Die klassische Identifizierung von obligat anaeroben Bakterien ist mit einem hohen Labor- und Zeitaufwand verbunden. Um festzustellen, ob die Identifizierung mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorption/Ionisation und Massenspektrometrie mit Flugzeitanalysator (Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry; MALDI-TOF MS) ein Verfahren ist, um obligate Anaerobier eindeutig zu identifizieren, wurde mit der vorliegenden Arbeit die Identifizierung von unterschiedlichen Spezies der B. fragilis Gruppe mittels MALDI-TOF MS untersucht. Hierfür wurden 105 obligate Anaerobier der B. fragilis Gruppe aus der Stammsammlung des Institutes für Medizinische Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie der Universität Leipzig untersucht. Es fanden sich für die untersuchten Erreger Spektren mit sehr guter Auflösung. Eine Identifizierung und Differenzierung war eindeutig möglich. Unter Verwendung dieser Daten wurde eine Referenzdatenbank erstellt. Die erhaltenen Ergebnisse wurden mittels einer verblindeten Studie überprüft, wobei 52 von 53 (98,1%) der untersuchten Stämme eindeutig identifiziert werden konnten. Dies schließt ebenfalls die Identifizierung und Differenzierung von 15 Metronidazol-sensiblen/ Enterotoxin-negativen, 8 Metronidazol-resistenten/ Enterotoxin-negativen und 8 Metronidazol-sensiblen/ Enterotoxin-positiven B. fragilis Stämmen ein. Die Identifizierung mittels MALDI-TOF MS ist somit eine zuverlässige Methode zur Identifizierung von obligaten Anaerobiern der B. fragilis Gruppe. Weiterhin finden sich Hinweise, dass ein Nachweis von Resistenz-, Virulenz- und Pathogenitätsfaktoren mittels MALDI-TOF MS bei diesen Erregern möglich ist.

Thesis (doctoral)--Universität Konstanz, 1989. / Appended are reprints of two articles, in English, "Electromigration, a tool for studies on anaerobic ciliates," by Stefan Wagener, Claudius K. Stumm, and Godfried D. Vogels, and "Monoxenic culture of the anaerobic ciliate Trimyema compressum Lackey," by S. Wagener and N. Pfennig. Includes bibliographical references.

Techn. Hochsch., Diss., 2000--Aachen.

Die klassische Identifizierung von obligat anaeroben Bakterien ist mit einem hohen Labor- und Zeitaufwand verbunden. Um festzustellen, ob die Identifizierung mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorption/Ionisation und Massenspektrometrie mit Flugzeitanalysator (Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry; MALDI-TOF MS) ein Verfahren ist, um obligate Anaerobier eindeutig zu identifizieren, wurde mit der vorliegenden Arbeit die Identifizierung von unterschiedlichen Spezies der B. fragilis Gruppe mittels MALDI-TOF MS untersucht. Hierfür wurden 105 obligate Anaerobier der B. fragilis Gruppe aus der Stammsammlung des Institutes für Medizinische Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie der Universität Leipzig untersucht. Es fanden sich für die untersuchten Erreger Spektren mit sehr guter Auflösung. Eine Identifizierung und Differenzierung war eindeutig möglich. Unter Verwendung dieser Daten wurde eine Referenzdatenbank erstellt. Die erhaltenen Ergebnisse wurden mittels einer verblindeten Studie überprüft, wobei 52 von 53 (98,1%) der untersuchten Stämme eindeutig identifiziert werden konnten. Dies schließt ebenfalls die Identifizierung und Differenzierung von 15 Metronidazol-sensiblen/ Enterotoxin-negativen, 8 Metronidazol-resistenten/ Enterotoxin-negativen und 8 Metronidazol-sensiblen/ Enterotoxin-positiven B. fragilis Stämmen ein. Die Identifizierung mittels MALDI-TOF MS ist somit eine zuverlässige Methode zur Identifizierung von obligaten Anaerobiern der B. fragilis Gruppe. Weiterhin finden sich Hinweise, dass ein Nachweis von Resistenz-, Virulenz- und Pathogenitätsfaktoren mittels MALDI-TOF MS bei diesen Erregern möglich ist.

Die klassische Identifizierung von obligat anaeroben Bakterien ist mit einem hohen Labor- und Zeitaufwand verbunden. Um festzustellen, ob die Identifizierung mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorption/Ionisation und Massenspektrometrie mit Flugzeitanalysator (Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry; MALDI-TOF MS) ein Verfahren ist, um obligate Anaerobier eindeutig zu identifizieren, wurde mit der vorliegenden Arbeit die Identifizierung von unterschiedlichen Spezies der B. fragilis Gruppe mittels MALDI-TOF MS untersucht. Hierfür wurden 105 obligate Anaerobier der B. fragilis Gruppe aus der Stammsammlung des Institutes für Medizinische Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie der Universität Leipzig untersucht. Es fanden sich für die untersuchten Erreger Spektren mit sehr guter Auflösung. Eine Identifizierung und Differenzierung war eindeutig möglich. Unter Verwendung dieser Daten wurde eine Referenzdatenbank erstellt. Die erhaltenen Ergebnisse wurden mittels einer verblindeten Studie überprüft, wobei 52 von 53 (98,1%) der untersuchten Stämme eindeutig identifiziert werden konnten. Dies schließt ebenfalls die Identifizierung und Differenzierung von 15 Metronidazol-sensiblen/ Enterotoxin-negativen, 8 Metronidazol-resistenten/ Enterotoxin-negativen und 8 Metronidazol-sensiblen/ Enterotoxin-positiven B. fragilis Stämmen ein. Die Identifizierung mittels MALDI-TOF MS ist somit eine zuverlässige Methode zur Identifizierung von obligaten Anaerobiern der B. fragilis Gruppe. Weiterhin finden sich Hinweise, dass ein Nachweis von Resistenz-, Virulenz- und Pathogenitätsfaktoren mittels MALDI-TOF MS bei diesen Erregern möglich ist.

Die klassische Identifizierung von obligat anaeroben Bakterien ist mit einem hohen Labor- und Zeitaufwand verbunden. Um festzustellen, ob die Identifizierung mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorption/Ionisation und Massenspektrometrie mit Flugzeitanalysator (Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry; MALDI-TOF MS) ein Verfahren ist, um obligate Anaerobier eindeutig zu identifizieren, wurde mit der vorliegenden Arbeit die Identifizierung von unterschiedlichen Spezies der B. fragilis Gruppe mittels MALDI-TOF MS untersucht. Hierfür wurden 105 obligate Anaerobier der B. fragilis Gruppe aus der Stammsammlung des Institutes für Medizinische Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie der Universität Leipzig untersucht. Es fanden sich für die untersuchten Erreger Spektren mit sehr guter Auflösung. Eine Identifizierung und Differenzierung war eindeutig möglich. Unter Verwendung dieser Daten wurde eine Referenzdatenbank erstellt. Die erhaltenen Ergebnisse wurden mittels einer verblindeten Studie überprüft, wobei 52 von 53 (98,1%) der untersuchten Stämme eindeutig identifiziert werden konnten. Dies schließt ebenfalls die Identifizierung und Differenzierung von 15 Metronidazol-sensiblen/ Enterotoxin-negativen, 8 Metronidazol-resistenten/ Enterotoxin-negativen und 8 Metronidazol-sensiblen/ Enterotoxin-positiven B. fragilis Stämmen ein. Die Identifizierung mittels MALDI-TOF MS ist somit eine zuverlässige Methode zur Identifizierung von obligaten Anaerobiern der B. fragilis Gruppe. Weiterhin finden sich Hinweise, dass ein Nachweis von Resistenz-, Virulenz- und Pathogenitätsfaktoren mittels MALDI-TOF MS bei diesen Erregern möglich ist.

B. fragilis wird mit klinischen Bildern mit wie Abdominal- und Weichgewebs-Infektionen sowie Sepsis-Geschehen assoziiert, weitere Krankheitsbilder sind noch in der Erforschung. In der Vergangenheit gaben Virulenzfaktoren wie die komplexe Kohlehydrat-Kapsel, das Endotoxin sowie die Produktion von Katalase und Hämagglutinin nur eine unzureichende Erklärung für die Entstehung schwerer Infektionen, die der Keim auch als Einzelerreger verursachte. In den 1980er Jahren wurden Enterotoxigene B. fragilis Stämme als Erreger akuter Diarrhoe bei Kindern festgestellt; nachfolgend wurden Stämme mit diesem Virulenzfaktor in den unterschiedlichsten Infektions-geschehen nachgewiesen. Es kann davon ausgegangen werden, dass die Enterotoxin-Bildung von Bacteroides fragilis Stämmen eine Rolle bei der Pathogenese von systemischen Infektionen sowie möglicherweise bei der Entstehung von Darmkrebs spielt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde/n 1. Eine umfangreiche Stammsammlung von 271 Bacteroides fragilis Stämmen unterschiedlicher geographischer Herkunft aus den USA (Stammsammlungen) und aus Deutschland sowie verschiedener klinischer Herkunft (insbesondere n=70 Blutkulturisolate) zusammengestellt. 2. Die Überprüfung der Spezies-Identifizierung mittels phänotypischer Reaktionen (Koloniemorphologie, biochemische Methoden) sowie nachfolgender molekularer Tests (PCR-Fingerprinting) führte zum Ausschluss eines Isolates. 3. Mit molekularen Methoden die PCR-Gruppen I und II charakterisiert, wobei die meisten Stämme der Gruppe I angehörten. 4. Der molekulare Nachweis von Enterotoxin-Genabschnitten mit Rückschluss auf das Vorhandensein der BfPAI bei 32 von 260 Stämmen (12.3%) geführt. Diese Stämme waren immer Teil der PCR Gruppe I. Die 260 untersuchten Stämme konnten in Pattern I, II oder III eingeteilt werden. 5. Blutkultur-Stämme und Stämme aus anderen Quellen (Nicht-Blutkulturen) verglichen. Es konnten jedoch keine signifikanten Unterschiede bezüglich des Vorkommens von ETBF sowie NTBF Pattern III dargestellt werden. 6. In den US-amerikanischen Stämmen prozentual mehr ETBF und Gruppe II Stämme als in deutschen Isolaten nachgewiesen. 7. Beim Vergleich der Sequenzen die BfPAI flankierender Elemente sechs ausgewählter Stämme, einschließlich der Referenzstämme (ATCC 25285, NTBF Pattern II; ATCC 43859, ETBF Pattern I) verschiedene Punktmutationen gefunden.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 1 Einleitung 4 1.1 Historische Beschreibung des Genus Bacteroides mit der Typ-Spezies Bacteroides fragilis 4 1.1.1 Phänotypische Charakteristika des Genus Bacteroides 4 1.1.2 Molekulare Charakteristika und Taxonomie 5 1.1.3 Die Spezies Bacteroides fragilis 8 1.1.4 Antibiotika-Resistenzen bei der Spezies Bacteroides fragilis 9 1.1.5 Bacteroides fragilis: Zwei DNA-Homologie-Gruppen / zwei PCR Fingerprint-Gruppen 10 1.1.6 Natürliche Habitate obligater Anaerobier 11 1.1.7 Klinische Bedeutung der Spezies Bacteroides fragilis 11 1.2 Enterotoxin positive Bacteroides fragilis 13 1.2.1 Bacteroides fragilis Enterotoxin (BFT) - Fragilysin 14 1.2.2 Bacteroides fragilis Pathogenitätsinsel (BfPAI) 15 1.3 Weitere Krankheitsbilder 19 1.3.1 Infektionen/Sepsis 19 1.3.2 Chronisch-entzündliche Darmerkrankung und kolorektale Tumorbildung 20 2 Aufgabenstellung 21 3 Material und Methoden 22 3.1 Stämme 22 3.1.1 Referenzstämme 22 3.1.2 Auswahl der Klinischen Stämme 22 3.1.2.1 Vergleichsstämme der Spezies Bacteroides vulgatus und ovatus 23 3.1.2.2 Blutkulturen – Invasive Stämme 23 3.1.2.3 Nicht-Blutkulturen – Nicht-invasive Stämme 23 3.2 Kulturtechnik 24 3.2.1 Nährmedien 24 3.2.1.1 Columbia-Blut-Agar 24 3.2.2 Inkubation der anaeroben Kulturen 25 3.3 Gruppendifferenzierung der Isolate 25 3.3.1 Koloniemorphologie 25 3.3.2 Zellmorphologie - Gramfärbung 25 3.3.3 Differenzierung mittels Blättchentest 26 3.3.4 Biochemische Leistungsprüfung 26 3.4 Molekularbiologische Analysen 26 3.4.1 DNA-Extraktion 26 3.4.2 PCR-Reaktionsansätze 28 3.4.2.1 Optimierung der PCR-Ansätze nach Taguchi 29 3.4.3 PCR-Bedingungen 29 3.4.4 PCR-Fingerprint-Technik 30 3.4.4.1 Primer 30 3.4.4.2 PCR-Protokoll für T3B 31 3.4.4.3 Cycler-Profil 31 3.4.5 Spezifische PCR zum Nachweis von Teilen der BfPAI 32 3.4.5.1 Primer 32 3.4.5.2 PCR-Protokolle 32 3.4.5.3 Cycler-Profile 34 3.4.6 Agarose-Gel-Elektrophorese 35 3.4.7 Auswertung der Ergebnisse 36 3.5 Sequenzierung von DNA-Fragmenten 36 4 Ergebnisse 39 4.1 Identifizierung mittels phänotypischer Eigenschaften der Spezies Bacteroides fragilis Zell- und Koloniemorphologie 39 4.2 Biochemische Identifizierung 41 4.3 Molekulare Untersuchungen 42 4.3.1 Bestätigung der Spezies-Identifizierung mittels der PCR-Fingerprint-Technik 42 4.3.2 Unterteilung der Spezies in zwei PCR-Fingerprint-Gruppen 42 4.4 Nachweis von Enterotoxin und der BfPAI 44 4.4.1 Ergebnisse der PCR-Optimierung nach Cobb BD & Clarkson JM, 1994 44 4.4.2 Nachweis von Enterotoxin codierenden–Genabschnitten als Teile der BfPAI mittels dreier Primerpaare 45 4.4.3 PCR-Analyse der Schnittstellen der BfPAI unter Verwendung von zwei Primerpaaren 47 4.4.4 Auswertung der Blutkulturisolate 50 4.4.5 Nicht-Blutkulturen 53 4.4.6 Statistik zum Vergleich des Vorkommens der ETBF-Gen-Sequenzen und flankierenden Regionen (flanking regions) bei Blutkultur-Isolaten gegenüber Nicht- Blutkulturisolaten 61 4.4.7 Ausschluß von Enterotoxin-Genen bei Bacteroides vulgatus und Bacteroides ovatus 62 4.4.8 Vergleich der Bacteroides fragilis Stämme nach geographischer Herkunft 63 4.5 Sequenzierung der BfPAI-flankierenden Regionen in ausgewählten Stämmen 64 4.5.1 Sequenzierung der flankierenden Regionen 64 5 Diskussion 68 6 Zusammenfassung der Arbeit 79 7 Literaturverzeichnis 81 8 Anlagen 94 9 Danksagung 102 10 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 103 11 Publikationsliste 104