The combination of severe ocular and distal limb malformations is rare. Ophthalmo-acromelic syndrome (OAS; MIM 206920) is characterised by anophthalmia with lower limb oligodactyly. To date <40 cases of this autosomal recessive disorder have been reported. Genome-wide analysis of ~10,000 SNPs typed on two apparently unrelated families - comprising a total of three affected individuals, four unaffected siblings and their consanguineous parents - identified a large region of overlapping autozygosity on chromosome 14q. Adding data from a third consanguineous family gave a combined LOD score of >5 with no evidence of locus heterogeneity. Collaborative data from a further 6 individuals refined the critical interval to a 3.4 Mb region on chromosome14:69,652,605-73,059,612 Mb. To sequence all 19 known protein-coding genes in the region, the 238 exons were ranked by evolutionary sequence conservation and divided equally between the Edinburgh and Nijmegen groups. Complete sequence coverage has been obtained for 61% of the “Edinburgh” exons but no potentially causative mutations have been identified. Further mutation analysis of the OAS locus is on-going. Mice homozygous for the X-ray induced Mp mutation were reportedly anophthalmic with hind limb oligodactyly and thus represented a potential model for human OAS. This line was rederived in Edinburgh and phenotypic analysis of Mp/Mp homozygotes showed runting, malformed pinnae with microphthalmia but not anophthalmia. The apparent hind-limb oligodactyly was due to osseous syndactyly. Mp heterozygotes had milder microphthalmia and pinnae deformities, but lacked the syndactyly. In both heterozygotes and homozygotes the eye malformations were fully penetrant, pan-ocular and characterised by failure of both the ciliary apparatus and vitreous body to form and abnormal retinal lamination. Genome-wide microsatellite marker analysis showed linkage of the Mp phenotype to chromosome 18. Fbn2 mapped within the linkage interval and was a good candidate for Mp based on the finding of hind limb osseous syndactyly in Fbn2-null mice. However, Fbn2-null mice have no eye phenotype. 3’-RACE identified that Mp was as a 660 kb inversion affecting the 3’-regions of Fbn2 and the adjacent gene Isoc1. This created two aberrant reciprocal fusion transcripts: Fbn2 exons 1-63 are fused to Isoc1 exon 5; and Isoc1 exons 1-4 are fused to Fbn2 exons 64-65. This predicts nonsense-mediated decay of the Isoc1 Mp transcript and production of a truncated Fbn2 Mp protein. Ocular development was analysed in homozygote and wild type embryos to define the basis of the “worse than null phenotype” seen in Mp mice. RNA in situ hybridisations (ISH) failed to detect expression of Isoc1 in the embryonic eye. In contrast, normal expression of Fbn2 in the ciliary body and retina was consistent with the Mp phenotype. A combination of EM and immunocytochemistry showed that truncated Fbn2 (Fbn2Mp) was retained within the ER. Fbn2Mp co-localised with markers of ER stress: Grp78 expression and UPR-specific Xbp1 splicing. Signalling by Wnt2b is thought to be critical for ciliary development and Lef1, a Wnt-responsive transcription factor, showed increased and ectopic ocular expression in the region affected by ER stress. Sox2 is a direct transcriptional target of Lef1 and we observed apparent ectopic expression of Sox2 in the ciliary body. Throughout the developing retina in mutant embryos we also observed individual cells that were ectopically expressing the transcription factor Chx10 and other cells expressing the apoptotic marker Activated- Caspase-3. The apoptotic marker did not specifically co-localise with Fbn2Mp. Taken together, these findings suggest that the ocular malformations in Mp are a direct result of the ER stress induced by Fbn2Mp in a specific group of cells in the early ciliary body. The ER stress presumably halts post-translational modification of a developmentally critical signaling molecule, possibly Wnt2b, which happens to be expressed in the same cells. We have termed the resulting pathological mechanism a synodiporic effect (synodiporia = the ones walking the street together or fellow travellers). Such effects may have significant implications for human genetic disease analysis, and may provide an explanation for other “worse than null” mutations.

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La maladie de Stargardt est la plus fréquente des maculopathies héréditaires et peut être regardée comme un modèle juvénile de certaines dégénérescences maculaires liées à l’âge. Elle résulte de mutations récessives du gène ABCA4, responsables d’une accumulation toxique de sous-produits de la vitamine A dans la rétine. Dans ce contexte, des approches thérapeutiques pharmacologiques se développent qui visent à diminuer la concentration de ces composés toxiques par réduction de la concentration rétinienne en vitamine A. L’utilisation de compétiteurs de cette vitamine ont permis d’atteindre cet objectif chez la souris abca4-/-. La souris n’est toutefois pas un bon modèle pour la maladie de Stargardt ; chez l’homme les mutations du gène ABCA4 sont responsables d’une dégénérescence des photorécepteurs maculaires i.e. en majorité des cônes. Or, la souris étant un animal nocturne, sa rétine est particulièrement pauvre en cônes. Au demeurant, alors que la maladie de Stargardt se caractérise par une dégénérescence des photorécepteurs, ceci n’est jamais observé chez la souris abca4-/-, même à un stade avancé, en dépit d’une accumulation des dérivés toxiques de la vitamine A. Ainsi, s’il est possible de réduire l’accumulation de dérivés toxiques de la vitamine A dans la rétine de ces animaux par l’utilisation de compétiteurs, rien ne permet de présager de leur effet neuroprotecteur. Il en est de même pour les essais de thérapie génique qui se développent directement chez le patient faute de modèle animal pertinent.Nos travaux de thèse ont porté sur la création d’un modèle animal plus adéquat. Le rongeur diurne Arvicanthis ansorgei a été choisi en raison de la richesse de sa rétine en cônes et son appartenance à la famille des muridés proches des rongeurs de laboratoire. Nous avons entrepris de produire un animal transgénique par interférence de l’ARN. Après avoir confirmé l’expression d’Abca4 dans les bâtonnets et les cônes de l’animal et caractérisé la séquence de l’ADNc, nous avons recherché une séquence d’ARN antisens et une construction lentivirale permettant d’interférer efficacement sur l’expression du gène abca4 dans les photorécepteurs. Cette dernière étape a abouti avec l’identification du vecteur lentiviral pLKO1 qui a permis la production d’ARN antisens dans les photorécepteurs de souris et de rats transgéniques. En revanche, les séquences ARN antisens utilisées jusqu’alors n’ont pas permis d’interférer efficacement sur l’expression du gène. D’autre part, des protocoles de reproduction assistée ont été développés chez A. ansorgei prenantpour modèle ceux existant chez les rongeurs de laboratoire. Ceci a autorisé l’obtention de nombreux embryons en dépit de nombreuses difficultés rencontrées au cours de ces manipulations à des fins de procréation résultant d’un manque de connaissances du cycle sexuel d’A. ansorgei. L’implantation de ces embryons dans l’oviducte de femelles pseudogestantes s’est heurtée aux mêmes difficultés. Néanmoins le succès de cette entreprise a été obtenu une fois, encourageant à poursuivre ces manipulations dans une cohorte élargie d’animaux.Les anophtalmies et microphtalmies sévères sont des anomalies précoces du développement oculaire. Elles résultent d’un défaut d’induction ou d’invagination de la vésicule optique primaire ou d’un défaut de fermeture de la fente colobomique. Ces malformations sont responsables de grande malvoyance voire de cécité totale. D’origine génétique, elles se transmettent selon tous les modes de transmission. Dans la famille qui a fait l’objet des travaux de ce mémoire, la microphtalmie récessive autosomique s’observait dans deux fratries consanguines réunies par une boucle de consanguinité commune.... / Pas de résumé en anglais

Le syndrome CHARGE est une maladie génétique rare dont l’acronyme désigne les principales anomalies initialement identifiées pour décrire ce syndrome : colobome, problèmes cardiaques, atrésie des choanes, retard mental et de développement, anomalies génitales et défauts aux oreilles. Les patients présentent des combinaisons hautement variables d’anomalies et ce même entre individus d’une même famille. La principale cause de ce syndrome est une mutation du gène CHD7, mais de nouveaux gènes dont la mutation peut également engendrer ce syndrome, tel FAM172A , ont récemment été identifiés. Le modèle murin Toupee porte une mutation dans le gène Fam172a et présente les principales caractéristiques du syndrome CHARGE. Fait intéressant, si FVBToupee présente dans une forte proportion le colobome oculaire, 55% des individus B6ToupeeTg/Tg et 16% des individus B6ToupeeTg/+ présentent de la microphtalmie et de l’anophtalmie. Ces anomalies oculaires ont tout d’abord été caractérisées. Les études menées ont notamment permis d’identifier que chez B6Toupee la microphtalmie et l’anophtalmie sont beaucoup plus fréquentes dans l’œil droit et qu’elles se déclinent en plusieurs degrés variables d’atteinte au globe oculaire. Par la suite, l’étude comparative des modèles ToupeeTg/Tg et Chd7Gt/+a été réalisée dans les fonds génétiques FVB et C57Bl/6. Des différences significatives de pénétrance de même que des divergences phénotypiques ont permis de déterminer que l’identité du gène à l’origine du syndrome CHARGE et que le fond génétique modulent tous deux le développement phénotypique du syndrome CHARGE. Finalement, l’étude de doubles hétérozygotes FVBToupeeTg/+ ;Chd7Gt/+ a permis de confirmer une interaction génétique modérée entre Fam172a et Chd7 tandis que l’investigation de la mortalité néonatale chez Chd7Gt/+ a permis de suspecter des problèmes d’alimentation. / CHARGE syndrome is a rare genetic disease for which the acronym stands for the main characteristics initially identified to describe the syndrome: coloboma, heart problems, choanal atresia, retarded growth and development, genital anomalies and ear defects. Patients present highly variable combinations of anomalies, even between members of the same family. The main cause of this syndrome is a mutation in the CHD7 gene, but new genes whose mutation can also give rise to this syndrome, such as FAM172A, were recently identified. The Fam172a gene is mutated in the Toupee mouse model, which presents the main characteristics of CHARGE syndrome. Interestingly, while FVBToupee animals present coloboma in a strong proportion, 55% of B6ToupeeTg/Tg individuals and 16% of B6ToupeeTg/+ individuals present microphthalmia and anophthalmia. First, detailed characterization of these ocular anomalies revealed that microphthalmia and anophthalmia are much more frequent in the right eye of B6Toupee mice, with varying degrees of severity. Then, comparative analysis of ToupeeTg/Tg and Chd7Gt/+models in FVB and C57Bl/6 genetic backgrounds further revealed significant differences in penetrance and phenotypic presentation, suggesting that the identity of the causative gene and the genetic background both modulate phenotypic outcome of CHARGE syndrome. Finally, characterization of FVBToupeeTg/+;Chd7Gt/+ double heterozygotes confirmed a moderate genetic interaction between Fam172a and Chd7 while investigations of Chd7Gt/+ neonatal mortality allowed to suspect feeding problems.