As células-tronco mesenquimais (CTM) são células progenitoras indiferenciadas que apresentam altas taxas de proliferação em cultivo, capacidade de diferenciação em inúmeros tecidos e podem ser encontradas no organismo adulto e, também, em tecidos fetais, como cordão umbilical, placenta e liquido amniótico (LA). Estudos demonstraram que o LA humano obtido por amniocentese no segundo trimestre de gestação, comumente utilizado em exames de diagnóstico fetal, apresenta-se como uma fonte em potencial destas células progenitoras. Contudo, estas células necessitam de mais estudos quanto às técnicas de isolamento, expansão e, sobretudo, acerca dos protocolos de congelamento utilizados em sua criopreservação. Com isso, nos propusemos a padronizar técnicas de cultivo para as CTLA, como melhor meio de cultura e densidade de inóculo; avaliar as características biológicas como estado de indiferenciação, ciclo celular, marcadores de membrana, plasticidade e, ainda, testar dois protocolos de congelamento celular (padrão e gradual) com diferentes criopreservantes (DMSO, glicerol, trealose e sacarose) que mantivessem uma alta viabilidade e as demais características das células-tronco após períodos de 3 e 6 meses de armazenamento em nitrogênio líquido. Ao fim dos experimentos constatamos ser o líquido amniótico uma rica fonte de CTM passíveis de serem isoladas e cultivadas com meio de cultura a-MEM suplementado com 20% de SFB. Padronizamos, também, uma contagem celular inicial das amostras para otimizar o plaqueamento primário, uma densidade de inóculo ideal para as passagens posteriores (5.000 céls/cm2) e o tempo de dobramento (30 ± 4 horas) das mesmas. As CTLA expressaram genes de indiferenciação: Oct-4, Sox-2 e Nanog; apresentaram positividade para marcadores de superfície CD29, CD44, CD90 e CD105; alta taxa de proliferação in vitro e diferenciaram-se em tecido ósseo, adiposo, cartilaginoso e neuronal. Não encontramos diferenças significativas entre os dois métodos de congelamento avaliados no que diz respeito à viabilidade pós-congelamento. Todos os criopreservantes analisados mantiveram o estado de indiferenciação e plasticidade das células-tronco congeladas por 3 e 6 meses, contudo o DMSO 10% proporcionou maiores taxas de viabilidade do que os demais. As CTLA ficam desta maneira melhor caracterizadas, com protocolos de cultivo e estocagem bem estabelecidos, facilitando a produção de células-tronco funcionais em larga escala aptas a serem utilizadas em experimentos futuros / Mesenchymal stem cells (MSCs) are undifferentiated progenitor cells that have high proliferation rates in culture, ability to differentiate into various tissues and can be found in adult and fetal tissues such as umbilical cord, placenta and amniotic fluid (AF). Studies showed that human AF obtained by amniocentesis in second trimester of pregnancy, commonly used in fetal diagnostic, is a potential source of progenitor cells. However, these cells require further studies above techniques of isolation, expansion and, especially, about freezing protocols used in their cryopreservation. For then, we analyzed isolation and expansion methods to AFSC as the best culture medium and inoculum density; biological characteristics such as undifferentiated state, cell cycle, membrane markers, plasticity, and also we tested two freezing protocols (standard and graduated) with different cryoprotectors (DMSO, glycerol, trehalose and sucrose) that could be able to maintain high viability and other characteristics of stem cells after 3 and 6 months of storage in liquid nitrogen. At the end of experiments we found that amniotic fluid is a rich source of mesenchymal stem cells that can be isolated and cultured with a-MEM medium supplemented with 20% FBS. Standardized an initial cell samples counting to optimize primary plating, an ideal inoculum density for the later passages (5000 cells/cm2) and doubling time (30 ± 4 hours). AFSC expressed undifferentiated genes: Oct-4, Sox-2 and Nanog, were positive for surface markers CD29, CD44, CD90 and CD105; presented high in vitro proliferation rate and capability to differentiate into bone, adipose, cartilage and neuronal tissues. There was not statistical significance in cell viability between standard and graduated freezing protocols. All evaluated cryoprotectors maintained the basic features of amniotic fluid stem cells, as Oct-4 gene expression, surface markers and plasticity. DMSO 10% showed higher rates of viability than the others. We can conclude that AF is a rich source of MSC with great capacity for expansion and differentiation and that both methods of freezing could be used for AF cells storage. All tested cryoprotectors maintains stemness of AFSC, therefore the highest viability rate is supplied by 10% DMSO. In this way, AFSC are better characterized, with cultivation and storage protocols standardized, resulting in large scale production of functional stem cells suitable for use in future experiments

Orientador: Ibsen Bellini Coimbra / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T06:48:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bombini_MarianaFreschi_M.pdf: 1816531 bytes, checksum: 7a3edba503588d6825d034f24c884991 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A utilização de células-tronco mesenquimais (CTM) para a reconstrução da cartilagem articular é uma promissora alternativa terapêutica, devido à vulnerabilidade do tecido a lesões e processo degenerativo irreversível. O objetivo deste estudo foi investigar o potencial condrogênico de CTM de líquido amniótico humano (CTM-LA) em sistema de cultura de micromass (alta densidade celular) com TGF-?3 por 21 dias. Métodos: 53 líquido amnióticos (LA) foram obtidos de mulheres submetidas à amniocentese durante o segundo trimestre de gravidez. A indicação da amniocentese foi feita pela obstetrícia, conforme protocolo específico do serviço de medicina fetal da UNICAMP. Foram selecionadas células-tronco mesenquimais, caracterizadas por citometria de fluxo. Estas células foram expandidas para obter um número populacional para o desenvolvimento do micromass. O micromass foi realizado em placa de cultura de 96 poços com fundo em "v", em cada poço foram pipetados 10?l contendo 5x105 CTM-LA e meio para diferenciação condrogênica contendo TGF-?3. Esta condição se manteve por 21 dias, e então, o potencial condrogênico foi avaliado pela presença da proteína do colágeno II pela técnica de western blotting, também foi avaliada a expressão gênica do Sox-9, colágeno II e agrecano pela técnica da PCR em tempo real (qRT-PCR). Comparamos CTM-LA em monocamada a CTM-LA submetidas ao sistema de cultura de micromass e como controle positivo utilizamos a cartilagem adulta humana. Resultados: Confirmamos o potencial condrogênico pela diferenciação das CTM-LA em condrócitos através da expressão dos genes SOX-9, colágeno tipo II e agrecano, bem como a proteína do colágeno II. A expressão de SOX-9 em micromass foi significativamente maior do que na cartilagem adulta. Conclusão: A condrogênese foi desenvolvida a partir da combinação de uma fonte de célula tronco recém descrita proveniente do líquido amniótico humano com o sistema de cultura de micromass. Esta fonte apresentou alto potencial condrogênico e dessa forma, fortes evidências para aplicações clínicas. Os resultados são promissores e sugerem a possibilidade de investimentos em bancos de líquido amniótico / Abstract: Introduction: The use of mesenchymal stem cells (MSC) for reconstruction of articular cartilage, leads to a promising therapeutic alternative, due to the tissue vulnerability to injuries and irreversible degenerative process. The aim of this study was to investigate the chondrogenic potential of MSC from human amniotic fluid in Micromass system (high-density cell culture) with TGF-?3 for 21 days. Methodology: The amniotic fluid was obtained from 53 pregnant women. The micromass was performed using MSC that was cultured in monolayer and chondrocytes from adult human normal cartilage as control groups. After 21 days, the chondrogenic potential was determined by metabolic products released from the cell, such as SOX-9, type II collagen and aggrecan. This study was approved by the ethics committee. Results: The proteic production of type II collagen was observed by Western Blotting. The genetic expression of SOX-9 was analyzed by PCR in real time, and this was found to be significantly higher than in adult cartilage. The same procedure was used to determinate the genetic expression of aggrecan and type II collagen, verifying positive result for both. Conclusion: Chondrogenesis was developed from the unique combination of the newly discovered source of mesenchymal stem cells from human amniotic fluid with micromass, and it demonstrated a satisfactory expression. Thus, this source is extremely viable for clinical applications, and the results suggest the possibility of investments in human amniotic fluid banks / Mestrado / Clinica Medica / Mestra em Clínica Médica

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INTRODUÇÃO: O fenótipo de resistência a drogas é caracterizado pela superexpressão das proteínas da família ABC (ATP-Binding Cassette). A Pglicoproteína (P-gp), codificada pelo gene ABCB1, é uma das bombas de efluxo mais estudadas, como agente interferente no tratamento de diversos tipos de câncer, seguida pela proteína MRP1 (Multidrug Resistance-related Protein 1), transcrita pelo gene ABCC1. Estudos recentes relacionaram a atuação da proteína LRP (Lung Resistance Protein) a estas bombas, devido sua alta expressão em tumores com fenótipo resistente. Em contrapartida, estes transportadores também exercem funções fisiológicas contra metabólitos, compostos citotóxicos e teratogênicos, em diversos tecidos normais como rins, fígado, intestino e célulastronco. As proteínas ABC são consideradas marcadores específicos das célulastronco hematopoiéticas, porém, ainda são pouco descritas nas células-tronco mesenquimais (CTM). A medula óssea (MO) é a fonte mais bem descrita de CTM adultas, cujas propriedades são conhecidas e utilizadas na aplicação clínica. Entretanto, recentemente células-tronco de origem fetal têm criado expectativas e o líquido amniótico (LA) apontado como fonte promissora deste tipo celular, que por sua vez, é pouco estudada acerca da atuação das bombas ABC. Sendo assim, o presente estudo visou caracterizar a expressão da P-gp, MRP1 e LRP em célulastronco mesenquimais humanas do líquido amniótico e medula óssea. MÉTODOS: Foram isoladas CTM de amostras do LA e MO, caracterizadas através de citometria de fluxo, ensaios de diferenciação em tecidos mesenquimais in vitro e expressão dos genes de indiferenciação Oct-4 e Nanog por RT-PCR. Verificou-se também a presença da P-gp através da técnica de imunocitoquímica e a sua resistência frente a diferentes concentrações de doxorrubicina (DOX) através do ensaio de MTT, foram utilizadas como controles as células MES-SA e MES-DX (sarcoma uterino respectivamente sensível e sua variante resistente à DOX). Para avaliar o funcionamento da P-gp, foi feito ensaio de exclusão do corante Rhodamina 123 (Rh 123) por meio de citometria de fluxo, com ou sem bloqueio da P-gp utilizando verapamil. E por fim, foi verificada a expressão dos genes ABCB1/ABCC1/LRP por meio de PCR em tempo real, nas amostras pré e pós-diferenciações adipogênica, osteogênica e condrogênica. RESULTADOS: As CTM, tanto da MO quanto do LA, exibiram respostas semelhantes às células resistentes MES-DX e expressam a Pgp de forma homogênea nas suas populações. O ensaio de exclusão da Rh 123 demonstrou dinâmicas de efluxo do corante semelhantes entre as células-tronco do LA e as MES-DX, com e sem a presença de verapamil. No entanto, as células da MO apresentaram efluxo crescente e não responderam ao bloqueador verapamil como as outras linhagens. A distribuição da expressão gênica, o ABCB1 se mostrou menor que a do LRP nas amostras de LA indiferenciadas. No entanto a expressão do ABCB1 nas amostras de LA foi maior em comparação às amostras de MO indiferenciadas. Não houve seignificância estatística na comparação da expressão gênica antes e depois das diferenciações adipogênica e osteogênica. CONCLUSÃO: As CTM são resistentes ao quimioterápico doxorrubicina, mas, possuem baixa expressão do ABCB1. Portanto, as CTM podem possuir outro mecanismo, como a MRP1 e LRP, atuando no mecanismo de resistência à DOX, além da P-gp / BACKGROUND: The drug resistance phenotype is characterized by ABC (ATPBinding Cassette) family proteins overexpression. The P-glycoprotein (P-gp) codified by ABCB1 gene is one of the most studied efflux pumps such as interfering agent in cancer treatment followed by MRP1 (Multidrug Resistance-related protein 1) transcribed by ABCC1 gene. Recent studies have linked the LRP (Lung Resistance Protein) to these pumps activities because of its high expression in resistant cancers. Though these transporters also have physiological functions against metabolites, cytotoxic and teratogenic compounds in normal tissues as kidneys, liver, intestine and stem cells. ABC proteins are considered hematopoietic stem cells specific markers but are poorly described in mesenchymal stem cells (MSC). Bone marrow (BM) is the best characterized adult MSC source its properties are well known and used in clinical application. However recently fetal stem cells has raised expectations and amniotic fluid (AF) is a promising source of this cell type which in turn is scarce regarding about presence and activity of the ABC pumps. The aim of this study was characterize the P-gp, MRP1 and LRP expression in human mesenchymal stem cells from amniotic fluid and bone marrow. METHODS: Mesenchymal stem cells were isolated from AF and BM and characterized by flow cytometry, in vitro mesenchymal differentiation assays, Oct-4 and Nanog genes expression by RT-PCR. The P-gp presence were found over immunocytochemical technique and its activity against different concentrations of doxorubicin (DOX) by MTT assay which were used as control cells MES-DX and MES-SA (uterine sarcoma respectively resistant and susceptible to DOX). The P-gp was evaluated in Rhodamine 123 (Rh 123) dye exclusion through flow cytometry with or without blocking P-gp from verapamil. Finally was observed ABCB1/ABCC1/LRP genes expression by real time PCR after and before adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation. RESULTS: BM and AF MSC showed the same response of the DOX resistant cells MES-DX and express P-gp homogeneously though their populations. The Rh 123 dye exclusion assay demonstrated that the AF stem cells efflux dynamics are similar to the MES-DX with and without the presence of verapamil. However BM MSC showed crescent efflux and no response to verapamil as the other cells. The ABCB1 gene was less expressed than LRP in undifferentiated AF MSC. No difference was found in gene expression before osteogenic and adipogenic differentiation. CONCLUSION: MSC have low expression of ABCB1 although are resistant to doxorubicin so other mechanisms such as MRP1 or LRP may be acting to these cells defense in addition to P-gp

O objetivo desse estudo foi determinar os valores do volume do líquido amniótico e do embrião, pela ultra-sonografia bidimensional e tridimensional em gestantes normais da 8ª a 11ª semana de gestação. Realizamos estudo prospectivo longitudinal em 25 fetos normais. Os critérios de inclusão foram gestações únicas, avaliação clínica e laboratorial normal e os de exclusão, gestantes portadoras de patologias maternas e/ou próprias da gestação, como também as usuárias de fumo, álcool ou drogas. Todas as pacientes assinaram o termo de consentimento esclarecido pós-informado. Os exames foram realizados por dois observadores que utilizaram aparelho ultra-songráfico modelo SA-9900 (MEDISON), transdutor endovaginal volumétrico, banda larga, de 5- 6,5 MHz, com 120 0 de campo visual. Cada gestante foi avaliadana 8ª, 9ª, 10ª e 11ª semana de gestação. O estudo bidimensional consistiu da determinação das medidas volumétricas por cálculo matemático baseado na forma do elipsóide, averiguando-se o volume do saco amniótico total e do embrião. No estudo tridimensional o volume do líquido amniótico foi feito pela técnica VOCAL. Em ambos o volume do líquido amniótico foi obtido da subtração da medida do volume do saco amniótico pela medida volumétrica do embrião. Os dados foram analisados pela análise de variância (ANOVA), correlação e análise de regressão. Em todas as análises foi utilizado como nível de significância p< 0,05. O volume do líquido amniótico (V LA ) pela ultra-sonografia bidimensional aumentou de 5,45 cm3 para 39,52 cm 3 da 8ª para a 11ª semana (ANOVA - p< 0,05). A correlação entre a idade gestacional e o volume do líquido amniótico foi forte e positiva (p< 0,001,r 2 = 88,3%). No estudo tridimensional o volume do líquido amniótico aumentou de 5,75 cm 3 para 42,96 cm 3 da 8ª para a 11 semana (ANOVA - p< 0,05). A correlação entre a idade gestacional e o volume do líquido amniótico foi forte e positiva (p< 0,001,r 2 = 98,1%). Concluindo, o volume do líquido amniótico e do embrião aumenta progressivamente da 8ª para a 11ª semana de gestação tanto na avaliação bidimensional como natridimensional. A estimativa do volume do líquido amniótico na ultra-sonografia tridimensional é menor que a bidimensional na 9ª e 10ª semana gestacional e maior na 11ª semana de gestação. O volume do embrião é maior pela técnica tridimensional do que pela bidimensional em todas as semanas gestacionais avaliadas. / The objective of this study was to determine amniotic fluid and embryo volumes by two-dimensional and three-dimensional ultrasonography in normal pregnant women from the 8th to the 11th week of gestation. We made a prospective longitudinal study on 25 normal fetuses. Inclusion criteria were singleton fetuses and normal clinical and laboratoryevaluation, and exclusion criteria were pregnant women withmaternal diseases and/or diseases typical of pregnancy, smokers, and alcohol or drug users. All patients signed an informed consent form. The tests were performed by two observers using an ultrasonography apparatus model SA-9900 (MEDISON), a volumetric endovaginal transducer, a 5-6.5 Hz broad band and 120 o of visual field. Each pregnant woman was evaluated in the8 th ,9 th , 10 th and 11 th week of gestation. The two-dimensional study consisted of the determination of volumetric measurements by a mathematical calculation based on the ellipsoid shape, with determination of total amniotic sac volume and embryo volume. In the three-dimensional study the amniotic fluid volume was determined by the VOCAL technique. In both methods, the amniotic fluid volume was obtained by subtracting the volumetric measurement of the embryo from the measurement of the amniotic sac volume. Data were analyzed statistically by analysis of variance (ANOVA), by correlation and by regression analysis, with the level of significance set at p< 0.05 in all analyses. The amniotic fluid volume (V AF ) determined by two-dimensional ultrasonography increased from 5.45 to 39.52 cm 3 from the8 th to the 11 th week (ANOVA - p< 0.05). There was a strongpositive correlation between gestational age andVAF (p< 0.001,r 2 = 88.3%). In the three-dimensional study,VAF increased from 5.75 to 42.96 cm 3 from the8 th to the 11 th week (ANOVA - p< 0.05). The correlation between gestational age andVAF was strong and positive (p< 0.001,r 2 = 98.1%). In conclusion, the volume of the amniotic fluid and of the embryo increased progressively from the 8th to the 11th week of gestation both when evaluated by two-dimensional and three-dimensional ultrasonography. The estimate ofVAF obtained by three-dimensional ultrasonography was lower than that obtained by two-dimensional ultrasonography in the 9th and 10th week of gestation and higher in the 11th week of gestation. The embryo volume obtained by the three-dimensional technique was larger than that obtained by the two-dimensional technique in all gestational weeks evaluated.

Células tronco mesenquimais (CTm) apresentam potencial para tratamento da doença renal pela possibilidade de promover regeneração tecidual e recuperação funcional, possivelmente por seus efeitos parácrinos. Na última década, o líquido amniótico foi descrito como uma fonte promissora de extração e isolamento de CTm. Alguns estudos mostraram o efeito renoprotetor das CTm derivadas do líquido amniótico (CTmLA) na doença renal aguda e crônica, quando inoculadas precocemente. Entretanto, ainda não foi estudado o efeito da administração de CTmLA em modelo experimental de doença renal crônica (DRC) com a lesão já estabelecida, situação esta que reproduz melhor a apresentação clínica da doença nos pacientes. Assim, o objetivo do presente estudo foi analisar o efeito da inoculação de CTmLA na região subcapsular renal no modelo de DRC já estabelecido. As CTmLA foram obtidas de pacientes no segundo trimestre de gestação e isoladas através da sua capacidade de aderência ao plástico. A caracterização das CTm foi feita por citometria de fluxo e pela diferenciação celular in vitro. O modelo de DRC utilizado foi o de nefrectomia 5/6 (Nx) que, pela perda de massa renal, evolui com hipertensão arterial, proteinúria, glomeruloesclerose, fibrose intersticial e perda progressiva da função renal. Quinze dias após a indução do modelo, estas alterações já são marcantes e agravam-se com 30 dias. Foram realizados 2 protocolos experimentais: no protocolo I, os animais Nx com DRC estabelecida receberam dose única de CTmLA (5x105) na região subcapsular renal e foram acompanhados por 30 e 60 dias de experimento. No protocolo II, os animais Nx com DRC estabelecida receberam duas doses de CTmLA (5x105) na região subcapsular renal, no 15° e 30° dia após a nefrectomia 5/6, e foram acompanhados por 30 dias, totalizando 60 dias de experimento. Os animais foram subdivididos nos grupos: Sham, ratos submetidos à cirurgia fictícia; Sham+CTmLA, ratos submetidos à Sham que receberam CTmLA; Nx, ratos submetidos à nefrectomia 5/6; Nx+CTmLA, ratos Nx que receberam CTmLA. Para verificar a localização das CTmLA no tecido renal foi realizada a hibridização in situ para cromossomo XY. Foram realizadas análises dos parâmetros clínicos e laboratoriais, além de análise histológica, imunohistoquímica, PCR em tempo real e multiplex. Resultados: as CTmLA cultivadas mostraram grande capacidade de aderência, crescimento em colônia e de diferenciação em células osteogênicas, adipogênicas e condrogênicas. A análise por citometria mostrou-se positiva para CD29, CD44, CD90 e CD105, com uma pequena população de células de CD14, CD34, CD45 e CD117, confirmando a presença preponderante de CTm. Protocolo I: Após 30 dias, a inoculação de CTmLA, dose única, preveniu a elevação da pressão arterial, da proteinúria, da glomeruloesclerose, recuperando a expressão dos marcadores de podócitos, WT-1 e sinaptopodina. Entretanto, não houve efeito benéfico nos níveis de creatinina sérica e na fibrose intersticial, após 30 e 60 dias. O tratamento com CTmLA promoveu uma diminuição marcante do número de macrófagos e uma discreta queda dos leucócitos no infiltrado inflamatório renal, além da diminuição do número de miofibroblastos no interstício renal. Citocinas pró-inflamatórias foram encontradas em menor concentração no tecido renal dos animais que receberam CTmLA (IL-1beta, TNF-alfa, MCP-1 e RANTES). Não houve alteração significativa das citocinas Th1 e Th2, exceto por um aumento da IL-4 nos animais tratados com CTmLA. Os animais que foram acompanhados por 60 dias tiveram uma melhora da proteinúria, da glomeruloesclerose, diminuição do infiltrado de macrófagos e uma melhora da expressão de WT-1. Não foram observadas diferenças estatísticas nos parâmetros de creatinina sérica e fibrose intersticial, aos 30 e 60 dias. Protocolo II: Nos animais que receberam a segunda dose de CTmLA e foram acompanhados por 60 dias observou-se prevenção da elevação da pressão arterial e da proteinúria, além de uma marcante diminuição da fibrose intersticial. Em conclusão, o presente estudo mostrou, pela primeira vez, que a terapia com CTmLA foi capaz de induzir renoproteção nos animais com doença renal crônica estabelecida. O tratamento com CTmLA pode representar uma nova abordagem terapêutica bloqueando a progressão da doença renal crônica / Mesenchymal stem cells (mSC) represent therapeutic potential for the treatment of renal diseases, due to their ability to induce tissue regeneration and functional recovery. Human amniotic fluid stem cells (AFmSC) are a class of fetal, pluripotent stem cells, which present characteristics intermediate between embryonic and adult stem cells. These cells are characterized by the expression of mesenchymal stem cells markers. In addition, they have the ability to differentiate into lineages of all embryonic germ layers. They also show high proliferative rates, but do not induce tumor formation. Therefore, AFmSC are considered to be a very promising cell source and these characteristics have generated a great interest concerning their potential renoprotective effects. The aim of this study was to analyze the effects of AFmSC in an experimental model of chronic kidney disease, the 5/6 nephrectomy model (Nx), after the disease has been established, in order to more closely resemble the clinical settings in humans. AFmSC derived from second-trimester amniocentesis were isolated by plastic adhesion. After 4-7 passages, AFmSC characteristics were confirmed by flow cytometry and by their ability to differentiate into osteogenic, adipogenic and chondrogenic lineages. Two experimental protocols were performed: In protocol I, rats underwent 5/6 nephrectomy (Nx) or sham surgery at day 0, received at day 15 a single dose of hAFmSC (5x105 cells) injected under the renal capsule and were studied at day 30 and 60 days. In protocol II, rats underwent Nx or sham surgery, and received at days 15 and 30, two doses of hAFmSC (5x105 cells) injected under the renal capsule, and were studied at day 60. In both protocols, the animals were subdivided into four groups: Sham, rats submitted to fictitious surgery; Sham+hAFmSC, Sham rats that received hAFmSC; Nx, rats submitted to nephrectomy 5/6; Nx+hAFmSC, Nx rats receiving hAFmSC. The hAFmSC were followed in the renal tissue by in situ hybridization for XY chromosome. In all the groups, clinical and histological parameters were analyzed by immunohistochemistry and real-time PCR. Results: AFmSC cultivated demonstrated an ability to adhere to plastic, to grow in colonies and to differentiate in osteogenic, adipogenic and chondrogenic cells. Quantitative analysis of cell markers by flow cytometry showed that isolated cells were positive for CD29, CD44, CD90 and CD105, with a small population of cells positive for CD14, CD34, CD45 and CD117, confirming a preponderant presence of mSC. Protocol I: After 30 days, the single dose of hAFmSC significantly reduced the blood pressure levels, proteinuria, glomerulosclerosis and improved the expression of podocytes markers, WT-1 and synaptopodin. A marked decrease on the number of macrophages and a discrete decrease of leucocyte infiltration, as well as a reduction of interstitial myofibroblasts was observed. Treatment with hAFmSC significantly reduced some proinflammatory cytokines (IL1beta, TNF-alpha, MCP-1 and RANTES). No significant difference in Th1 or Th2 cytokines was observed, except for IL-4 increase in Nx rats treated with hAFmSC. At 60 days of follow-up, Nx rats treated with hAFmSC presented reduced proteinuria, glomerulosclerosis and macrophages besides increase in WT-1 expression. No improvements were observed on serum creatinine and of interstitial fibrosis, after 30 and 60 days. Protocol II: Inoculation of two doses of hAFmSC in Nx rats improved blood pressure levels, proteinuria and interstitial fibrosis at day 60. In conclusion, the present study demonstrated, for the first time, that hAFmSC induced renoprotection in animals with established chronic kidney disease. Treatment with hAFmSC may represent a novel therapeutic approach for blocking the progression of chronic kidney disease

O objetivo desse estudo foi determinar os valores do volume do líquido amniótico e do embrião, pela ultra-sonografia bidimensional e tridimensional em gestantes normais da 8ª a 11ª semana de gestação. Realizamos estudo prospectivo longitudinal em 25 fetos normais. Os critérios de inclusão foram gestações únicas, avaliação clínica e laboratorial normal e os de exclusão, gestantes portadoras de patologias maternas e/ou próprias da gestação, como também as usuárias de fumo, álcool ou drogas. Todas as pacientes assinaram o termo de consentimento esclarecido pós-informado. Os exames foram realizados por dois observadores que utilizaram aparelho ultra-songráfico modelo SA-9900 (MEDISON), transdutor endovaginal volumétrico, banda larga, de 5- 6,5 MHz, com 120 0 de campo visual. Cada gestante foi avaliadana 8ª, 9ª, 10ª e 11ª semana de gestação. O estudo bidimensional consistiu da determinação das medidas volumétricas por cálculo matemático baseado na forma do elipsóide, averiguando-se o volume do saco amniótico total e do embrião. No estudo tridimensional o volume do líquido amniótico foi feito pela técnica VOCAL. Em ambos o volume do líquido amniótico foi obtido da subtração da medida do volume do saco amniótico pela medida volumétrica do embrião. Os dados foram analisados pela análise de variância (ANOVA), correlação e análise de regressão. Em todas as análises foi utilizado como nível de significância p< 0,05. O volume do líquido amniótico (V LA ) pela ultra-sonografia bidimensional aumentou de 5,45 cm3 para 39,52 cm 3 da 8ª para a 11ª semana (ANOVA - p< 0,05). A correlação entre a idade gestacional e o volume do líquido amniótico foi forte e positiva (p< 0,001,r 2 = 88,3%). No estudo tridimensional o volume do líquido amniótico aumentou de 5,75 cm 3 para 42,96 cm 3 da 8ª para a 11 semana (ANOVA - p< 0,05). A correlação entre a idade gestacional e o volume do líquido amniótico foi forte e positiva (p< 0,001,r 2 = 98,1%). Concluindo, o volume do líquido amniótico e do embrião aumenta progressivamente da 8ª para a 11ª semana de gestação tanto na avaliação bidimensional como natridimensional. A estimativa do volume do líquido amniótico na ultra-sonografia tridimensional é menor que a bidimensional na 9ª e 10ª semana gestacional e maior na 11ª semana de gestação. O volume do embrião é maior pela técnica tridimensional do que pela bidimensional em todas as semanas gestacionais avaliadas. / The objective of this study was to determine amniotic fluid and embryo volumes by two-dimensional and three-dimensional ultrasonography in normal pregnant women from the 8th to the 11th week of gestation. We made a prospective longitudinal study on 25 normal fetuses. Inclusion criteria were singleton fetuses and normal clinical and laboratoryevaluation, and exclusion criteria were pregnant women withmaternal diseases and/or diseases typical of pregnancy, smokers, and alcohol or drug users. All patients signed an informed consent form. The tests were performed by two observers using an ultrasonography apparatus model SA-9900 (MEDISON), a volumetric endovaginal transducer, a 5-6.5 Hz broad band and 120 o of visual field. Each pregnant woman was evaluated in the8 th ,9 th , 10 th and 11 th week of gestation. The two-dimensional study consisted of the determination of volumetric measurements by a mathematical calculation based on the ellipsoid shape, with determination of total amniotic sac volume and embryo volume. In the three-dimensional study the amniotic fluid volume was determined by the VOCAL technique. In both methods, the amniotic fluid volume was obtained by subtracting the volumetric measurement of the embryo from the measurement of the amniotic sac volume. Data were analyzed statistically by analysis of variance (ANOVA), by correlation and by regression analysis, with the level of significance set at p< 0.05 in all analyses. The amniotic fluid volume (V AF ) determined by two-dimensional ultrasonography increased from 5.45 to 39.52 cm 3 from the8 th to the 11 th week (ANOVA - p< 0.05). There was a strongpositive correlation between gestational age andVAF (p< 0.001,r 2 = 88.3%). In the three-dimensional study,VAF increased from 5.75 to 42.96 cm 3 from the8 th to the 11 th week (ANOVA - p< 0.05). The correlation between gestational age andVAF was strong and positive (p< 0.001,r 2 = 98.1%). In conclusion, the volume of the amniotic fluid and of the embryo increased progressively from the 8th to the 11th week of gestation both when evaluated by two-dimensional and three-dimensional ultrasonography. The estimate ofVAF obtained by three-dimensional ultrasonography was lower than that obtained by two-dimensional ultrasonography in the 9th and 10th week of gestation and higher in the 11th week of gestation. The embryo volume obtained by the three-dimensional technique was larger than that obtained by the two-dimensional technique in all gestational weeks evaluated.

Stem cell synthesized extracellular matrix (ECM) may serve as a replacement for current bone grafting techniques. The overall goal of this thesis is to quantify the osteoinductivity of the ECM produced by human amniotic fluid stem cells (AFS cells), compare it to that of human mesenchymal stem cells (MSC), and assess its potential for use in bone tissue engineering therapies. Each stem cell type was cultured in osteogenic media to produce the ECM, which was then decellularized via freeze/thaw cycling and DNase treatment. The success of the decellularization was confirmed with live/dead staining and DNA quantification. A series of in vitro studies were performed to evaluate the characteristics of the ECM relevant to a bone tissue engineering therapy. Reseeded MSCs were able to attach to and proliferate on both ECM types in both 2D and 3D culture. In 2D, cells cultured on both ECM types showed increased levels of calcium deposition. Additionally, cells cultured on the MSC ECM showed increased alkaline phosphatase activity. A synergistic effect on osteogenic differentiation was observed when the osteoinductive factor dexamethasone was added to the culture. In 3D, both ECM types increased the mineralized matrix production of reseeded MSCs. The AFS ECM had a greater effect than the MSC ECM. When ECM was used to treat a rat femoral segmental defect in vivo, it was found that each ECM type increased the rate of bridging of the defect when compared to collagen coated scaffolds. However the ECM did not have a significant effect on the volume of mineralized matrix within the defect site in this study.

INTRODUÇÃO: O fenótipo de resistência a drogas é caracterizado pela superexpressão das proteínas da família ABC (ATP-Binding Cassette). A Pglicoproteína (P-gp), codificada pelo gene ABCB1, é uma das bombas de efluxo mais estudadas, como agente interferente no tratamento de diversos tipos de câncer, seguida pela proteína MRP1 (Multidrug Resistance-related Protein 1), transcrita pelo gene ABCC1. Estudos recentes relacionaram a atuação da proteína LRP (Lung Resistance Protein) a estas bombas, devido sua alta expressão em tumores com fenótipo resistente. Em contrapartida, estes transportadores também exercem funções fisiológicas contra metabólitos, compostos citotóxicos e teratogênicos, em diversos tecidos normais como rins, fígado, intestino e célulastronco. As proteínas ABC são consideradas marcadores específicos das célulastronco hematopoiéticas, porém, ainda são pouco descritas nas células-tronco mesenquimais (CTM). A medula óssea (MO) é a fonte mais bem descrita de CTM adultas, cujas propriedades são conhecidas e utilizadas na aplicação clínica. Entretanto, recentemente células-tronco de origem fetal têm criado expectativas e o líquido amniótico (LA) apontado como fonte promissora deste tipo celular, que por sua vez, é pouco estudada acerca da atuação das bombas ABC. Sendo assim, o presente estudo visou caracterizar a expressão da P-gp, MRP1 e LRP em célulastronco mesenquimais humanas do líquido amniótico e medula óssea. MÉTODOS: Foram isoladas CTM de amostras do LA e MO, caracterizadas através de citometria de fluxo, ensaios de diferenciação em tecidos mesenquimais in vitro e expressão dos genes de indiferenciação Oct-4 e Nanog por RT-PCR. Verificou-se também a presença da P-gp através da técnica de imunocitoquímica e a sua resistência frente a diferentes concentrações de doxorrubicina (DOX) através do ensaio de MTT, foram utilizadas como controles as células MES-SA e MES-DX (sarcoma uterino respectivamente sensível e sua variante resistente à DOX). Para avaliar o funcionamento da P-gp, foi feito ensaio de exclusão do corante Rhodamina 123 (Rh 123) por meio de citometria de fluxo, com ou sem bloqueio da P-gp utilizando verapamil. E por fim, foi verificada a expressão dos genes ABCB1/ABCC1/LRP por meio de PCR em tempo real, nas amostras pré e pós-diferenciações adipogênica, osteogênica e condrogênica. RESULTADOS: As CTM, tanto da MO quanto do LA, exibiram respostas semelhantes às células resistentes MES-DX e expressam a Pgp de forma homogênea nas suas populações. O ensaio de exclusão da Rh 123 demonstrou dinâmicas de efluxo do corante semelhantes entre as células-tronco do LA e as MES-DX, com e sem a presença de verapamil. No entanto, as células da MO apresentaram efluxo crescente e não responderam ao bloqueador verapamil como as outras linhagens. A distribuição da expressão gênica, o ABCB1 se mostrou menor que a do LRP nas amostras de LA indiferenciadas. No entanto a expressão do ABCB1 nas amostras de LA foi maior em comparação às amostras de MO indiferenciadas. Não houve seignificância estatística na comparação da expressão gênica antes e depois das diferenciações adipogênica e osteogênica. CONCLUSÃO: As CTM são resistentes ao quimioterápico doxorrubicina, mas, possuem baixa expressão do ABCB1. Portanto, as CTM podem possuir outro mecanismo, como a MRP1 e LRP, atuando no mecanismo de resistência à DOX, além da P-gp / BACKGROUND: The drug resistance phenotype is characterized by ABC (ATPBinding Cassette) family proteins overexpression. The P-glycoprotein (P-gp) codified by ABCB1 gene is one of the most studied efflux pumps such as interfering agent in cancer treatment followed by MRP1 (Multidrug Resistance-related protein 1) transcribed by ABCC1 gene. Recent studies have linked the LRP (Lung Resistance Protein) to these pumps activities because of its high expression in resistant cancers. Though these transporters also have physiological functions against metabolites, cytotoxic and teratogenic compounds in normal tissues as kidneys, liver, intestine and stem cells. ABC proteins are considered hematopoietic stem cells specific markers but are poorly described in mesenchymal stem cells (MSC). Bone marrow (BM) is the best characterized adult MSC source its properties are well known and used in clinical application. However recently fetal stem cells has raised expectations and amniotic fluid (AF) is a promising source of this cell type which in turn is scarce regarding about presence and activity of the ABC pumps. The aim of this study was characterize the P-gp, MRP1 and LRP expression in human mesenchymal stem cells from amniotic fluid and bone marrow. METHODS: Mesenchymal stem cells were isolated from AF and BM and characterized by flow cytometry, in vitro mesenchymal differentiation assays, Oct-4 and Nanog genes expression by RT-PCR. The P-gp presence were found over immunocytochemical technique and its activity against different concentrations of doxorubicin (DOX) by MTT assay which were used as control cells MES-DX and MES-SA (uterine sarcoma respectively resistant and susceptible to DOX). The P-gp was evaluated in Rhodamine 123 (Rh 123) dye exclusion through flow cytometry with or without blocking P-gp from verapamil. Finally was observed ABCB1/ABCC1/LRP genes expression by real time PCR after and before adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation. RESULTS: BM and AF MSC showed the same response of the DOX resistant cells MES-DX and express P-gp homogeneously though their populations. The Rh 123 dye exclusion assay demonstrated that the AF stem cells efflux dynamics are similar to the MES-DX with and without the presence of verapamil. However BM MSC showed crescent efflux and no response to verapamil as the other cells. The ABCB1 gene was less expressed than LRP in undifferentiated AF MSC. No difference was found in gene expression before osteogenic and adipogenic differentiation. CONCLUSION: MSC have low expression of ABCB1 although are resistant to doxorubicin so other mechanisms such as MRP1 or LRP may be acting to these cells defense in addition to P-gp

Células tronco mesenquimais (CTm) apresentam potencial para tratamento da doença renal pela possibilidade de promover regeneração tecidual e recuperação funcional, possivelmente por seus efeitos parácrinos. Na última década, o líquido amniótico foi descrito como uma fonte promissora de extração e isolamento de CTm. Alguns estudos mostraram o efeito renoprotetor das CTm derivadas do líquido amniótico (CTmLA) na doença renal aguda e crônica, quando inoculadas precocemente. Entretanto, ainda não foi estudado o efeito da administração de CTmLA em modelo experimental de doença renal crônica (DRC) com a lesão já estabelecida, situação esta que reproduz melhor a apresentação clínica da doença nos pacientes. Assim, o objetivo do presente estudo foi analisar o efeito da inoculação de CTmLA na região subcapsular renal no modelo de DRC já estabelecido. As CTmLA foram obtidas de pacientes no segundo trimestre de gestação e isoladas através da sua capacidade de aderência ao plástico. A caracterização das CTm foi feita por citometria de fluxo e pela diferenciação celular in vitro. O modelo de DRC utilizado foi o de nefrectomia 5/6 (Nx) que, pela perda de massa renal, evolui com hipertensão arterial, proteinúria, glomeruloesclerose, fibrose intersticial e perda progressiva da função renal. Quinze dias após a indução do modelo, estas alterações já são marcantes e agravam-se com 30 dias. Foram realizados 2 protocolos experimentais: no protocolo I, os animais Nx com DRC estabelecida receberam dose única de CTmLA (5x105) na região subcapsular renal e foram acompanhados por 30 e 60 dias de experimento. No protocolo II, os animais Nx com DRC estabelecida receberam duas doses de CTmLA (5x105) na região subcapsular renal, no 15° e 30° dia após a nefrectomia 5/6, e foram acompanhados por 30 dias, totalizando 60 dias de experimento. Os animais foram subdivididos nos grupos: Sham, ratos submetidos à cirurgia fictícia; Sham+CTmLA, ratos submetidos à Sham que receberam CTmLA; Nx, ratos submetidos à nefrectomia 5/6; Nx+CTmLA, ratos Nx que receberam CTmLA. Para verificar a localização das CTmLA no tecido renal foi realizada a hibridização in situ para cromossomo XY. Foram realizadas análises dos parâmetros clínicos e laboratoriais, além de análise histológica, imunohistoquímica, PCR em tempo real e multiplex. Resultados: as CTmLA cultivadas mostraram grande capacidade de aderência, crescimento em colônia e de diferenciação em células osteogênicas, adipogênicas e condrogênicas. A análise por citometria mostrou-se positiva para CD29, CD44, CD90 e CD105, com uma pequena população de células de CD14, CD34, CD45 e CD117, confirmando a presença preponderante de CTm. Protocolo I: Após 30 dias, a inoculação de CTmLA, dose única, preveniu a elevação da pressão arterial, da proteinúria, da glomeruloesclerose, recuperando a expressão dos marcadores de podócitos, WT-1 e sinaptopodina. Entretanto, não houve efeito benéfico nos níveis de creatinina sérica e na fibrose intersticial, após 30 e 60 dias. O tratamento com CTmLA promoveu uma diminuição marcante do número de macrófagos e uma discreta queda dos leucócitos no infiltrado inflamatório renal, além da diminuição do número de miofibroblastos no interstício renal. Citocinas pró-inflamatórias foram encontradas em menor concentração no tecido renal dos animais que receberam CTmLA (IL-1beta, TNF-alfa, MCP-1 e RANTES). Não houve alteração significativa das citocinas Th1 e Th2, exceto por um aumento da IL-4 nos animais tratados com CTmLA. Os animais que foram acompanhados por 60 dias tiveram uma melhora da proteinúria, da glomeruloesclerose, diminuição do infiltrado de macrófagos e uma melhora da expressão de WT-1. Não foram observadas diferenças estatísticas nos parâmetros de creatinina sérica e fibrose intersticial, aos 30 e 60 dias. Protocolo II: Nos animais que receberam a segunda dose de CTmLA e foram acompanhados por 60 dias observou-se prevenção da elevação da pressão arterial e da proteinúria, além de uma marcante diminuição da fibrose intersticial. Em conclusão, o presente estudo mostrou, pela primeira vez, que a terapia com CTmLA foi capaz de induzir renoproteção nos animais com doença renal crônica estabelecida. O tratamento com CTmLA pode representar uma nova abordagem terapêutica bloqueando a progressão da doença renal crônica / Mesenchymal stem cells (mSC) represent therapeutic potential for the treatment of renal diseases, due to their ability to induce tissue regeneration and functional recovery. Human amniotic fluid stem cells (AFmSC) are a class of fetal, pluripotent stem cells, which present characteristics intermediate between embryonic and adult stem cells. These cells are characterized by the expression of mesenchymal stem cells markers. In addition, they have the ability to differentiate into lineages of all embryonic germ layers. They also show high proliferative rates, but do not induce tumor formation. Therefore, AFmSC are considered to be a very promising cell source and these characteristics have generated a great interest concerning their potential renoprotective effects. The aim of this study was to analyze the effects of AFmSC in an experimental model of chronic kidney disease, the 5/6 nephrectomy model (Nx), after the disease has been established, in order to more closely resemble the clinical settings in humans. AFmSC derived from second-trimester amniocentesis were isolated by plastic adhesion. After 4-7 passages, AFmSC characteristics were confirmed by flow cytometry and by their ability to differentiate into osteogenic, adipogenic and chondrogenic lineages. Two experimental protocols were performed: In protocol I, rats underwent 5/6 nephrectomy (Nx) or sham surgery at day 0, received at day 15 a single dose of hAFmSC (5x105 cells) injected under the renal capsule and were studied at day 30 and 60 days. In protocol II, rats underwent Nx or sham surgery, and received at days 15 and 30, two doses of hAFmSC (5x105 cells) injected under the renal capsule, and were studied at day 60. In both protocols, the animals were subdivided into four groups: Sham, rats submitted to fictitious surgery; Sham+hAFmSC, Sham rats that received hAFmSC; Nx, rats submitted to nephrectomy 5/6; Nx+hAFmSC, Nx rats receiving hAFmSC. The hAFmSC were followed in the renal tissue by in situ hybridization for XY chromosome. In all the groups, clinical and histological parameters were analyzed by immunohistochemistry and real-time PCR. Results: AFmSC cultivated demonstrated an ability to adhere to plastic, to grow in colonies and to differentiate in osteogenic, adipogenic and chondrogenic cells. Quantitative analysis of cell markers by flow cytometry showed that isolated cells were positive for CD29, CD44, CD90 and CD105, with a small population of cells positive for CD14, CD34, CD45 and CD117, confirming a preponderant presence of mSC. Protocol I: After 30 days, the single dose of hAFmSC significantly reduced the blood pressure levels, proteinuria, glomerulosclerosis and improved the expression of podocytes markers, WT-1 and synaptopodin. A marked decrease on the number of macrophages and a discrete decrease of leucocyte infiltration, as well as a reduction of interstitial myofibroblasts was observed. Treatment with hAFmSC significantly reduced some proinflammatory cytokines (IL1beta, TNF-alpha, MCP-1 and RANTES). No significant difference in Th1 or Th2 cytokines was observed, except for IL-4 increase in Nx rats treated with hAFmSC. At 60 days of follow-up, Nx rats treated with hAFmSC presented reduced proteinuria, glomerulosclerosis and macrophages besides increase in WT-1 expression. No improvements were observed on serum creatinine and of interstitial fibrosis, after 30 and 60 days. Protocol II: Inoculation of two doses of hAFmSC in Nx rats improved blood pressure levels, proteinuria and interstitial fibrosis at day 60. In conclusion, the present study demonstrated, for the first time, that hAFmSC induced renoprotection in animals with established chronic kidney disease. Treatment with hAFmSC may represent a novel therapeutic approach for blocking the progression of chronic kidney disease