Acute myeloid leukemia (AML) the most common acute leukemia in adults is characterized by various cytogenetic and molecular abnormalities. However, the genetic etiology of the disease is not yet fully understood. MicroRNAs (miRNAs) are small single- stranded noncoding RNAs that are negative regulators of gene expression. miRNAs influence processes of proliferation, differentiation and apoptosis. Deregulation of miRNAs expression can contribute to human disease. Circulating miRNAs are emerging biomarkers in many diseases and cancers such as breast cancer, colorectal cancer and lung cancer. However, defining a plasma miRNA signature in AML that could serve as a biomarker for diagnosis has been conducted only once. We studied miRNA expression in plasma of 8 AML patients in first detection of the disease and repeatedly after achieving remission using TaqMan miRNA microarray for 750 human miRNA. The plasma expression level of 25 miRNA was down-regulated whilst that of 20 miRNA was up-regulated in the AML group at diagnosis when compared to healthy controls. The plasma expression level of 21 miRNA was down-regulated whilst that of 13 miRNA was up-regulated in the AML group in remission compared to healthy controls. Keywords acute myeloid leukemia (AML), biomarker, microRNA (miRNA), plasma, TaqMan Low...

Die Studie auf die diese Arbeit aufbaut untersuchte die Immunogenität einer Wilms-Tumorgenprodukt-1-(WT1)-Peptid-Vakzinierung bei Patienten mit einer WT1-exprimierenden akuten myeloischen Leukämie (AML) ohne weitere Behandlungsoption. Trotz dem initalen immunologischen, molekularen und vorläufigen Nachweis einer möglichen klinischen Effektivität bei AML-Patienten, konnte nur in wenigen Fällen eine längerfristige Wirksamkeit dokumentiert werden. Es ist bekannt, dass eine Krebs-Immuntherapie durch Immunevasions-Mechanismen des Tumors beeinträchtigt werden kann. Da Analysen zu Mutationen oder Verlust des WT1-Epitops oder Epitop-flankierender Sequenzen keine Auffälligkeiten zeigten, konnte eine reduzierte Präsentation oder Erkennung des Epitops ausgeschlossen werden. Aus diesem Grunde sollte diese Arbeit weitere mögliche Immunevasions-Mechanismen identifizieren. Als Grundlage wurden Tumor-assoziierte Effekte, immunmodulatorische Faktoren und funktionelle Einschränkungen der Immunzellen in den Mittelpunkt der Untersuchungen gestellt. Die ermittelten Daten zeigen, dass in unserem spezifischen Therapieansatz, der wiederholten Vakzinierung von AML-Patienten mit einem HLA-A201-restringierten WT1126–134 -Epitop in Kombination mit GM-CSF und KLH, eine eingeschränkte T-Zell-Funktionalität einen wesentlichen Grund für die beobachtete verminderte Therapieeffizienz darstellt. Immunresistenzmechanismen leukämischer Blasten spielen hierbei keine übergeordnete Rolle, individuelle Effekte können aber nicht ausgeschlossen werden. Ebenso scheint es, dass auch die Präsenz von immunregulatorischen Zellen wie Tregs oder MDSCs nicht durch die Vakzinierung manipuliert wird und dass diese keinen generellen Einfluss auf die Therapieeffizienz ausüben. / The foregoing study investigated the immunogenicity of Wilms’ tumor gene product 1 (WT1)-peptide vaccination in WT1-expressing acute myeloid leukemia (AML) patients without curative treatment option. Despite the first immunologic, molecular, and preliminary evidence of potential clinical efficacy in AML patients, only in a few cases long-lasting responses could be documented. It is known that enduring efficacy of cancer vaccines may be limited due to immune escape mechanisms. On this account, we chose to work on three front lines: Investigations of immune modulatory counter-attack-mechanisms of the tumor, functional deficiencies of the T cell compartment and the presence of immune regulatory cells. The generated data demonstrates that in our specific setting, in which AML patients received consecutive vaccinations with HLA-A201-restricted WT1126–134 epitope together with GM-CSF and KLH, impaired vaccine efficacy is mainly attributed to restricted T cell functionality. Immune resistance mechanism exerted by leukemic blasts do not generally influence clinical outcome in our setting, neither do inert immunoregulative mechanisms like Treg or MDSC, respectively.

Les cellules tueuses naturelles (NK pour Natural Killer) sont une population lymphoïde dotées d’une activité cytotoxique contre les cellules infectées ou les cellules cancéreuses. Les cellules NK ont un potentiel thérapeutique considérable en tant que thérapie cellulaire anti-tumorale, particulièrement dans le cadre des leucémies. Ces approches sont basées sur une amélioration de la production de cellules NK à partir de cellules souches hématopoïétiques (quantitative et qualitative en améliorant leur activité lytique), mais aussi sur une manipulation de la sensibilité des cellules leucémiques à la lyse par les cellules NK. L’amélioration de ces approches nécessite une compréhension plus approfondie des différents mécanismes de résistance leucémique et leur relation avec la sensibilité à la lyse. Dans ce contexte, nous avons étudié le rôle de HOXB4 dans la différenciation des cellules NK et leur fonction lytique. Nous avons montré que les cellules CD34+ différenciées en cellules NK en présence de HOXB4 ont un potentiel lytique plus important par rapport aux cellules différenciées en l’absence de HIOXB4. Cette augmentation est associée à une augmentation de la dégranulation des cellules NK en présence de cellules cibles. L’analyse transcriptionnelle globale basé sur un microréseau d'ADN montre une régulation positive de l’expression de granzyme B par HOXB4. Ces résultats démontrent que HOXB4 est un régulateur crucial dans la différenciation et la fonction des cellules NK. Ils soulignent également l’intérêt de son utilisation dans la production de cellules NK fonctionnelles dotées d’un plus grand potentiel lytique pour les stratégies d'immunothérapie anticancéreuse. Nous avons également essayé de comprendre comment l'acquisition de la résistance aux chimiothérapies par les cellules de leucémie aigüe myéloïde (LAM) influence leur reconnaissance et leur sensibilité aux cellules NK. Nous avons montré que l'acquisition de la résistance in vitro des cellules AML à la cytarabine induit une augmentation de leur susceptibilité à la cytotoxicité dépendante des cellules NK. Cette sensibilité accrue est en corrélation avec l’induction d’ULBP (UL-16 binding proteins) 1/2/3, ligands des récepteurs NKG2D, sur les cellules leucémiques résistantes. Cette induction est régulée par un mécanisme impliquant l'induction de c-Myc. Le test d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) a révélé qu’ULBP1 et ULBP3 sont des cibles directes de c-Myc. L’utilisation de cellules AML primaires résistants à la chimiothérapie comme les cellules cibles, combinée à l'inhibition de c-Myc a entraîné une diminution de l'expression des ligands NKG2D et l'altération de la lyse par les cellules NK. Les propriétés d’alloréactivité des cellules NK pourraient être utilisées pour améliorer les résultats de la transplantation de cellules souches hématopoïétiques allogéniques chez les patients atteints d’AML. Cependant, la résistance croisée (chimiothérapie et NK) des blastes AML reste un problème majeur. Nous avons étudié la relation entre résistance des cellules leucémiques à la daunorubicine, la susceptibilité de ces cellules à la lyse par les cellules NK et l'expression putative des micro-RNAs. Nos résultats indiquent que l'acquisition de la résistance à la daunorubicine par les lignées de cellules parentales induit une résistance croisée à la cytotoxicité naturelle à médiation cellulaire. L'analyse des microréseaux de microRNAs a révélé que cette résistance croisée est associée à une diminution du miR-181a et une augmentation des gènes de la famille tyrosine kinase (MAP3K10 et MAP2K1) et de la famille Bcl-2 (Bcl-2 et Mcl-1). La surexpression de miR-181a dans les blastes AML entraîne l'atténuation de leur résistance à la daunorobucine et à la lyse par les cellules NK. / Natural Killer (NK) cells are a lymphoid population with potent cytotoxic activity against virus-infected or cancer cells, and which hold considerable potential for cell based therapies targeting human malignancies. Potential approaches include not only enhancing the generation of NK cells in number and improving their lytic activity, but also manipulating the susceptibility of blast cells to NK-mediated killing. Pursuing these approaches will require a more thorough understanding of the different mechanisms of resistance and their relationship with susceptibility to NK-mediated killing. In this context, we studied the role of HOXB4 in NK cells differentiation and lytic function. We showed that HOXB4 transduced MS-5 cells as compared with GFP-transduced MS-5 cells induced highly differentiated cytotoxic NK cells. This difference was associated with an increased induction of granzyme B degranulation in response to stimulation with NK cell susceptible targets. DNA microarray-based global transcriptional profiling confirmed the upregulation of granzyme B. These findings provide further evidence that HOXB4 is a crucial regulator of NK function and that its use in generating functional NK cells with increased lytic potential may be significant for cancer immunotherapy. We attempted to elucidate how acquisition of drug resistance in AML cells influences NK cell recognition and the killing of drug-resistant blasts. We showed that the in vitro acquisition of AML cell resistance to cytarabine resulted in an increase in their susceptibility to NK-mediated cell cytotoxicity. The increased susceptibility correlates with the induction of UL-16 binding proteins (ULBP) 1/2/3 and NK group 2, member (NKG2D) ligands on target cells by a mechanism involving c-Myc induction. More importantly, chromatin immunoprecipitation assay revealed that ULBP1/3 are direct targets of c-Myc. Using drug resistant primary AML blasts as target cells, inhibition of c-Myc resulted in decreased expression of NKG2D ligands and the subsequent impairment of NK cell lysis. This study provides for the first time, the c-Myc dependent regulation of NKG2D ligands in AML. Manipulating NK-cell alloreactivity might improve outcomes after hematopoietic stem-cell transplantation; however, cross-resistance among blasts remains a drawback. We attempted to investigate the relationship between AML to daunorubicin, the susceptibility to NK cellmediated cell lysis and the putative expression of miRs. Our results indicate that the acquisition of resistance to daunorubicin by the parental cell lines resulted in the acquisition of a cross-resistance to natural cell-mediated cytotoxicity. miR microarray analysis revealed that this cross-resistance was associated with miR-181a down regulation and the subsequent regulation of the tyrosine kinase (MAP3K10 and MAP2K1) and the BCL-2 (BCL-2 andMCL-1) families. Overexpression of miR-181a in AML blasts resulted in the attenuation of their resistance to daunorobucin and to NK-cell-mediated killing.

Die „donor lymphocyte infusion“ (DLI) stellt eine wirksame Therapieoption für ein Rezidiv bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) nach allogener Stammzelltransplantation (SZT) dar. Jedoch ist die DLI oft mit einer „graft-versus-host disease” (GvHD) assoziiert, die auf einer proinflammatorischen, gegen den Empfänger gerichteten T-Zell-vermittelten Immunantwort beruht. Eine Strategie, den „graft-versus-leukemia” (GvL)-Effekt zu steigern und dabei das Risiko einer GvHD zu mindern, besteht in dem adoptiven Transfer hoch-avider CD8+ T-Zell-Klone, welche selektiv AML-assoziierte Antigene erkennen. Daher bestand das Ziel dieser Arbeit darin, eine neue Strategie zur Generierung hoch-avider CD8+ T-Zell-Klone, welche die Leukämie-assoziierten Antigene (LAAs) Wilms‘-Tumor-Antigen 1 (WT1), Proteinase 3 (PR3), Nucleophosmin 1 (NPM1) und Survivin als attraktive Ziele für spezifische Immuntherapien erkennen, zu entwickeln. Zunächst wurden mithilfe der innovativen Streptamer-Technologie die Frequenzen von CD8+ T-Zellen mit Reaktivität gegen WT1, PR3, NPM1 und Survivin im peripheren Blut von 10 gesunden HLA-A*02:01+ Spendern analysiert. Auf diese Weise konnten jedoch nur sehr geringe bis keine detektierbaren Frequenzen LAA-spezifischer CD8+ T-Lymphozyten nachgewiesen werden. Diese Beobachtungen führten zu dem Schluss, dass AML-Peptid-spezifische CD8+ T-Zellen im Gegensatz zu Virus-spezifischen T-Zellen aufgrund deutlich geringerer Frequenzen nicht direkt aus dem peripheren Blut isoliert werden können. Daher erfolgte die in vitro-Expansion der CD8+ T-Zellen mithilfe von autologen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (MoDCs). DCs sind als professionelle Antigen-präsentierende Zellen in der Lage, Effektorzellen des adaptiven Immunsystems zu stimulieren sowie deren Expansion zu induzieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein geeignetes Protokoll für die Generierung von Fast-MoDCs etabliert. Diese zeichneten sich durch die ausgeprägte Expression kostimulatorischer und Antigen-präsentierender Moleküle, die Sekretion großer Mengen des proinflammatorischen Zytokins IL-12 sowie ein effizientes stimulatorisches Potenzial gegenüber CD4+ T-Zellen aus. Erneute Frequenzanalysen nach zweimaliger in vitro-Stimulation mit Peptid-beladenen Fast-MoDCs mittels ELISpot ergaben einen Anstieg der Frequenzen AML-Peptid-spezifischer CD8+ T-Zellen, insbesondere von WT1126-spezifischen CD8+ T-Zellen. Daraufhin erfolgte die Anreicherung der stimulierten CD8+ T-Zellen mit Spezifität für die vier untersuchten LAAs WT1, PR3, NPM1 und Survivin mittels Streptamer-Technologie. Dabei erzielte die Anreicherung WT1126-spezifischer CD8+ T-Lymphozyten deutlich höhere Reinheiten als die von CD8+ T-Zellen mit Reaktivität gegen die Peptide PR1169, NPM1283,mut A/D und Survivin95. Aus diesem Grund wurden die weiteren Untersuchungen auf WT1126 als das bisher vielversprechendste der untersuchten Peptide begrenzt. CD8+ T-Zellen von drei gesunden Spendern wurden mit bestrahlten T2-Zellen und Fast-MoDCs, welche mit dem HLA-A*02:01-restringierten Peptid WT1126 beladen waren, stimuliert. Anschließend erfolgte die Anreicherung WT1126-spezifischer CD8+ T-Zellen mittels Streptamer-Technologie. Bereits nach einmaliger Stimulation kam es zu einer deutlichen Anreicherung WT1126-spezifischer CD8+ T-Zellen, welche effektiv in der Lage waren, Peptid-beladene Zielzellen zu lysieren. Jedoch konnte nach zweimaliger Stimulation nochmals eine deutliche Steigerung in Reinheit und Ausbeute erzielt werden. Die angereicherten Zellen wurden als Effektor-Gedächtnis-T-Zellen charakterisiert. Ausgehend von den Streptamer-isolierten CD8+ T-Zellen eines Spenders erfolgte die Generierung WT1126-spezifischer CD8+ T-Zell-Klone. Im Rahmen der Klonierung wurden 32 WT1126-spezifische CD8+ T-Zell-Klone generiert. Drei vielversprechende Klone wurden genauer hinsichtlich ihrer funktionellen Eigenschaften charakterisiert. Diese exprimierten hoch-avide T-Zell-Rezeptoren und zeigten einen heterogenen Phänotyp von zentralen Gedächtnis-T-Zellen hin zu terminal differenzierten Effektor-Gedächtnis-T-Zellen. Zudem führten sie zu einer effizienten Lyse der HLA-A*02:01+ und WT1+ Zelllinien T2 und SET-2. Darüber hinaus wurde demonstriert, dass die untersuchten Klone auch HLA-A*02:01- und WT1-exprimierende primäre Blasten von AML-Patienten effektiv lysieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Streptamer-basierte Anreicherung stimulierter Tumorpeptid-spezifischer CD8+ T-Zellen vor anschließender Klonierung eine geeignete Strategie für die Generierung hoch-avider CD8+ T-Zell-Klone mit anti-tumoraler Aktivität darstellt. So generierte CD8+ T-Zell-Klone mit Reaktivität gegen AML-assoziierte Antigene können für die Entwicklung neuer immuntherapeutischer Strategien zur Therapie eines Rezidivs bei AML-Patienten nach allogener SZT verwendet werden.

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Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

The subject of my thesis is the identification and subsequent comparison of legal instruments which are intended to fight against legalization of proceeds of crime, which is also referred to as money laundering, in the Czech Republic and in the Federal Republic of Germany. The first chapter is to familiarize the reader with the issue of money laundering, therefore it provides the definition of the phenomenon of money laundering and also describes the typical phases of this process. The second chapter is devoted to international institutions that deal with money laundering on the supranational level and whose activities are then reflected in international standards. The third chapter deals with legislation related to the fight against legalization of proceeds of crime in the Czech Republic. First I focus on the history of the development of the struggle against money laundering in the country and subsequently describe particular laws designed to regulate the rights and obligations relating to the effective fight against this phenomenon. Further I describe particular obligations that fall on subjects, which may be confronted with efforts to launder money within its activities, and characterize individual institutions that are involved in the fight against money laundering. The fourth chapter is...

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Acute myeloid leukemia (AML) is a malignancy of the hematopoietic system caused by somatic mutations that accumulate in hematopoietic stem and progenitor cells. The cells are thereby transformed into leukemic stem cells (LSCs), which cannot be efficiently eliminated with the standard chemotherapy treatment. Thus, LSCs pose a risk of relapse for AML patients. There- fore, identification and characterization of LSCs is a major challenge in the field of AML research. Through next generation sequencing approaches the mutational spectrum of AML cells has been established and a continuous effort is being made to resolve the order of mutation acquisition and their functional consequences. In the subgroup of AML patients that bear a mutation in Nucleophosmin 1 (NPM1 ), a mutation in DNA-methyltransferase 3 A (DNMT3A) has been often found as a co-occurring event. Evidence suggests that this mutation arises early in leukemogene- sis and marks leukemic progenitors and stem cells. However, the functional consequences of this mutation are far from being understood. In this thesis work, I set out to unravel novel functional dependencies of the DNMT3A-mutant AML cells that can be exploited for therapeutic purposes. To nominate genes that are essential for the survival of primary AML cells, I performed a func- tional RNA interference-mediated drop out screen in 38 DNMT3A- and NPM1-mutant AML patient lines. The patients in this cohort were divided into two groups, based on the treatment outcome: an early relapse (ER) group and a long term remission (LTR) group. To nominate can- didate genes in each group, I have selected 12 screens with the highest data quality and performed a differential bioinformatic analysis. The analysis yielded 7 potential candidates, from which I initially validated three: Glucocorticoid modulatory element binding protein 1 (GMEB1), Mouse double minute 4 (MDM4) – both shared between the ER and the LTR groups – and Thioredoxin domain containing protein 9 (TXNDC9 ), which scored only in the ER group. Additional rounds of validation nominated MDM4 as the strongest candidate. To investigate the role of MDM4 in LSCs, I knocked it down in three patient samples and performed the long-term culture-initiating cell assay. However, the number of progenitor colonies that formed by the end of the assay was not enough for a statistical evaluation, probably due to the low frequency of long-term culture- initiating cells in the samples. Therefore, no conclusion regarding the functional dependency of LSCs on MDM4 could be made. However, a recent study suggested that loss of MDM4 causes cell cycle arrest and induces apoptosis in leukemic cell lines and primary cells, including progenitor populations, confirming the findings of this thesis. Nevertheless, the question about the role of MDM4 in NPM1 -mutant AML cells remains open. The NPM1 involvement in the p14Arf-MDM2- p53 pathway and the deregulation of this pathway caused by the NPM1 mutation indicate that MDM4 might poses special functions in NPM1 -mutant AML. Therefore, it should be investigated if MDM4 is a particularly suitable therapeutic target in AML with NPM1 mutation.

The dilemma of money laundering is an undeniable problem faced by many institutions all over the world. Due to its prevalence, the need for organisations to deal with the problem has become a global priority, regardless of the size of the financial institutions. Despite the compliance AML efforts undertaken by various institutions, AML compliance appears to be a daunting challenge, the question posed by this research is whether there is a need for independent anti-money laundering (AML) compliance reviews, given the invasive nature of money laundering in financial institutions. Secondly, the research addresses the question of who is well positioned to perform the independent AML compliance reviews. In addressing the second question, the research will discuss why internal audit is an invaluable resource in terms of risk management processes and the reasons why they are an integral part of the AML solution. / Dissertation (MPhil)--University of Pretoria, 2013. / gm2014 / Auditing / unrestricted