Mon travail de thèse a consisté à poursuivre le développement de l’Imagerie par Spectrométrie de Masse (IMS), à la fois sur le plan méthodologique mais aussi à travers des applications biologiques.Dans une première partie est exposé le développement d’une méthode de préparation des échantillons de très petite taille pour l’imagerie chimique, et plus particulièrement pour l’imagerie TOF-SIMS. Cette méthode a pu être validée en étudiant des molécules de la famille des flavonoïdes dans différents types de graines d’Arabidopsis thaliana ne mesurant que 400 nm de diamètre. La seconde partie, dédiée aux applications biologiques, est divisée en deux sections. La première section regroupe deux sujets où il était question de détecter et de localiser, à l’aide de l’imagerie TOF-SIMS, la molécule active d’une crème anti-acné dans des coupes de peaux de cadavre humain, ainsi qu’un retardateur de flamme bromé, le décabromodiphényl éther, dans ses tissus cibles chez le rat. Dans la seconde section, nous avons étudié, en imagerie TOF-SIMS et MALDI-TOF, l’absorption des lipides durant la digestion et enfin, avec l’aide d’outils d’analyse statistiques, nous avons comparé les profils lipidiques d’échantillons sains et atteins de la mucoviscidose chez un animal modèle de la maladie.À travers ces différents projets, nous avons pu conclure que les imageries par spectrométrie de masse TOF-SIMS et MALDI-TOF sont deux techniques complémentaires et qui, combinées à l’analyse statistique, peuvent être de puissants outils. / My PhD’s work consisted in continuing the development of Mass Spectrometry Imaging (MSI) methods, in terms of methodology improvements but also through biological applications.The first part concerned the development of a novel sample preparation method dedicated to very small objects for chemical imaging, particularly for TOF-SIMS imaging. This method has been validated by studying different types of flavonoids in from seeds of Arabidopsis thaliana, with a size of 400 nm only. The second part, dedicated to biological applications, is divided into two sections. The first section includes two projects where the goals was to detect and locate, using TOF-SIMS imaging, the active molecule of an anti-acne cream in human skin sections, and a brominated flame retardant, the decabromodiphenyl ether, in target tissues in rats. In the second section, we have studied by MALDI-TOF and TOF-SIMS imaging the lipid absorption during the digestion, and finally, with the help of statistical analysis tools, we compared lipid profiles of healthy samples versus those from cystic fibrosis samples in a model animal of the disease.Through these projects, we have concluded that MALDI-TOF and TOF-SIMS imaging are two complementary techniques, and, when they are combined with statistical analysis, they can be powerful tools.

Abstract Rapid and reliable identification of microorganisms is of paramount importance for advancing homeland security. Mass spectrometry is emerging as an effective bioanalytical tool having unique capabilities in handing complex mixtures. Matrix-assisted layser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry ¡]MALDI/TOF MS¡^is commonly used in the analysis of bio-molecules owing to its merits of high sensitivity, wide mass range, and ease-of-operation. The objective of the first part of the thesis is to develop an analysis method to characterize the genus, strains, and subspecies of the infections gastroenteritis bacteria by using MALDI/TOF MS. MALDI/TOF MS can be applied to classify different microoganisms based on examination of ion patterns from different microoganisms and unique distinguishing protein ions as biomarkers for different strains. The second section, bacteriophages MS2 and T4 were used as materials for identification of their specific protein markers. Protocols including sample preparation, purification, combined in gel digestion and post source decay to which the mass spectrometer brought for analytical specificity were employed. According to the experimental results, classification of different microorganisms based on examination of ion patterns is feasible. Furthermore, the peak at m/z 5255 in the MALDI mass spectra of MS2 analysis and the peak at m/z 8600 of T4 can provide the unique distinguishing signals. The experimental mass spectral peaks were submitted to the database search, and one of these peaks was matched to a tail fiber assembly helper protein. Thus, the method developed and the mass spectra presented in this thesis can be potentially applied to the practical virus analysis.

Mainz, Universiẗat, Diss., 2002.

Frankfurt (Main), Universiẗat, Diss., 2001.

Kiel, Universiẗat, Diss., 2001.

Urinary tract infection (UTI) is a very common infection in humans and a majority is caused by Escherichia coli. UTI are commonly treated empirically. However, empiric treatment has become more problematic due to increased antibiotic resistance to commonly used antibiotic agents. It is therefore desirable with short turnover times for antimicrobial susceptibility testing and species identification to improve antibiotic treatment at an early stage. Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time of Flight (MALDI-TOF) can provide species identification faster than former routine methods. This study compared direct and standard susceptibility testing using disk diffusion on Enterobacteriaceae (EB) from urine samples. The possibility to standardise the inoculum for direct susceptibility testing via a pellet obtained by a series of centrifugations was also evaluated, as well as direct species identification with MALDI-TOF from the pellet. Results from direct susceptibility testing from urine samples with EB, performed either directly from the urine or with a standardised inoculum, correlated well to those obtained with standardised susceptibility testing using EUCAST disk diffusion methodology with few errors, of which most were associated with Proteus mirabilis. The concept of standardising the inoculum for direct susceptibility testing to 0.5 McFarland was labour intensive and did not improve the results further. However, direct species identification from the urine pellet using MALDI-TOF showed good correlation to routine identification. Of 238 samples, an EB was correctly identified in 148 samples using MALDI-TOF.

Die klassische Identifizierung von obligat anaeroben Bakterien ist mit einem hohen Labor- und Zeitaufwand verbunden. Um festzustellen, ob die Identifizierung mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorption/Ionisation und Massenspektrometrie mit Flugzeitanalysator (Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry; MALDI-TOF MS) ein Verfahren ist, um obligate Anaerobier eindeutig zu identifizieren, wurde mit der vorliegenden Arbeit die Identifizierung von unterschiedlichen Spezies der B. fragilis Gruppe mittels MALDI-TOF MS untersucht. Hierfür wurden 105 obligate Anaerobier der B. fragilis Gruppe aus der Stammsammlung des Institutes für Medizinische Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie der Universität Leipzig untersucht. Es fanden sich für die untersuchten Erreger Spektren mit sehr guter Auflösung. Eine Identifizierung und Differenzierung war eindeutig möglich. Unter Verwendung dieser Daten wurde eine Referenzdatenbank erstellt. Die erhaltenen Ergebnisse wurden mittels einer verblindeten Studie überprüft, wobei 52 von 53 (98,1%) der untersuchten Stämme eindeutig identifiziert werden konnten. Dies schließt ebenfalls die Identifizierung und Differenzierung von 15 Metronidazol-sensiblen/ Enterotoxin-negativen, 8 Metronidazol-resistenten/ Enterotoxin-negativen und 8 Metronidazol-sensiblen/ Enterotoxin-positiven B. fragilis Stämmen ein. Die Identifizierung mittels MALDI-TOF MS ist somit eine zuverlässige Methode zur Identifizierung von obligaten Anaerobiern der B. fragilis Gruppe. Weiterhin finden sich Hinweise, dass ein Nachweis von Resistenz-, Virulenz- und Pathogenitätsfaktoren mittels MALDI-TOF MS bei diesen Erregern möglich ist.

Die klassische Identifizierung von obligat anaeroben Bakterien ist mit einem hohen Labor- und Zeitaufwand verbunden. Um festzustellen, ob die Identifizierung mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorption/Ionisation und Massenspektrometrie mit Flugzeitanalysator (Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry; MALDI-TOF MS) ein Verfahren ist, um obligate Anaerobier eindeutig zu identifizieren, wurde mit der vorliegenden Arbeit die Identifizierung von unterschiedlichen Spezies der B. fragilis Gruppe mittels MALDI-TOF MS untersucht. Hierfür wurden 105 obligate Anaerobier der B. fragilis Gruppe aus der Stammsammlung des Institutes für Medizinische Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie der Universität Leipzig untersucht. Es fanden sich für die untersuchten Erreger Spektren mit sehr guter Auflösung. Eine Identifizierung und Differenzierung war eindeutig möglich. Unter Verwendung dieser Daten wurde eine Referenzdatenbank erstellt. Die erhaltenen Ergebnisse wurden mittels einer verblindeten Studie überprüft, wobei 52 von 53 (98,1%) der untersuchten Stämme eindeutig identifiziert werden konnten. Dies schließt ebenfalls die Identifizierung und Differenzierung von 15 Metronidazol-sensiblen/ Enterotoxin-negativen, 8 Metronidazol-resistenten/ Enterotoxin-negativen und 8 Metronidazol-sensiblen/ Enterotoxin-positiven B. fragilis Stämmen ein. Die Identifizierung mittels MALDI-TOF MS ist somit eine zuverlässige Methode zur Identifizierung von obligaten Anaerobiern der B. fragilis Gruppe. Weiterhin finden sich Hinweise, dass ein Nachweis von Resistenz-, Virulenz- und Pathogenitätsfaktoren mittels MALDI-TOF MS bei diesen Erregern möglich ist.

Orientador: Fabiana Ferreira de Souza / Resumo: O ciclo estral da vaca é composto por 2-3 ondas de crescimento folicular, no qual vários folículos são recrutados e iniciam um novo crescimento. Durante o período denominado desvio folicular, um folículo se torna dominante e os outros entram em atresia. Este processo envolve um mecanismo ainda não completamente compreendido, incluindo proteínas específico, como já estabelecido pela expressão gênica. O objetivo do presente estudo foi caracterizar as proteínas do fluído folicular a fim de identificar macromoléculas relacionadas ao desenvolvimento dos folículos de vacas zebuínas nã-gestantes. Foram colhidos os ovários de 25 vacas mestiças não-gestantes em um abatedouro. A presença do corpo lúteo foi anotada para cada ovário. O líquido folicular foi colhido utilizando-se a imersão do ovário em meio líquido e ultrassonografia. De acordo com a mensuração do diâmetro folicular, foram formados 3grupos, folículos pequenos (≤6,5mm, n=25), médios (>6,5mm a ≤9mm, n=9) e grandes (>9,0mm, n=11). Após 2 centrifugações (600xg/10 minutos e 15.000xg/30 minutos, 4ºC) o sobrenadante foi separado e utilizado para determinação da concentração de proteína total (método de Bradford). A eletroforese foi conduzida sob condições desnaturantes e redutoras, em gel de separação de poliacrilamidaà 12%. A concentração de progesterona e estradiol do líquido folicular foi determinada a fim de identificar os folículos saudáveis. As proteínas diferenciais identificadas pela eletroforese foram... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Acinetobacter baumannii est une bactérie responsable d’infections communautaires, en particulier dans les régions tropicales et chez des blessés lors de conflits armés. Or, les réservoirs extra-hospitaliers de la bactérie sont peu connus. L’objectif de ce travail était d’étudier ces réservoirs dans une zone tropicale, l’île de la Réunion, en étudiant à la fois le réservoir animal (dépistage), environnemental et humain. En parallèle, des études ont été conduites en zone tempérée (France métropolitaine), avec le dépistage des animaux domestiques. Dans un premier temps, l’identification des espèces du complexe Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii par spectrométrie de masse a été perfectionnée sur l’automate VitekÒ MS. La deuxième partie du travail a permis de mettre en évidence une prévalence élevée de portage de la bactérie chez les animaux domestiques réunionnais (6,5 et 8,5%). Une prévalence inférieure a été décelée chez les animaux domestiques de métropole (2,7%). Dans tous les réservoirs étudiés, une grande diversité des souches a été retrouvée lors de l’analyse par Multi-Locus Sequence Typing, avec la mise en évidence de nouveauxSequence Types. Enfin, 2 souches productrices d’OXA-23 et OXA-24 ont pu être isolées respectivement en portage chez un patient et un animal d’élevage de l’île de la Réunion, et 2 souches productrices d’OXA-23 ont été isolées chez des animaux de compagnie de métropole. Ce travail a permis des observations intéressantes sur l’épidémiologie communautaire d’ A. baumannii. D’autres travaux restent à prévoir pour mieux comprendre les relations entre les réservoirs extra-hospitaliers, mais aussi avec le réservoir hospitalier. / Acinetobacter baumannii is a bacterium responsible for community-acquired infections, especially in tropical areas and among soldiers during warfare. However, community reservoirs of this bacterium are not very well known. The aim of this work was to study these reservoirs in a topical area, Reunion Island, by analyzing at the same time the animal (carriage), the environmental, and the human reservoirs. Studies were also performed in a temperate zone (metropolitan France), by analyzing carriage of companion animals. First, identification of species belonging to the Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii complex by mass spectrometry has been improved on the VitekÒ MS automated system. In asecond part of the study, a high prevalence of A. baumannii carriage has been observed in domesticated animals of La Reunion Island (6,5 and 8,5%). A lower prevalence has been detected in metropolitan companion animals (2,7%). Within allthe reservoirs studied, a great diversity of strains isolated has been shown by Multi-Locus Sequence Typing analysis, with the dicovery of new Sequence Types. At last, 2 strains producing OXA-23 and OXA-24 have been isolated respectively in carriage in a patient and in a livestock animal of La Reunion Island, and 2 strains producing OXA-23 have been isolated in metropolitan companion animals. This work has permitted to do some interesting observations on the community epidemiology of A. baumannii. Other studies are needed to better understandrelationships between the different community reservoirs, and also with the hospital reservoir.