Mais de quarenta proteínas humanas estão envolvidas em doenças amilóides, sendo a transtirretina (TTR) uma dessas. A dissociação do tetrâmero da TTR é a etapa limitante para sua via de agregação. Esta etapa pode ser dificultada pela ligação de pequenas moléculas a dois sítios na interface tetramérica da TTR e facilitada em variantes mutantes. A mutante V30M é a variante amiloidogênica mais frequente da TTR e, apesar da mutação não se encontrar no sítio de ligação de pequenas moléculas, pode limitar a interação de inibidores com esta proteína. Desta forma, a busca de inibidores da agregação da TTR tipo selvagem (TTRwt) e mutantes amiloidogênicas vem sendo realizada. Na presente tese, flavonóides, freqüentemente encontrados em alimentos, e agonistas sintéticos do receptor do hormônio tireoidiano, seletivos para a isoforma beta deste receptor, foram selecionados para testes de inibição da agregação da TTRwt e mutante V30M. A interação dos melhores inibidores com a TTR foi também caracterizada em detalhes. Para isto, um ensaio de agregação in vitro da TTR foi utilizado para triagem dos compostos; e a assinatura termodinâmica da interação dos melhores inibidores com a TTR, bem como as estruturas cristalográficas TTR:inibidores foram determinadas por calorimetria de titulação isotérmica e cristalografia de proteínas, respectivamente. Os compostos sintéticos, GC-1 e GC-24, mostraram-se inibidores eficazes, porém com potência moderada. Já as flavonas luteolina (LUT), apigenina (API) e crisina (CHR), a flavanona naringenina (NAR), o flavonol kaenferol (KAE) e a isoflavona genisteína (GEN) apresentaram boa potência e eficácia de inibição da agregação da TTR in vitro. Os inibidores NAR, CHR, GEN e KAE não mostraram mesma capacidade de inibição da mutante V30M e apresentaram cooperatividade negativa para ligação aos dois sítios da TTR. A posição dos inibidores no sítio, bem como a variabilidade química/ estrutural dos compostos testados parecem influenciar os mecanismos de interação com os dois sítios da TTR e a ligação à mutante V30M. Modificações no sítio da mutante V30M foram identificadas e são apontadas como a principal causa para a seletividade de alguns inibidores à forma selvagem da TTR. De modo geral, a investigação detalhada da interação de pequenas moléculas com a TTR permitiu propor as bases moleculares da cooperatividade entre os sítios desta proteína e das diferenças de interação dos inibidores com a forma selvagem e mutante V30M da TTR. / More than forty human proteins are involved in human amyloid diseases, being transthyretin (TTR) one of these. TTR tetramer dissociation is a limiting step for its aggregation pathway. This step can be delayed by small molecules binding to two binding sites in the TTR tetramer interface and enhanced in TTR amyloidogenic variants. The V30M mutant is the most frequent TTR amyloidogenic variant and, eventhough the mutation is not situated in the TTR binding site, this mutation can limit small molecule interaction with the V30M mutant. Therefore, the search for wild type (TTRwt) and amyloidogenic TTR mutant inhibitors is under investigation. In the present thesis, flavonoids, frequently found in food, and synthetic thyroid hormone receptor beta-selective agonists were selected for evaluation of their inhibition ability on TTRwt and V30M mutant aggregation. The interaction of the best inhibitors with TTR was also characterized in details. For this, an in vitro TTR aggregation assay was used for inhibitor screening, and the thermodynamic signature of interaction, as well the TTR:inhibitors crystal complexes were determined by isothermal titration calorimetry and protein crystallography, respectively. The synthetic compounds, GC-1 and GC-24, displayed high efficacy, however moderated inhibition potency. The flavones luteolin (LUT), apigenin (API), chrisin (CHR), the flavanone naringenin (NAR), the flavonol kaenferol (KAE) and the isoflavone genistein (GEN) showed good potency and efficacy of TTR aggregation inhibition in vitro. The inhibitors, CHR, NAR, GEN and KAE, had lower inhibition capacity to the V30M mutant, and displayed negative cooperativity of binding to the two TTR binding sites. The inhibitor position in the binding site, as well as the chemical/ structural variability of the tested compounds seems to influence the interaction mechanism with the two TTR binding sites and the binding to the V30M mutant. Modifications on the V30M mutant binding sites were identified and pointed as the main reasons for the selectivity of some inhibitors to the wild type TTR. Overall, the detailed inspection of small molecule interaction with TTR suggests the molecular basis of the cooperativity between the two TTR binding sites and also of the differences between the inhibitors interaction with the wild type and with the V30M mutant TTR.

Mais de quarenta proteínas humanas estão envolvidas em doenças amilóides, sendo a transtirretina (TTR) uma dessas. A dissociação do tetrâmero da TTR é a etapa limitante para sua via de agregação. Esta etapa pode ser dificultada pela ligação de pequenas moléculas a dois sítios na interface tetramérica da TTR e facilitada em variantes mutantes. A mutante V30M é a variante amiloidogênica mais frequente da TTR e, apesar da mutação não se encontrar no sítio de ligação de pequenas moléculas, pode limitar a interação de inibidores com esta proteína. Desta forma, a busca de inibidores da agregação da TTR tipo selvagem (TTRwt) e mutantes amiloidogênicas vem sendo realizada. Na presente tese, flavonóides, freqüentemente encontrados em alimentos, e agonistas sintéticos do receptor do hormônio tireoidiano, seletivos para a isoforma beta deste receptor, foram selecionados para testes de inibição da agregação da TTRwt e mutante V30M. A interação dos melhores inibidores com a TTR foi também caracterizada em detalhes. Para isto, um ensaio de agregação in vitro da TTR foi utilizado para triagem dos compostos; e a assinatura termodinâmica da interação dos melhores inibidores com a TTR, bem como as estruturas cristalográficas TTR:inibidores foram determinadas por calorimetria de titulação isotérmica e cristalografia de proteínas, respectivamente. Os compostos sintéticos, GC-1 e GC-24, mostraram-se inibidores eficazes, porém com potência moderada. Já as flavonas luteolina (LUT), apigenina (API) e crisina (CHR), a flavanona naringenina (NAR), o flavonol kaenferol (KAE) e a isoflavona genisteína (GEN) apresentaram boa potência e eficácia de inibição da agregação da TTR in vitro. Os inibidores NAR, CHR, GEN e KAE não mostraram mesma capacidade de inibição da mutante V30M e apresentaram cooperatividade negativa para ligação aos dois sítios da TTR. A posição dos inibidores no sítio, bem como a variabilidade química/ estrutural dos compostos testados parecem influenciar os mecanismos de interação com os dois sítios da TTR e a ligação à mutante V30M. Modificações no sítio da mutante V30M foram identificadas e são apontadas como a principal causa para a seletividade de alguns inibidores à forma selvagem da TTR. De modo geral, a investigação detalhada da interação de pequenas moléculas com a TTR permitiu propor as bases moleculares da cooperatividade entre os sítios desta proteína e das diferenças de interação dos inibidores com a forma selvagem e mutante V30M da TTR. / More than forty human proteins are involved in human amyloid diseases, being transthyretin (TTR) one of these. TTR tetramer dissociation is a limiting step for its aggregation pathway. This step can be delayed by small molecules binding to two binding sites in the TTR tetramer interface and enhanced in TTR amyloidogenic variants. The V30M mutant is the most frequent TTR amyloidogenic variant and, eventhough the mutation is not situated in the TTR binding site, this mutation can limit small molecule interaction with the V30M mutant. Therefore, the search for wild type (TTRwt) and amyloidogenic TTR mutant inhibitors is under investigation. In the present thesis, flavonoids, frequently found in food, and synthetic thyroid hormone receptor beta-selective agonists were selected for evaluation of their inhibition ability on TTRwt and V30M mutant aggregation. The interaction of the best inhibitors with TTR was also characterized in details. For this, an in vitro TTR aggregation assay was used for inhibitor screening, and the thermodynamic signature of interaction, as well the TTR:inhibitors crystal complexes were determined by isothermal titration calorimetry and protein crystallography, respectively. The synthetic compounds, GC-1 and GC-24, displayed high efficacy, however moderated inhibition potency. The flavones luteolin (LUT), apigenin (API), chrisin (CHR), the flavanone naringenin (NAR), the flavonol kaenferol (KAE) and the isoflavone genistein (GEN) showed good potency and efficacy of TTR aggregation inhibition in vitro. The inhibitors, CHR, NAR, GEN and KAE, had lower inhibition capacity to the V30M mutant, and displayed negative cooperativity of binding to the two TTR binding sites. The inhibitor position in the binding site, as well as the chemical/ structural variability of the tested compounds seems to influence the interaction mechanism with the two TTR binding sites and the binding to the V30M mutant. Modifications on the V30M mutant binding sites were identified and pointed as the main reasons for the selectivity of some inhibitors to the wild type TTR. Overall, the detailed inspection of small molecule interaction with TTR suggests the molecular basis of the cooperativity between the two TTR binding sites and also of the differences between the inhibitors interaction with the wild type and with the V30M mutant TTR.

INTRODUÇÃO: A doença renal crônica (DRC) favorece o desenvolvimento de inúmeras complicações entre elas a amiloidose. Nos ombros os depósitos de amilóide desencadeiam reações inflamatórias e dor intensa o que compromete a qualidade de vida dos pacientes acometidos. As propostas terapêuticas para o tratamento dessa complicação são escassas. OBJETIVO: O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da estimulação elétrica nervosa transcutânea (do inglês, TENS) no tratamento da dor e capacidade funcional do ombro e dos fatores relacionados à qualidade de vida em pacientes com DRC. MÉTODOS: Trinta pacientes foram avaliados 5 vezes num período de 6 semanas. Na 1ª semana, o aparelho foi programado para não transmitir a corrente elétrica (placebo) e nas 5 semanas subseqüentes, utilizamos corrente de baixa frequência (10Hz, 150 µs, 2xdia, 40 minutos). A dor (escala visual analógica), a funcionalidade do ombro (Escore de Constant e Escala da UCLA) e os fatores relacionados à qualidade de vida (SF-36) foram avaliados. RESULTADOS: Nossos resultados mostram que o tratamento com a TENS reduziu significativamente a dor (p<0,05), melhorou a funcionalidade do ombro (tanto pelo Escore de Constant quanto Escala da UCLA; p<0,05) já na primeira semana e estes benefícios permaneceram até o final do tratamento (5 semanas) quando comparado com o período placebo. Os domínios capacidade funcional, dor, vitalidade e aspectos sociais apresentam uma melhora após 5 semanas de tratamento quando comparado com o período placebo (p<0,05). Foi verificado ainda que este efeito foi observado mesmo com a redução da quantidade de medicação analgésica. CONCLUSÃO: Nossos resultados mostram que a TENS de baixa frequência reduz a dor e melhora a funcionalidade do ombro e os fatores relacionados à qualidade de vida de pacientes com DRC. / INTRODUCTION: Chronic kidney disease (CKD) favors the development of numerous complications such as amyloidosis. In the shoulders, amyloid deposits promote inflammatory reactions and severe pain, which compromises the quality of life of patients with this disease. There are few therapeutic options for the treatment of this complication. OBJECTIVE: The objective of the present study was to evaluate the effect of transcutaneous electrical nerve stimulation (TENS) in the treatment of pain and in shoulder functional capacity, as well as factors related to the quality of life in patients with CKD. METHODS: Thirty patients were evaluated 5 times over a period of 6 weeks. At week 1, the equipment was programmed to not transmit the electrical current (placebo) and in the 5 subsequent weeks we used low frequency current (10Hz, 150 µs, twice a day, 40 minutes). Pain (visual analog scale), shoulder functional capacity (Constant score and UCLA Shoulder Rating Scale) and factors related to the quality of life (SF-36) were evaluated. RESULTS: Our results show that the treatment with TENS significantly reduced pain (p<0.05), improved shoulder functional capacity (using both Constant score and UCLA Shoulder Rating Scale; p<0.05) at week 1 and these benefits remained until the end of the treatment (5 weeks) when compared with the placebo period. The domains of functional capacity, pain, vitality and social functioning present improvement after 5 weeks of treatment when compared with the placebo period (p<0.05). It was also found that this effect was observed even after the administration of analgesics was reduced. CONCLUSION: Our results show that low frequency TENS reduces pain and improves shoulder functional capacity and factors related to the quality of life of patients with CKD.

INTRODUÇÃO: A doença renal crônica (DRC) favorece o desenvolvimento de inúmeras complicações entre elas a amiloidose. Nos ombros os depósitos de amilóide desencadeiam reações inflamatórias e dor intensa o que compromete a qualidade de vida dos pacientes acometidos. As propostas terapêuticas para o tratamento dessa complicação são escassas. OBJETIVO: O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da estimulação elétrica nervosa transcutânea (do inglês, TENS) no tratamento da dor e capacidade funcional do ombro e dos fatores relacionados à qualidade de vida em pacientes com DRC. MÉTODOS: Trinta pacientes foram avaliados 5 vezes num período de 6 semanas. Na 1ª semana, o aparelho foi programado para não transmitir a corrente elétrica (placebo) e nas 5 semanas subseqüentes, utilizamos corrente de baixa frequência (10Hz, 150 µs, 2xdia, 40 minutos). A dor (escala visual analógica), a funcionalidade do ombro (Escore de Constant e Escala da UCLA) e os fatores relacionados à qualidade de vida (SF-36) foram avaliados. RESULTADOS: Nossos resultados mostram que o tratamento com a TENS reduziu significativamente a dor (p<0,05), melhorou a funcionalidade do ombro (tanto pelo Escore de Constant quanto Escala da UCLA; p<0,05) já na primeira semana e estes benefícios permaneceram até o final do tratamento (5 semanas) quando comparado com o período placebo. Os domínios capacidade funcional, dor, vitalidade e aspectos sociais apresentam uma melhora após 5 semanas de tratamento quando comparado com o período placebo (p<0,05). Foi verificado ainda que este efeito foi observado mesmo com a redução da quantidade de medicação analgésica. CONCLUSÃO: Nossos resultados mostram que a TENS de baixa frequência reduz a dor e melhora a funcionalidade do ombro e os fatores relacionados à qualidade de vida de pacientes com DRC. / INTRODUCTION: Chronic kidney disease (CKD) favors the development of numerous complications such as amyloidosis. In the shoulders, amyloid deposits promote inflammatory reactions and severe pain, which compromises the quality of life of patients with this disease. There are few therapeutic options for the treatment of this complication. OBJECTIVE: The objective of the present study was to evaluate the effect of transcutaneous electrical nerve stimulation (TENS) in the treatment of pain and in shoulder functional capacity, as well as factors related to the quality of life in patients with CKD. METHODS: Thirty patients were evaluated 5 times over a period of 6 weeks. At week 1, the equipment was programmed to not transmit the electrical current (placebo) and in the 5 subsequent weeks we used low frequency current (10Hz, 150 µs, twice a day, 40 minutes). Pain (visual analog scale), shoulder functional capacity (Constant score and UCLA Shoulder Rating Scale) and factors related to the quality of life (SF-36) were evaluated. RESULTS: Our results show that the treatment with TENS significantly reduced pain (p<0.05), improved shoulder functional capacity (using both Constant score and UCLA Shoulder Rating Scale; p<0.05) at week 1 and these benefits remained until the end of the treatment (5 weeks) when compared with the placebo period. The domains of functional capacity, pain, vitality and social functioning present improvement after 5 weeks of treatment when compared with the placebo period (p<0.05). It was also found that this effect was observed even after the administration of analgesics was reduced. CONCLUSION: Our results show that low frequency TENS reduces pain and improves shoulder functional capacity and factors related to the quality of life of patients with CKD.