Proefschrift Universiteit van Amsterdam. / Met lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands en Frans.

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Tese de doutoramento. Ciências de Engenharia. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2009

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Tese de mestrado integrado. Engenharia Mecânica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2010

Tese de mestrado integrado. Bioengenharia (Engenharia Biomédica). Universidade do Porto. Faculdade de Engenharia. 2011

Introduction: The two subtypes of Antineutrophil Cytoplasmic autoantibody associated systemic vasculitis (AASV) cANCA and pANCA associated vasculitis are the commonest causes of rapidly progressive glomerulonephritis. In spite of recent advances in the pathogenesis and development of new therapeutic agents, long term outcomes are still poor with five year mortality of 25%. There are epidemiological, histological, clinical and outcome related differences between these two conditions. This strongly suggests that there must be differences between genetic factors and pathogenesis of these two conditions. There was also a perception amongst the clinicians that AASV is more common in the Greater Manchester area. Hence in this study I calculated the incidence of pauciimmune glomerulonephritis in Greater Manchester and analysed the genetic differences between cANCA and pANCA associated vasculitis. Methods: Five year incidence of pauciimmune glomerulonephritis was calculated in Greater Manchester between 1/1/1999 to 31/12/2003. I recruited 147 patients with ANCA associated vasculitis. Clinical data was collected. I studied single nucleotide polymorphisms (SNPs) of tumour necrosis factor alpha(TNFα), interleukin 8 (IL-8), transforming growth factor beta (TGFβ), platelet endothelial cell adhesion molecule 1 (PECAM-1), Chemokine (CC motif) ligand-5 C chemokine (CCL-5), interleukin 10 (IL-10) and interleukin 18 (IL-18) genes and compared the frequencies of genotypes and alleles in patients with cANCA and pANCA associated small vessel vasculitis and healthy volunteers. I also studied circulating cytokine profiles of IL-10 and IL-18. Results of IL-18 SNPs were validated in AASV cohort from South-East USA. Further I studied the gene expression patterns of active and remission state of AASV and metabolomics profile of cANCA and pANCA positive patients during active and remission state of vasculitis. Clinical outcomes (relapses and renal survival) were correlated with the genotypes. Results: I found a significantly higher incidence (9.8/million population) of pauciimmune glomerulonephritis in Greater Manchester compared to the previously published data from UK and USA (2.73 to 4.6/million). Renal function at the time of diagnosis predicted the long term renal survival. I also found a novel genetic association of increased frequency of high producer IL-18 SNPs 113T, 127C and 137G in pANCA positive patients compared to normal volunteers (p=0.04) and cANCA positive patients (trend- p=0.08). This was associated with increased levels of circulating IL-18 levels in these patients. This association was further confirmed in an independent cohort of AASV from USA. I also found a lower frequency of low producer GG genotype of IL-10 -1082 SNP (p=0.05) and this was associated with lower levels of circulating IL-10 in these patients compared to pANCA positive patients. I found significant difference in the metabolomics profiles of cANCA andpANCA positive patients. In paired plasma samples, levels of some metabolites were high during remission state compared to active vasculitis. Conclusions: These findings strongly support the hypothesis that there is an increased incidence of pauciimmune glomerulonephritis in Greater Manchester. There are genetic differences in cANCA and pANCA positive patients which may explain the different observed outcomes. Genome wide association study would strengthen these findings and should guide the vasculitis community to reclassify, assess and perhaps treat these two conditions separately.

Tese de mestrado integrado. Engenharia Mecânica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2010

Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Antikörper-bindende Epitope von humaner Proteinase 3 (hPR3), dem Autoantigen der Wegenerschen Granulomatose (WG), charakterisiert. WG ist eine Autoimmunerkrankung, die durch chronische Entzündung des oberen und unteren respiratorischen Trakts, Vaskulitis und Glomerulonephritis gekennzeichnet ist. WG ist mit Anti-Neutrophilen zytoplasmatischen- Antikörpern (ANCA) assoziiert, die spezifisch gegen konformationelle Epitope auf der Oberfläche der Serinprotease hPR3 aus azurophilen Granula neutrophiler Granulozyten gerichtet sind. Die Charakterisierung von ANCA-bindenden Epitopen ist für ein besseres Krankheitsverständis Unverzichtbar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde nach einem geeigneten PR3-Homolog gesucht, welches sich durch den gezielten Austausch von Oberflächen- Loops für die Kartierung von ANCA-Epitopen eignet. Zunächst wurde die PR3 Aminosäuresequenz der Primaten Pan troglodytes versus (Schimpanse), Macacca mulatta (Makakke) und Hylobates pileatus (Gibbon) analysiert und die Reaktivität gegenüber ANCA mit dem humanen Homolog verglichen. Sowohl Aminosäuresequenz als auch ANCA-Kreuzreaktivität korrelierten mit der phylogenetischen Distanz zu hPR3. Aufgrund der Bindungseigenschaften von Gibbon-PR3 (gibPR3) wurde dieses Homolog für Epitopstudien herangezogen, da die Aminosäuresequenz nur geringfügig von hPR3 abweicht und die Bindung von monoklonalen Anti-hPR3-Antikörpern und WG-Patientenseren im Immunoblot ein deutlich abgeschwächtes Signal lieferte oder keine Reaktivität mehr aufwies. Für die Epitop-Charakterisierung wurden drei hPR3/gibPR3-Mutanten generiert. Die rekombinante Expression von proPR3 erfolgte in Flp-in HEK 293 Zellen und wurde von dort aus dem Zellkultur-Überstand gereinigt und mittels Enterokinase konvertiert. Um das Epitopspektrum genau zu analysieren, wurde ein ELISA entwickelt, bei dem PR3 über den C-terminal gelegenen His6-Tag an Nickel-beschichtete Mikrotiterplatten gebunden wurde. Für den monoklonalen Anti-hPR3-Antikörper MCPR3-2 konnte die Region auf die Aminosäuren Arg60, Gln63A und Leu90 (Chymotrypsinogen-Nummerierung), das für 12.8 auf Met35, Asn38A, Pro38B und Arg74 der N-terminalen PR3-Domäne eingegrenzt werden. Letztere wurde von der Mehrheit der getesteten ANCA der WG-Patienten erkannt und zeigt somit, dass es sich hierbei um ein krankheitsrelevantes Epitop handelt. Diese Region schließt dabei auch den Bindungsbereich von α1-PI ein. Im weiteren konnte gezeigt werden, dass eine Bindung des Antikörpers bei gleichzeitiger Anwesenheit von α1-PI stark von dessen Konzentration abhängig ist. Bereits bei einer α1-PI-Konzentration von 1 mg/ml, konnte eine partielle Antikörperbindung beobachtet werden. Sinkt die Konzentration deutlich, so besitzen Anti-hPR3-Antikörper die Möglichkeit an diese zu binden. Somit konkurrieren Antikörper und Inhibitor um die PR3-Bindungsstellen. Ein ausgewogenes Protease-Inhibitor-Gleichgewicht ist allerdings für eine kontrollierte Protease-Aktivität notwendig. Ist dieses gestört, so kann es zur Bindung von ANCA an hPR3 auf der Membran von Neutrophilen und deren Aktivierung kommen. Dies hat zur Folge, dass vermehrt proteolytische Enzyme freigesetzt werden, welche durch unkontrollierte enzymatische Aktivität Entzündungsreaktionen und Gewebeschädigung hervorrufen. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Charakterisierung einer autosomal-dominant vererbten myofibrillären Myopathie (MFM) in Kombination mit familiärer arrhythmogener rechtsventrikulärer Kardiomyopathie 7 (ARVD7) einer schwedischen Familie. Durch genomweite Kartierung mittels SNP (single nucleotide polymorphism)-Typisierung (Affymetrix Human Mapping 10K Array) wurde der Locus auf 10q22.3 bestätigt. Die Region wurde anschließend bis auf 4.1 Mbp zwischen den Markern D10S1645 und D10S1786 eingegrenzt. In diesem Intervall befinden sich 18 Kandidatengene. Nachdem die Protein-kodierenden Exons aller Gene im Krankheitsintervall sequenziert und dennoch keine signifikanten Abweichungen zwischen Patient und der Normalpopulation aufgefallen waren, wurde gezielt nach einer intragenische Deletion gesucht. Hierzu wurde von einem der Patienten zwei Maus-Hybridlinien generiert, die jeweils nur eines der beiden 10-er Homologe des Patienten enthalten. Doch auch hier waren die kodierenden Exons der 18 Gene aus beiden Hybridlinien durch PCR mit gleicher Effizienz und Größe amplifizierbar, so dass eine intragenische Deletionen mit großer Sicherheit bei allen Genen ausgeschlossen werden konnte. Des weiteren wurde nach SNPs in der transkribierten Sequenz der Kandidatengene gesucht, und die Expression beider Allele für 10 von 18 Kandidatengenen in Muskel-cDNA nachgewiesen. Kleine Veränderungen in nicht-kodierenden Bereichen, Introns, Promotor-Regionen, genomische Veränderungen oder de novo Insertionen sind mögliche pathogene Mechanismen, die im weiteren untersucht werden müssen. / In the first part of this work we characterised antibody-binding epitopes of human proteinase 3 (hPR3), the autoantigen in Wegeners granulomatosis (WG). WG is an autoimmune disorder characterized by chronic inflammation of the upper and lower respiratory tract, perivascular inflammation and glomerulonephritis. WG is associated with anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA), which recognize conformational epitopes on the surface of hPR3 from azurophilic granules of neutrophil granulocytes. To determine, which epitopes are disease specific and pathogenetically relevant, we first identified a humanoid PR3 homolog which was used to map and distinguish the various ANCA-binding epitopes. We analysed the PR3 amino acid sequence of primates Pan troglodytes versus (chimpansee), Macacca mulatta (macaque) and Hylobates pileatus (gibbon) and compared the ANCA-binding pattern of these species to the human homolog. Amino acid differences and ANCA cross-reactivity correlated with the phylogenetic distance to the human homolog. We recognized the most useful PR3 variant was the gibbon equivalent (gibPR3) because it harboured a limited number of amino acid differences and showed an intermediate ANCA binding pattern with binding of some but not all monoclonal anti-hPR3 antibodies and WG patient sera. To determine the epitopes, we generated three PR3-chimera by reverting non-conserved PR3-loops to the respective human amino acids. ProPR3 was expressed in Flp-in 293 cells, purified from cell culture supernatant and activated by enterokinase. For epitope analysis an ELISA was developed, where PR3 was coupled via its C-terminal His6-tag to nickel-coated microtiter plates. The epitope of monoclonal anti-hPR3 antibody MCPR3-2 was mapped to a region defined by amino acids Arg60, Gln63A and Leu90 (chymotrypsinogen numbering), whereas Met35, Asn38A, Pro39B and Arg74 of the N-terminal PR3 domain contributed to the 12.8 epitope. The latter epitope was recognized by the majority of ANCA from Wegener patients tested and seems to be an ANCA-targeted region. The 12.8 epitope overlaps with the α1-PI binding site, too. Therefore antibody and inhibitor directly compete for binding to hPR3. Moreover we showed that antibody binding strongly depends on the concentration of this inhibitor. α1-PI-concentrations of 1 mg/ml allowed partial binding to PR3 and concentrations below shifted the binding towards the antibody. This finding indicates that a protease-inhibitor balance is critical because ANCA-binding to membrane bound PR3 on the surface of neutrophils would lead to activation and release of proteolytic enzymes to the environment and to an uncontrolled proteolytic activity. The second part of this studies were dedictated to the search for the genetic defect in a Swedish family suffering from autosomal dominant myofibrillar myopathy (MFM) in combination with arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy (ARVC7). In a comprehensive follow up study we reexamined the previous linkage data for MFM/ARVC7 by genome wide SNP analyses and confirmed the locus assignment using a high density single nucleotide polymorphism (SNP) marker panel from Affymetrix to 10q22.3. The critical interval was narrowed down to 4.1 Mbp between the two markers D10S1645 and D10S1786. Because no mutation was found in the coding exons of the 18 candidate genes for MFM/ARVC7 we tried to identify small genomic deletions and generated hybrid cell lines carrying only the affected or the normal chromosome 10 homolog. All sequence tagged sites and exons were present on both homologs excluding the possibility of intragenic and submicroscopic deletions. Furthermore, we identified SNPs within the transcribed sequences of 10 candidate genes and showed expression of both alleles in patient muscle cDNA. Subtle alterations in noncoding transcripts, introns, promoter regions or splicing enhancers, genomic inversions or de novo insertions are probably responsible for both disparate syndromes and have to be investigated.

Disertação apresentada para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Biomédica, na Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto, sob a orientação do Professor Doutor José António de Oliveira Simões