonomia sobre os camarões do gênero Atya foram sumarizados e são apresentados. / The genus Atya Leach, 1816 shrimps are the largest of the Atyidae family, and the 13 acknowledge species are geographically distributed in rivers and stream in the tropical and subtropical regions of America (Atlantic and Pacific drainages) and West Africa. The first registry of an Atya was in the XVII century and since then new species were described and previous description revised in an eventful taxonomic historic. Although throughout the XX century taxonomic revisions stabilized the genus systematics, the morphological variability and the trans-isthmic geographic distribution of A. innocous caused questioning. Moreover, molecular phylogenetic studies that included Atya representatives raised doubt on the genus systematics (possibly non-monophyletism) and some species A. gabonensis A. margaritacea and A. scabra hypothesis. As molecular markers have never been used concerning Atya species delimitation complementary to the morphology and it could improve the genus systematics, the goal of this study was to evaluate with molecular markers the taxonomic hypothesis of the species A. gabonensis, A. innocous, A. margaritacea e A. scabra. Sequences of the mitochondrial genes 16S and Cytochrome Oxidase I and nuclear gene Histone 3 were generated by means of DNA extraction and sequence protocols from specimens obtained in loans/donations. Putative species evidenced by the analysis of nucleotide similarity (genetic distances), character sharing (phylogenetic reconstitutions), Automatic Barcode Gap Discovery, Poisson Tree Processes and Generalized Mixed Yule Coalescence were compared to the prevailing taxonomic hypothesis. The systematic evaluation with the molecular data of this study, in addition with the morphological information in the literature sustain A. gabonensis as an amphi-atlantic distributed species, but do not corroborated A. innocous hypothesis as an trans-isthmian species. In this sense, the use of A. innocous stricto sensu for the Caribbeans Sea populations and A. tenella to that restricted to the pacific drainage of America is suggested. Atya margaritacea, distributed along the pacific drainage of America, is considered a valid species distinct from A. scabra, widespread distributed in the Atlantic drainage of America and Africa, besides Caribbean Sea. However, the possibility of a cryptic species in the Gulf of Mexico population is discussed. Aditionally, the relevant knowledge to future systematic and taxonomy studies about the shrimps of the genus Atya were summarized and are shown.