Submitted by Ricardo Cedraz Duque Moliterno (ricardo.moliterno@uefs.br) on 2016-09-15T21:49:15Z No. of bitstreams: 1 Rodrigo Tese Final PDF.pdf: 7598532 bytes, checksum: 876426158d6c8f445be96952d8f7c27b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-15T21:49:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigo Tese Final PDF.pdf: 7598532 bytes, checksum: 876426158d6c8f445be96952d8f7c27b (MD5) Previous issue date: 2016-03-28 / The use of vegetables with medicinal purposes contributes significantly to the care of the primary needs of assistance to health due to difficult access of the population to medical and pharmaceutical assistance, the high cost of manufactured medications and a tendency for people to use natural origin products. However, technical and scientific information about most of them, particularly with respect to the genotoxic potential, are still insufficient so that the use can be considered safe. In this context, the aim of this study was to evaluate the genotoxic effects of boldo extracts (Plectranthus ornatus) and soursop (Annona muricata), through the comet assay and micronucleus test in human lymphocytes with cytokinesis blocking (MNCtB). The tests were performed on human lymphocyte cultures exposed to the extracts in three concentrations: 1.000?g/ml, 500?g/ml and 250?g/ml. Hydrogen peroxide (1mM) was used as a positive control in the comet assay and vincristine sulfate (1mM) in MNCtB. As a negative control, 40% ethanol was used in both tests. The processing of the material for the comet assay and MNCtB was done according respectively to the protocols Tice et al. (2000) and Fenech (1993). The comet assay was performed in five repetitions being computed, in each of them, 100 comets in a total of two blades. For MNCtB three repetitions were performed and 1.000 binucleate lymphocytes were computed per slide. The occurrence of DNA damage (comet assay) did not differ between the cell of the cultures exposed to different concentrations of boldo extracts from each other nor compared to the negative control. Higher occurrence of micronuclei (MNCtB) was observed in the cell of the cultures treated with the extract at concentrations of 1.000?g/ml and 500?g/ml when compared to the negative control (p<0.05) and cultures treated with the extract concentration of 250?g/ml. The soursop extracts at concentrations of 1.000?g/ml to 500?g/ml induced damage occurrence to the DNA significantly higher than that observed in the negative control and cultures treated with extract at a concentration of 250?g/ml (p<0.001). The conditions in which this study was performed, the obtained results allow concluding that: 1) boldo extracts are not effective in inducing DNA damage, but depending on the concentration, they present clastogenic and/or aneugenic effects; 2) soursop extracts induce DNA damage under certain concentrations. The results of this study strongly raise the achievement of other addressing the issue, so that the actual genotoxic potential of vegetables analyzed here can be established. / O uso de vegetais com fins medicinais contribui de forma significativa para o cuidado das necessidades prim?rias de assist?ncia ? sa?de devido ao dif?cil acesso da popula??o ? assist?ncia m?dica e farmac?utica, aos altos custos dos medicamentos industrializados e ? uma tend?ncia das pessoas a utilizarem produtos de origem natural. No entanto, informa??es t?cnico-cient?ficas acerca da maioria deles, particularmente no que tange ao potencial genot?xico, s?o ainda insuficientes para que o uso possa ser considerado seguro. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos genot?xicos de extratos do boldo (Plectranthus ornatus) e da graviola (Annona muricata), atrav?s do ensaio cometa e do teste de micron?cleo em linf?citos humanos com bloqueio da citocinese (MNCtB). Os testes foram feitos em culturas de linf?citos humanos expostas aos extratos em tr?s concentra??es: 1.000?g/ml, 500?g/ml e 250?g/ml. Per?xido de hidrog?nio (1mM) foi utilizado como controle positivo no ensaio cometa e sulfato de vincristina (1mM) no MNCtB. Como controle negativo foi usado o etanol 40% em ambos os testes. O processamento do material para o ensaio cometa e MNCtB foi feito de acordo, respectivamente, com os protocolos de Tice et al. (2000) e Fenech (1993). O ensaio cometa foi realizado em cinco repeti??es, sendo computados, em cada uma delas, 100 cometas em um total de duas l?minas. Para o MNCtB foram realizadas tr?s repeti??es e computados 1.000 linf?citos binucleados por l?mina. A ocorr?ncia de danos ao DNA (ensaio cometa) n?o diferiu entre as c?lulas das culturas expostas ?s diferentes concentra??es dos extratos do boldo entre si e nem quando comparadas ao controle negativo. Maior ocorr?ncia de micron?cleos (MNCtB) foi observada nas c?lulas das culturas tratadas com os extratos nas concentra??es de 1.000?g/ml e de 500?g/ml quando comparadas ao controle negativo (p<0,05) e ?s culturas tratadas com o extrato na concentra??o de 250?g/ml. Os extratos da graviola nas concentra??es de 1.000?g/ml e 500?g/ml induziram ocorr?ncia de danos ao DNA significativamente maior do que o observado no controle negativo e nas culturas tratadas com extrato na concentra??o de 250?g/ml (p<0,001). Nas condi??es em que este estudo foi realizado, os resultados obtidos permitem concluir que: 1) extratos do boldo n?o s?o efetivos em induzir danos ao DNA, mas na depend?ncia da concentra??o apresentam efeitos clastog?nicos e/ou aneug?nicos; 2) extratos da graviola induzem danos ao DNA sob determinadas concentra??es. Os resultados deste estudo suscitam fortemente a realiza??o de outros abordando o tema, para que o real potencial genot?xico dos vegetais aqui analisados possa ser estabelecido.

Considerando o grave quadro das doenças negligenciadas, no Brasil e no mundo, e as limitações do tratamento empregado, na atualidade, torna-se urgente a pesquisa de novos fármacos, que sejam mais ativos e seguros. Para tanto, a busca de moléculas-protótipo, a partir de espécies vegetais, tem sido importante estratégia. Neste contexto, foi realizado o estudo de Annona crassiflora Mart. (Annonaceae), cujos alcalóides totais (AT) demonstraram promissora atividade antiprotozoária in vitro, em estudo anterior. Em paralelo, outras espécies de Annona mostraram atividade antimicobacteriana in vitro, igualmente, tendo motivado o presente estudo. Cinco das vinte frações alcaloídicas obtidas, por cromatografia em coluna, a partir dos AT das folhas, apresentaram atividade anti-Leishmania in vitro, tendo causado 100% de morte das formas promastigotas de Leishmania (L.) infantum chagasi. Além disto, três delas foram ativas frente ao Mycobacterium tuberculosis. O isolamento de dois alcalóides noraporfínicos foi realizado, por fracionamento biomonitorado em coluna cromatográfica, seguido de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) semipreparativa. As estruturas dos compostos isolados foram elucidadas empregando-se as análises espectroscópicas de ressonância magnética nuclear, mono e bidimensionais, e por CLAE acoplada à espectrometria de massas (CLAEIES-EM2). Um dos alcalóides foi identificado pela primeira vez, nesta espécie, sendo que o outro apresentou estrutura inédita. Ambos demonstraram significativa atividade anti-Leishmania in vitro (CE50&#8804; 10 &#181; g/ mL) frente às formas promastigotas de L. (L.) infantum chagasi [MHOM/BR/1972/LD]. O primeiro teve maior índice de seletividade (IS: 7,4), em relação à citotoxicidade em células do tecido conjuntivo NCTC Clone 929 de camundongos. Frente ao Mycobacterium tuberculosis (ATCC 27294) e ao M. smegmatis (ATCC 35798), os alcalóides isolados foram inativos (CIM &#8805; 128 &#181;g/ mL). O óleo volátil das folhas foi analisado por cromatografia gasosa acoplada à espectroscopia de massas (CG-EM), tendo sido identificados 41 constituintes, prevalecendo os sesquiterpenos (81,7%) em relação aos monoterpenos (0,8%). Entre os compostos majoritários encontrados no óleo, citam-se os sesquiterpenos &#945;-amorfeno (43,6%), E-cariofileno (17,7%) e o germacreno (5,3%). Nos testes de atividade anti-Leishmania in vitro frente às formas promastigotas de quatro espécies do parasita, o óleo foi mais ativo em L. (L.) infantum chagasi (CE50: 25,97 &#181;g/ mL). Nas formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi mostrou atividade 8,5 vezes superior àquela do fármaco-padrão benznidazol (CE50: 5,31 &#181;g/ mL). Os resultados obtidos ratificaram a importância da prospecção da flora, em particular de A. crassiflora, como fonte potencial de compostos bioativos, que venham a constituir novos fármacos, como alternativa à restrita terapêutica existente para o tratamento das doenças negligenciadas. / Neglected diseases are a serious health problem in Brazil and worldwide. The available drugs are limited in effectiveness with a high toxicity. There is an urgent need of more safe and bioactive compounds. The search of new molecules from plant species is a well known and important strategy to achieve this goal. In a previous work, Annona crassiflora Mart. (Annonaceae) showed a promising antiprotozoal activity. Beside this, other Annona species presented an interesting antimicobacterial action. In this bio-guided study, after the column fractionation of the leaves total alkaloids, in vitro tests were performed and five from twenty fractions were highly active (100% deaths) against promastigotes of Leishmania (L.) infantum chagasi, and only three were active against Mycobacterium tuberculosis. After purification of the bioactive fractions, two noraporphine alkaloids were isolated by HPLC and identified by the usual mono and bidimensional spectroscopic techniques. One of them was isolated from the first time from this species. The other one is a novel chemical entity. Both compounds presented anti- Leishmania activity (CE50 &#8804; 10 &#181;g/ mL) against L. (L.) infantum chagasi [MHOM/BR/1972/LD]. The first one showed a higher selectivity index (SI: 7.4) considering its mice connective tissue cells toxicity [NCTC Clone 929]. However, both were inactive against Mycobacterium tuberculosis (ATCC 27294) and M. smegmatis (ATCC 35798) (CIM &#8805; 128 &#181;g/ mL). In the leaves volatile oil 41 compounds were identified. The sesquiterpenes were in majority (81.7%), followed by monoterpenes (0.8%). The sesquiterpenes &#945;-amorphene (43.6%), E-caryophyllene (17.7%) and germacrene (5.3%) were the main constituents. The oil was little effective against the four tested Leishmania species and slightly more active against L. (L.) infantum chagasi (CE50: 25.97 &#181;g/ mL). However, it was highly active against the trypomastigotes of Trypanosoma cruzi (CE50: 5.31 &#181;g/ mL) showing to be 8.5 times more active than benznidazol. These results stimulate a deeper investigation of those alkaloids as antiprotozoal agents, confirming the importance of the plant species metabolites as a source of new bioactive molecules and their potential as future drugs.

Considerando o grave quadro das doenças negligenciadas, no Brasil e no mundo, e as limitações do tratamento empregado, na atualidade, torna-se urgente a pesquisa de novos fármacos, que sejam mais ativos e seguros. Para tanto, a busca de moléculas-protótipo, a partir de espécies vegetais, tem sido importante estratégia. Neste contexto, foi realizado o estudo de Annona crassiflora Mart. (Annonaceae), cujos alcalóides totais (AT) demonstraram promissora atividade antiprotozoária in vitro, em estudo anterior. Em paralelo, outras espécies de Annona mostraram atividade antimicobacteriana in vitro, igualmente, tendo motivado o presente estudo. Cinco das vinte frações alcaloídicas obtidas, por cromatografia em coluna, a partir dos AT das folhas, apresentaram atividade anti-Leishmania in vitro, tendo causado 100% de morte das formas promastigotas de Leishmania (L.) infantum chagasi. Além disto, três delas foram ativas frente ao Mycobacterium tuberculosis. O isolamento de dois alcalóides noraporfínicos foi realizado, por fracionamento biomonitorado em coluna cromatográfica, seguido de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) semipreparativa. As estruturas dos compostos isolados foram elucidadas empregando-se as análises espectroscópicas de ressonância magnética nuclear, mono e bidimensionais, e por CLAE acoplada à espectrometria de massas (CLAEIES-EM2). Um dos alcalóides foi identificado pela primeira vez, nesta espécie, sendo que o outro apresentou estrutura inédita. Ambos demonstraram significativa atividade anti-Leishmania in vitro (CE50&#8804; 10 &#181; g/ mL) frente às formas promastigotas de L. (L.) infantum chagasi [MHOM/BR/1972/LD]. O primeiro teve maior índice de seletividade (IS: 7,4), em relação à citotoxicidade em células do tecido conjuntivo NCTC Clone 929 de camundongos. Frente ao Mycobacterium tuberculosis (ATCC 27294) e ao M. smegmatis (ATCC 35798), os alcalóides isolados foram inativos (CIM &#8805; 128 &#181;g/ mL). O óleo volátil das folhas foi analisado por cromatografia gasosa acoplada à espectroscopia de massas (CG-EM), tendo sido identificados 41 constituintes, prevalecendo os sesquiterpenos (81,7%) em relação aos monoterpenos (0,8%). Entre os compostos majoritários encontrados no óleo, citam-se os sesquiterpenos &#945;-amorfeno (43,6%), E-cariofileno (17,7%) e o germacreno (5,3%). Nos testes de atividade anti-Leishmania in vitro frente às formas promastigotas de quatro espécies do parasita, o óleo foi mais ativo em L. (L.) infantum chagasi (CE50: 25,97 &#181;g/ mL). Nas formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi mostrou atividade 8,5 vezes superior àquela do fármaco-padrão benznidazol (CE50: 5,31 &#181;g/ mL). Os resultados obtidos ratificaram a importância da prospecção da flora, em particular de A. crassiflora, como fonte potencial de compostos bioativos, que venham a constituir novos fármacos, como alternativa à restrita terapêutica existente para o tratamento das doenças negligenciadas. / Neglected diseases are a serious health problem in Brazil and worldwide. The available drugs are limited in effectiveness with a high toxicity. There is an urgent need of more safe and bioactive compounds. The search of new molecules from plant species is a well known and important strategy to achieve this goal. In a previous work, Annona crassiflora Mart. (Annonaceae) showed a promising antiprotozoal activity. Beside this, other Annona species presented an interesting antimicobacterial action. In this bio-guided study, after the column fractionation of the leaves total alkaloids, in vitro tests were performed and five from twenty fractions were highly active (100% deaths) against promastigotes of Leishmania (L.) infantum chagasi, and only three were active against Mycobacterium tuberculosis. After purification of the bioactive fractions, two noraporphine alkaloids were isolated by HPLC and identified by the usual mono and bidimensional spectroscopic techniques. One of them was isolated from the first time from this species. The other one is a novel chemical entity. Both compounds presented anti- Leishmania activity (CE50 &#8804; 10 &#181;g/ mL) against L. (L.) infantum chagasi [MHOM/BR/1972/LD]. The first one showed a higher selectivity index (SI: 7.4) considering its mice connective tissue cells toxicity [NCTC Clone 929]. However, both were inactive against Mycobacterium tuberculosis (ATCC 27294) and M. smegmatis (ATCC 35798) (CIM &#8805; 128 &#181;g/ mL). In the leaves volatile oil 41 compounds were identified. The sesquiterpenes were in majority (81.7%), followed by monoterpenes (0.8%). The sesquiterpenes &#945;-amorphene (43.6%), E-caryophyllene (17.7%) and germacrene (5.3%) were the main constituents. The oil was little effective against the four tested Leishmania species and slightly more active against L. (L.) infantum chagasi (CE50: 25.97 &#181;g/ mL). However, it was highly active against the trypomastigotes of Trypanosoma cruzi (CE50: 5.31 &#181;g/ mL) showing to be 8.5 times more active than benznidazol. These results stimulate a deeper investigation of those alkaloids as antiprotozoal agents, confirming the importance of the plant species metabolites as a source of new bioactive molecules and their potential as future drugs.