Das Surfactant-Protein C (SP-C) moduliert die Rheologie der Liquor cerebrospinalis (CSF). Während des Alterns geht sein abnehmender Spiegel mit einer erhöhten Belastung durch Läsionen der weißen Substanz einher. Pulmonale SP-C-Zwischenprodukte, die die BRICHOS-Domäne enthalten, verhindern Proteinfehlfaltung in der Lunge. So könnten zerebrale SP-C-Zwischenprodukte der zerebralen β-Amyloidose, einem Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit, entgegenwirken. Es fehlen jedoch Daten über die molekulare Neuroanatomie von SP-C und seine Veränderungen in Wildtyp- und triple-transgenen (3xTg) Mäusen, die wesentliche Elemente der AD-Neuropathologie aufweisen. In dieser Studie wurden daher SP-C-haltige Strukturen im Vorderhirn von Mäusen und ihre räumlichen Beziehungen zu vaskulären, glialen und neuronalen Komponenten der neurovaskulären Einheit untersucht. Durch Fluoreszenzmarkierung wurde neuronales SP-C in der medialen Habenula, dem Indusium griseum und dem Hippocampus nachgewiesen. Die Glia-Gegenfärbung zeigte Astrozyten im Corpus callosum, die SP-C und S100β gemeinsam exprimieren. Insbesondere waren perineuronale Netze mit SP-C im Nucleus reticularis thalami, im lateralen Hypothalamus und im retrosplenialen Kortex assoziiert. Im Hippocampus älterer 3xTg-Mäuse wurden neben AD-ähnlichen Läsionen vermehrt punktförmige Ablagerungen gefunden, die SP-C und Reelin enthielten, aber keine BRICHOS-Immunreaktivität aufwiesen. Wildtyp- und 3xTg-Mäuse zeigten eine altersabhängige Zunahme solcher Ablagerungen, die bei etwa 24 Monate alten 3xTg-Mäusen deutlich ausgeprägt war. Die SP-C-Konzentrationen in den intra- und extrazellulären Kompartimenten jeder Gruppe zeigten eine umgekehrte Korrelation zwischen SP-C und Reelin, wobei insbesondere bei 3xTg-Mäusen eine altersabhängige Abnahme von SP-C und eine Zunahme von Reelin zu beobachten war. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass extrazelluläres SP-C als Modulator der glymphatischen Clearance und potenzieller Ligand von PNs während des Alterns bei 3xTg-Mäusen abnimmt.:Inhaltsverzeichnis 1. Einführung...........................................................................................................1 2. Grundlagen .........................................................................................................4 2.1 Alzheimersche Erkrankung ...............................................................................4 2.2 Glymphatisches System....................................................................................6 2.3 Surfactant-Protein C..........................................................................................8 3. Zielsetzung..........................................................................................................12 4. Material und Methoden .......................................................................................13 4.1 Versuchstiere ....................................................................................................13 4.2 Gewebeaufbereitung für die Histochemie .........................................................14 4.3 Immunhistochemische Färbungen ....................................................................14 4.4 SP-C, gliale und neurovaskuläre Marker............................................................15 4.5 Doppelfärbungen in Kombination mit der Cy2-Markierung von SP-C................16 4.6 Mikroskopie und Bildgebung ..............................................................................17 4.7 Semiquantifizierung der SP-C-Ablagerungen im Hippokampus ........................18 4.8 Biochemische Analyse des SP-C- und Reelin-Gehalts in Mäusehirnen.............19 4.9 Statistische Auswertung der ELISA-Ergebnisse.................................................20 5. Ergebnisse ...........................................................................................................22 5.1 Qualitative Analyse der SP-C-Verteilung im Vorderhirn von Mäusen.................22 5.2 Semiquantitative Auswertung hippokampaler SP-C-Ablagerungen ..................39 5.3 Quantitative Analyse des SP-C- und Reelin-Gehalts in Mäusehirnen...............41 6. Diskussion............................................................................................................52 6.1 Technische Betrachtungen.................................................................................52 6.2 SP-C bei Drainage und Amyloidogenese ..........................................................53 6.3 SP-C und gliale Marker .....................................................................................55 6.4 SP-C und perineuronale Netze .........................................................................56 7. Zusammenfassung der Arbeit .............................................................................58 8. Literaturverzeichnis..............................................................................................63 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit..........................................80 Lebenslauf................................................................................................................81 Danksagung ............................................................................................................83

Zusammenfassung: Patienten mit Down Syndrom (DS, Trisomie 21) entwickeln im vierten Lebensjahrzehnt eine Neuropathologie, wie sie beim Morbus Alzheimer (AD) beobachtet wird. Im Gehirn dieser Patienten kommt es zur Ausbildung von senilen Plaques, neurofibrillären Veränderungen und zu einer Schädigung des cholinergen Systems. Als erstes Zeichen der beginnenden Veränderungen wird die erhöhte Konzentration und Akkumulation von sogenannten beta-A4-Peptiden gewertet. Diese Peptide, die auch den Hauptbestandteil der senilen Plaques darstellen, entstehen durch die Prozessierung eines größeren Proteins des Amyloidvorläuferproteins (amyloid precursor protein, APP). Beim Menschen wurde das APP-Gen auf einem distalen Segment des langen Arms des Chromosoms 21 lokalisiert. Das Homolog dieses evolutionär stark konservierten, syntenen Segmentes liegt bei der Maus auf dem Chromosom 16. Natürlich in wilden Mäusepopulationen auftretende Robertsonsche Translokationen ermöglichen es, Mäuse mit Trisomie 16 zu züchten. Mit Hilfe der Maus-Trisomie 16 sollte ein Modell etabliert werden, mit dem es unter in vivo Bedingungen möglich ist, die Auswirkungen der erhöhten APP-Gendosis auf die Ausbildung der bei DS und AD beobachteten neurodegenerativen Veränderungen zu untersuchen. Da trisomische Feten am Ende der Trächtigkeit absterben, wurden aus dem basalen Vorderhirn trisomischer und diploider Feten Transplantate gewonnen und in den Lateralventrikel adulter euploider Mäuse implantiert. Die Entwicklung der Transplantate wurde nach 1, 3, 6, 9 und 12 Monaten immunhistochemisch charakterisiert. Ein Antikörper gegen das Thymozytenantigen (Thy)-1.2 wurde, beruhend auf der unterschiedlichen Thy-1-Allel-Expression von Transplantat und Empfänger, zur Transplantatidentifikation genutzt. Mit Antikörpern gegen das neuronale Markerprotein PGP-9.5, gegen Cholinacetyltransferase, Parvalbumin und Glutamatdecarboxylase wurden Neuronen charakterisiert. Die immunologische Reaktion wurde mit Antikörpern gegen saures fibrilläres Gliaprotein, gegen das Makrophagenantigen F4/80, gegen CD3, gegen CD45/ B220 und mit Lycopersicon esculentum-Lektin untersucht. Für den APP- bzw. beta-A4-Peptidnachweis wurden ein Antikörper gegen den C-Terminus des APP und der Antikörper 4G8 eingesetzt. Zusätzlich wurde mit Hilfe von molekularbiologischen Techniken (Northern-Blot, Polymerase-Kettenreaktion) die APP-Expression in Trisomie 16-Feten untersucht. Mit immunhistochemischen und histochemischen Methoden wurde versucht, den Entwicklungstand des basalen Vorderhirns zum Zeitpunkt der Transplantatpräparation am Gestationstag 15 zu untersuchen. / Summary: Patients suffering from Down's syndrome (DS, trisomy 21) develop neuropathological abnormalities similar to Alzheimer's disease (AD) in the fourth decade of life. Amongst others, neuritic plaques, neurofibrillary abnormalities and alterations in cholinergic basal forebrain systems were observed. These sequentially occuring disturbancies are initiated by a rise in the concentration and accumulation of the beta-amyloid-peptides. The beta-amyloid-peptides are derived by proteolytic processing from a larger amyloid precursor protein (APP) and compose the majority of the material deposited in amyloid plaques. In humans, the APP gene maps to the distal segment of the long arm of chromosome 21, but in mice the homolog gene locus is on chromosome 16. The naturally occuring Robertsonian translocations in feral mice (Mus musculus sp.) allow to breed trisomy 16 mice. The aim of this study was to establish an in vivo model to investigate the consequences of increased APP gene dosage on the generation of neuropathological abnormalities typical for DS and AD using trisomy 16 mice. Since trisomy 16 mice die at the end of prenatal development, basal forebrain tissue of diploid and trisomic fetuses was prepared and transplanted into lateral ventricles of adult euploid mice. Grafts were identified immunocytochemically using an antibody against thymocyte antigen-1.2, selectively labeling graftet tissue. Antibodies against the neuronal markerprotein PGP-9.5, choline acetyltransferase, parvalbumin and glutamate decarboxylase were used to characterize grafted neurons over a period of twelve months after implantation. The immunological tissue response in the brains of acceptor mice was monitored using antibodies against glial fibrillary acidic protein (GFAP), the macrophage antigen F4/80, CD3,CD45/B220 and using the Lycopersicon esculentum lectin. To detect APP and beta-amyloid-peptides,antibodies against a C-terminal APP fragment and the antibody 4G8 were used. Additionally, the APP mRNA expression in trisomy 16 mice was followed employing Northern-blot analysis and RT-PCR. The developmental state of basal forebrain tissue to be transplanted was characterized at the time of transplantation (gestation day 15) by means of histochemistry and immunohistochemistry.

Zusammenfassung: Patienten mit Down Syndrom (DS, Trisomie 21) entwickeln im vierten Lebensjahrzehnt eine Neuropathologie, wie sie beim Morbus Alzheimer (AD) beobachtet wird. Im Gehirn dieser Patienten kommt es zur Ausbildung von senilen Plaques, neurofibrillären Veränderungen und zu einer Schädigung des cholinergen Systems. Als erstes Zeichen der beginnenden Veränderungen wird die erhöhte Konzentration und Akkumulation von sogenannten beta-A4-Peptiden gewertet. Diese Peptide, die auch den Hauptbestandteil der senilen Plaques darstellen, entstehen durch die Prozessierung eines größeren Proteins des Amyloidvorläuferproteins (amyloid precursor protein, APP). Beim Menschen wurde das APP-Gen auf einem distalen Segment des langen Arms des Chromosoms 21 lokalisiert. Das Homolog dieses evolutionär stark konservierten, syntenen Segmentes liegt bei der Maus auf dem Chromosom 16. Natürlich in wilden Mäusepopulationen auftretende Robertsonsche Translokationen ermöglichen es, Mäuse mit Trisomie 16 zu züchten. Mit Hilfe der Maus-Trisomie 16 sollte ein Modell etabliert werden, mit dem es unter in vivo Bedingungen möglich ist, die Auswirkungen der erhöhten APP-Gendosis auf die Ausbildung der bei DS und AD beobachteten neurodegenerativen Veränderungen zu untersuchen. Da trisomische Feten am Ende der Trächtigkeit absterben, wurden aus dem basalen Vorderhirn trisomischer und diploider Feten Transplantate gewonnen und in den Lateralventrikel adulter euploider Mäuse implantiert. Die Entwicklung der Transplantate wurde nach 1, 3, 6, 9 und 12 Monaten immunhistochemisch charakterisiert. Ein Antikörper gegen das Thymozytenantigen (Thy)-1.2 wurde, beruhend auf der unterschiedlichen Thy-1-Allel-Expression von Transplantat und Empfänger, zur Transplantatidentifikation genutzt. Mit Antikörpern gegen das neuronale Markerprotein PGP-9.5, gegen Cholinacetyltransferase, Parvalbumin und Glutamatdecarboxylase wurden Neuronen charakterisiert. Die immunologische Reaktion wurde mit Antikörpern gegen saures fibrilläres Gliaprotein, gegen das Makrophagenantigen F4/80, gegen CD3, gegen CD45/ B220 und mit Lycopersicon esculentum-Lektin untersucht. Für den APP- bzw. beta-A4-Peptidnachweis wurden ein Antikörper gegen den C-Terminus des APP und der Antikörper 4G8 eingesetzt. Zusätzlich wurde mit Hilfe von molekularbiologischen Techniken (Northern-Blot, Polymerase-Kettenreaktion) die APP-Expression in Trisomie 16-Feten untersucht. Mit immunhistochemischen und histochemischen Methoden wurde versucht, den Entwicklungstand des basalen Vorderhirns zum Zeitpunkt der Transplantatpräparation am Gestationstag 15 zu untersuchen. / Summary: Patients suffering from Down''s syndrome (DS, trisomy 21) develop neuropathological abnormalities similar to Alzheimer''s disease (AD) in the fourth decade of life. Amongst others, neuritic plaques, neurofibrillary abnormalities and alterations in cholinergic basal forebrain systems were observed. These sequentially occuring disturbancies are initiated by a rise in the concentration and accumulation of the beta-amyloid-peptides. The beta-amyloid-peptides are derived by proteolytic processing from a larger amyloid precursor protein (APP) and compose the majority of the material deposited in amyloid plaques. In humans, the APP gene maps to the distal segment of the long arm of chromosome 21, but in mice the homolog gene locus is on chromosome 16. The naturally occuring Robertsonian translocations in feral mice (Mus musculus sp.) allow to breed trisomy 16 mice. The aim of this study was to establish an in vivo model to investigate the consequences of increased APP gene dosage on the generation of neuropathological abnormalities typical for DS and AD using trisomy 16 mice. Since trisomy 16 mice die at the end of prenatal development, basal forebrain tissue of diploid and trisomic fetuses was prepared and transplanted into lateral ventricles of adult euploid mice. Grafts were identified immunocytochemically using an antibody against thymocyte antigen-1.2, selectively labeling graftet tissue. Antibodies against the neuronal markerprotein PGP-9.5, choline acetyltransferase, parvalbumin and glutamate decarboxylase were used to characterize grafted neurons over a period of twelve months after implantation. The immunological tissue response in the brains of acceptor mice was monitored using antibodies against glial fibrillary acidic protein (GFAP), the macrophage antigen F4/80, CD3,CD45/B220 and using the Lycopersicon esculentum lectin. To detect APP and beta-amyloid-peptides,antibodies against a C-terminal APP fragment and the antibody 4G8 were used. Additionally, the APP mRNA expression in trisomy 16 mice was followed employing Northern-blot analysis and RT-PCR. The developmental state of basal forebrain tissue to be transplanted was characterized at the time of transplantation (gestation day 15) by means of histochemistry and immunohistochemistry.