Die Amnionmembran (AM) stellt aufgrund ihrer wundheilungsfördernden und narbenreduzierenden Eigenschaften ein nützliches Substrat zur erfolgreichen Behandlung kornealer Läsionen bei Mensch und Tier dar. Beim Hund kommen derzeit für diese Indikation überwiegend xenogene Transplantate zum Einsatz, über allogene Transplantate liegen nur sehr wenige Informationen vor. Um die zeitnahe Verfügbarkeit der AM zu sichern, stellt die Kryopräservation zurzeit ihre häufigste Lagerungsmöglichkeit über einen längeren Zeitraum von bis zu zwei Jahren dar. Das Ziel der vorgelegten Arbeit war die Untersuchung der morphologischen, morphometrischen und mikrobiellen Eigenschaften der kaninen Amnionmembran (KAM) zum Zeitpunkt der Gewinnung und über die Zeit der Kryopräservation bis zu 180 Tagen. Mit der hier vorliegenden Arbeit ist es gelungen die kanine Amnionmembran erstmalig, sowohl im frischen als auch im kryokonservierten Zustand, in ihren morphologischen, morphometrischen und mikrobiellen Eigenschaften zu beschreiben. Es handelt sich hierbei um ein im Gewebe, welches sowohl im frischen als auch im kryokonservierten Zustand eine maßige bis schlechte Gewebsmorphologie aufweist und dessen Dicke im Verlauf der Untersuchung tendenziell abnimmt. Da es sich hierbei um ein sehr dünnes, fragiles Gewebe handelt, sollte es besonders vorsichtig manipuliert werden. Ob der mäßige bis schlechte Zustand der kaninen Amnionmembran, sowohl im frischen als auch kryokonservierten Zustand, einen Einfluss auf das klinische Ergebnis bei der Anwendung an kornealen Defekten hat, muss durch weiterführende Studien geklärt werden.:Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis I 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Die Kornea (Hornhaut) 3 2.1.1 Histologischer Aufbau der Kornea 3 2.1.2 Physiologie der Kornea 6 2.1.3 Korneale Defekte 7 2.1.3.1 Ulzerationen 7 2.1.3.2 Andere ausgewählte korneale Erkrankungen 8 2.1.4 Therapie der ulzerativen Keratitis 9 2.1.4.1 Antibakterielle Therapie 10 2.1.4.2 Uveitisprophylaxe und Analgesie 12 2.1.4.3 Gewebsstabilisierung 12 2.1.4.4 Erhalt der kornealen Funktionalität und Transparenz 12 2.1.4.5 Gewebsunterstützung 13 2.1.4.6 Chirurgische Therapie 14 2.1.5 Die Hornhauttransplantation (Keratoplastik) 16 2.1.6 Wundheilung der Kornea 17 2.1.6.1 Epithelheilung 17 2.1.6.2 Stromale Wundheilung 18 2.1.6.3 Endothelheilung 19 2.2 Das Amnion 19 2.2.1 Anatomischer Aufbau beim Fleischfresser 20 2.2.2 Histologischer Aufbau 20 2.3 Eigenschaften der Amnionmembran 21 2.3.1 Antiinflammatorische sowie Narben reduzierende Eigenschaften 21 2.3.2 Reepithelisierung 22 2.3.3 Immunmodulatorische Effekte 23 2.3.4 Einfluss auf die Angiogenese 23 2.3.5 Antimikrobielle Eigenschaften 24 2.3.6 Analgetische Wirkung 25 2.3.7 Mechanische Eigenschaften 25 2.3.8 Permeabilität 25 2.4 Anwendung der Amnionmembran 26 2.4.1 Anwendung der Amnionmembran in der Humanmedizin 26 2.4.2 Anwendung der Amnionmembran in der Veterinärmedizin 26 2.4.3 Chirurgische Techniken zur Rekonstruktion der Korneaoberfläche 29 2.4.4 Konservierungsmethoden der AM zur kornealen Rekonstruktion 30 3 Material und Methoden 34 3.1 Gewinnung und Präparation der kaninen Amnionmembran 34 3.1.1 Gewinnung der Fruchthüllen 34 3.1.2 Ein-und Ausschlusskriterien 35 3.1.3 Isolierung der Amnionmembran 35 3.2 Kryokonservierung der kaninen Amnionmembran 36 3.2.1 Herstellung der Kryokonservierungslösung 36 3.2.2 Durchführung der Kryokonservierung und Lagerung der Proben 36 3.2.3 Definition der Untersuchungszeitpunkte 37 3.3 Histologische Probenaufarbeitung 38 3.3.1 Paraffineinbettung und Schnittpräparation 38 3.3.2 Histologische Auswertung 38 3.3.2.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.-Färbung) 38 3.3.2.2 Periodic Acid Schiff Reaktion (PAS-Reaktion) 38 3.3.2.3 Immunhistologische Färbung 43 3.4 Bakteriologische und mykologische Untersuchung 47 3.5 Statistische Auswertung 48 4 Ergebnisse 49 4.1 Histologische Ergebnisse 49 4.1.1 Dickenmessung der Amnionmembran 49 4.1.2 Beurteilung der Basalmembran des Amnions 52 4.1.3 Morphologische Beurteilung der Amnionmembran 61 4.1.4 Zusammenhang zwischen der Dicke und der Stromabeschaffenheit der Amnionmembran 70 4.2 Bakteriologische und mykologische Ergebnisse 71 5 Diskussion 73 5.1 Material und Methoden 74 5.2 Ergebnisse der Dickenmessung der AM 81 5.3 Ergebnisse der Basalmembranbeurteilung (Immunhistologische Untersuchung) 82 5.4 Ergebnisse der morphologischen Untersuchung der AM 84 5.5 Ergebnisse der bakteriologischen und mykologischen Untersuchung 89 5.6 Fazit 93 6 Zusammenfassung 96 7 Summary 98 Literaturverzeichnis 100 Anhang 119 Protokoll der immunhistologischen Färbung (Laminin) 119

In dieser Arbeit wurden Methoden entwickelt und verglichen, um aus Corneoskleralringen langzeitorgankonservierter Hornhäute und intakten, kryokonservierten Amnionmembranen Limbusepithel-Amnion-Transplantate herzustellen. Als erfolgreichste Kultivierungsmethode stellte sich hierbei signifikant die Explantat-Technik mit nach unten gerichtetem Limbusepithel heraus. Hier konnte eine Auswachsrate von 42 % erzielt werden. Es wurde weiterhin gezeigt, dass das ausgewachsene, mehrschichtige Limbusepithel proliferationsfähige TACs (Transient Amplifying Cells) enthält. Weiterhin konnten mittels Regressionsanalyse signifikante Zusammenhänge zwischen Spenderalter, Post-mortem-Zeit, Organkultur-Dauer und der Auswachsrate beschrieben werden. Kurzgefasst wurde die Vermutung bestätigt, dass jede Verlängerung der unterschiedlichen Zeiten eine Verringerung der Auswachsrate zur Folge hat. Die hergestellten Limbusepithel-Amnion-Transplantate könnten für Patienten mit Limbusstammzellinsuffizienz unterschiedlicher Genese verwendet werden.

In dieser Arbeit wurden Methoden entwickelt und verglichen, um aus Corneoskleralringen langzeitorgankonservierter Hornhäute und intakten, kryokonservierten Amnionmembranen Limbusepithel-Amnion-Transplantate herzustellen. Als erfolgreichste Kultivierungsmethode stellte sich hierbei signifikant die Explantat-Technik mit nach unten gerichtetem Limbusepithel heraus. Hier konnte eine Auswachsrate von 42 % erzielt werden. Es wurde weiterhin gezeigt, dass das ausgewachsene, mehrschichtige Limbusepithel proliferationsfähige TACs (Transient Amplifying Cells) enthält. Weiterhin konnten mittels Regressionsanalyse signifikante Zusammenhänge zwischen Spenderalter, Post-mortem-Zeit, Organkultur-Dauer und der Auswachsrate beschrieben werden. Kurzgefasst wurde die Vermutung bestätigt, dass jede Verlängerung der unterschiedlichen Zeiten eine Verringerung der Auswachsrate zur Folge hat. Die hergestellten Limbusepithel-Amnion-Transplantate könnten für Patienten mit Limbusstammzellinsuffizienz unterschiedlicher Genese verwendet werden.