Les cellules cancéreuses sont sujettes à des défauts de reformation de l'enveloppe nucléaire (EN) après la mitose. BAF est l'une des premières protéines recrutées sur les chromosomes pour initier la reformation de l’EN. Chez l'humain, le recrutement de BAF nécessite sa déphosphorylation par la phosphatase PP2A et Ankle2, une protéine du réticulum endoplasmique (RE) interagissant avec PP2A. Cependant, les fonctions d’Ankle2 dans la reformation de l’EN ne sont pas complètement comprises. Pour les étudier, notre laboratoire utilise la drosophile comme organisme modèle. On ne sait pas si Ankle2 de drosophile fonctionne dans le NER. Nous avons constaté qu’Ankle2 est nécessaire au recrutement de BAF pour le réassemblage du noyau après la mitose chez la drosophile. Pour mieux comprendre son fonctionnement, nous avons identifié des protéines avec lesquelles BAF interagit : PP2A, Vap33 (une protéine du RE) et certaines Kinases Dépendantes des Cyclines (CDK). Nous avons cartographié les régions d’Ankle2 impliquées dans ces interactions protéiques grâce à une analyse mutationnelle, des co-purifications par affinité et des pulldowns GST. Nous avons ensuite généré des mutants d’Ankle2 spécifiquement déficients pour des interactions et testé leur capacité à sauver la prolifération et la reformation de l’EN dans des cellules où Ankle2 endogène est déplété. Nos résultats indiquent que l'interaction entre Ankle2 et PP2A est essentielle pour sa fonction dans la reformation de l’EN. Une analyse biochimique suggère qu’Ankle2 fonctionne comme une sous-unité régulatrice de PP2A. En utilisant une approche phosphoprotéomique, nous avons confirmé que la déphosphorylation de BAF dépend d’Ankle2 et nous avons aussi identifié de nouveaux substrats potentiels du complexe PP2A-Ankle2. Nous concluons que le complexe PP2A-Ankle2 est nécessaire à la déphosphorylation de BAF et à son recrutement pour le réassemblage du noyau. Les expériences en cours permettront de déterminer les exigences d'autres interactions d’Ankle2 pour ses fonctions dans la reformation de l’EN. La suite de ces travaux impliquera l’étude de la régulation de nouveaux substrats de PP2A-Ankle2 impliqués dans ce processus. Une reformation de l’EN défectueuse peut provoquer une 4 micronucléation, ce qui peut déclencher une réponse immunitaire innée. La perturbation de la reformation de l’EN dans les cellules cancéreuses pourrait donc être bénéfique dans le contexte de l’immunothérapie. / Cancer cells are prone to defects in Nuclear Envelope Reformation (NER) after mitosis. BAF is one of the first proteins recruited on chromosomes to initiate NER. In humans, BAF recruitment requires its dephosphorylation by PP2A and Ankle2, a PP2A-interacting protein of the endoplasmic reticulum (ER). However, the functions of Ankle2 in NER are incompletely understood. Our lab uses Drosophila as a model system. Whether Drosophila Ankle2 functions in NER is unknown. We found that Ankle2 is required for BAF recruitment to reassembling nuclei in Drosophila. To better understand how it functions, we identified its interactors, which include PP2A, Vap33 (an ER protein) and Cyclin-Dependent Kinases (CDKs). We mapped the regions of Ankle2 involved in these protein-protein interactions through a mutational analysis, affinity co-purifications and GST pulldowns. We then generated mutant forms of Ankle2 defective in individual interactions and tested their ability to rescue proliferation and NER in cells depleted from endogenous Ankle2. Our results indicate that the interaction of Ankle2 with PP2A is essential for its function in NER. A biochemical analysis suggests that Ankle2 functions as a regulatory subunit of PP2A. Using a phosphoproteomic approach, we confirmed that BAF dephosphorylation depends on Ankle2 and also identified novel candidate substrates of the PP2A-Ankle2 complex. We conclude that PP2A-Ankle2 complex is required for BAF dephosphorylation and recruitment to reassembling nuclei. Ongoing experiments will determine the requirements of other interactions of Ankle2 for its functions in NER. Future work will explore the regulation of novel PP2A-Ankle2 substrates in this process. Defective NER can cause micronucleation, which can elicit an innate immune response. Disrupting NER in cancer cells could be beneficial in the context of immunotherapy.

Pendant le bris de l'enveloppe nucléaire, la kinase dépendante des cyclines liée à la cycline B (CDK1-cycline B) et d'autres kinases phosphorylent des protéines nucléaires conduisant au désassemblage des complexes de protéines de l'enveloppe nucléaire. Les protéines nucléaires phosphorylées sont ensuite déphosphorylées par un groupe de phosphatases en sortie mitotique. La protéine phosphatase 2A en complexe avec la sous-unité régulatrice B55 (PP2A-B55) est connue pour être la principale phosphatase à déphosphoryler les protéines critiques à la fin de la mitose. Cependant, les substrats nucléaires déphosphorylés par PP2A-B55 à la sortie mitotique sont peu connus. En utilisant des cellules de drosophile en culture, nous avons démontré que PP2A-B55 est nécessaire pour le recrutement de protéines de l'envelope nucléaire telles que BAF, la protéine de lamina nucléaire Lamin B et la nucléoporine Nup107. De plus, nous avons trouvé que les œufs de femelles des drosophiles hétérozygotes pour une mutation dans les gènes codant pour la Lamine B et Tws (B55 chez la drosophile) n’éclosent pas. Ces œufs présentent divers défauts au stade de la méiose et des divisions nucléaires de l’embryon syncytial. De plus, des tests in vitro et d'autres analyses biochimiques indiquent que PP2A-Tws se lie et déphosphoryle BAF. J'ai d'autres résultats qui suggèrent un rôle de la protéine Ankle2 dans la régulation du recrutement de BAF pour réassembler les noyaux à la sortie mitotique. Mes résultats suggèrent également que Ankle2 en complexe avec PP2A est responsable de la bonne progression mitotique. Mes résultats mettent en évidence l'utilité de la drosophile comme système modèle dans l'étude de différents aspects du cycle cellulaire. Ils démontrent également / During nuclear envelope breakdown, the cyclin-dependent kinase 1 bound to Cyclin B (CDK1-Cyclin B) and other kinases phosphorylate a number of nuclear proteins leading to the disassembly of nuclear envelope protein complexes. Phosphorylated nuclear proteins are then dephosphorylated by a group of phosphatases at mitotic exit. The protein phosphatase 2A in complex with the regulatory subunit B55 (PP2A-B55) is known to be the major phosphatase to dephosphorylate critical proteins at the end of mitosis. However, little was known about the nuclear substrates dephosphorylated by PP2A-B55 at mitotic exit. Using Drosophila cells in culture, we demonstrated that PP2A-B55 is required for the recruitment of nuclear envelope proteins such as BAF, the nuclear lamina protein Lamin B, and the nucleoporin Nup107. Also, eggs from Drosophila females heterozygous for a mutation in genes coding for Lamin B and Tws (B55 in Drosophila), didn’t hatch. These eggs showed various defects during the nuclear division stage and meiosis. Moreover, in vitro assays and other biochemical analyses indicate that PP2A-B55 binds and dephosphorylates BAF. I have other results that suggest a role of the protein Ankle2 in regulating BAF recruitment to reassembling nuclei at mitotic exit. My results also suggest that Ankle2 in complex with PP2A is responsible for the proper mitotic progression. Our results highlight the importance of Drosophila in investigating different aspects of the cell cycle. It also demonstrates a role of PP2A in the nuclear envelope reformation at the end of mitosis.

La progression mitotique est principalement régulée par la phosphorylation et la déphosphorylation des protéines. La kinase dépendante des cyclines liée à la cycline B (Cdk1 - cycline B) et d'autres kinases phosphorylent une myriade de protéines pour promouvoir l’entrée à la mitose. Ces phosphorylations sont réversées par les phosphatases lors de la sortie mitotique. La protéine phosphatase 2A avec sa sous-unité régulatrice B55 (PP2A-B55) est une des principales phosphatases neutralisant les phosphorylations par Cdk1. Dans ce projet, nous avons vu que Ankle2 participe à la sortie de la mitose. En utilisant D. melanogaster comme modèle puissant, nous avons observé que Ankle2 est important pour le recrutement des protéines BAF et Lamin associées à l'enveloppe nucléaire (NE) à la télophase, assurant la formation d'un seul noyau. In vivo, nos résultats indiquent que Ankle2 est crucial pour le développement de l'embryon de drosophile, car les embryons ARNi Ankle2 sont arrêtés lors de la première mitose. Pour amorcer l’étude des mécanismes moléculaires par lesquels Ankle2 remplit ces foncions, nous avons identifié ses partenaires d’interactions. Nous avons constaté que Ankle2 est associé à une forme active de PP2A, suggérant Ankle2 comme une sous-unité régulatrice potentielle de PP2A. De plus, Ankle2 forme un complexe avec la cycline B et les Cdks mitotiques, et nos résultats génétiques suggèrent que les deux protéines peuvent avoir des rôles opposés. Nous avons également découvert que Ankle2 interagit avec la protéine du réticulum endoplasmique (ER) Vap33 à travers son motif FFAT. Dans ce projet, nous avons constaté que Ankle2 est une protéine associée au ER chez la drosophile qui est cruciale pour la complétion de la mitose, et que pourrait réguler l'activité des kinases et phosphatases mitotiques. Cette étude servira de base pour déchiffrer les mécanismes moléculaires précis par lesquels Ankle2 favorise la sortie de la mitose. / Protein phosphorylation and dephosphorylation is one of the mechanisms that regulates mitotic progression. Cyclin dependent kinase 1 bound to cyclin B (Cdk1 – cyclin B) and other kinases phosphorylate a myriad of proteins to promote early mitotic events. These phosphorylations are reversed by phosphatases during mitotic exit. The Protein Phosphatase 2A with its regulatory subunit B55 (PP2A-B55) is the major phosphatase counteracting Cdk1 phosphorylations. In this project, we have found that Ankle2 participates in mitotic exit. Using D. melanogaster as a model, we have found that Ankle2 is important for the Nuclear Envelope (NE)-associated proteins BAF and Lamin recruitment at telophase, ensuring the formation of a single nucleus. In vivo, we have found that Ankle2 is crucial for Drosophila embryo development, as RNAi Ankle2 embryos are arrested in the first mitosis. To study the molecular mechanisms by which Ankle2 promotes mitotic exit, we identified its interacting partners. We found that Ankle2 is associated with an active form of PP2A, suggesting Ankle2 as a potential regulatory subunit of PP2A. Moreover, Ankle2 engages in a complex with cyclin B and mitotic Cdks, and our genetic results suggest that Ankle2 and mitotic cyclin – Cdk complex may have opposite roles. We have also found that Ankle2 interacts with the Endoplasmic-Reticulum (ER) protein Vap33 through its FFAT motif. In this project, we have found that Ankle2 is an ER-associated protein in Drosophila that is crucial for completion of mitosis, probably regulating the activity of mitotic kinases and phosphatases. This study will serve as a basis to decipher the precise molecular mechanisms by which Ankle2 promotes mitotic exit.