Depuis plusieurs décennies, l’étude des conséquences des mutations pathogéniques a permisnon seulement de définir l’origine de nombreuses maladies génétiques humaines, héréditaires ou non,mais également de contribuer à l’interprétation de la variabilité phénotypique inter-individus au seind’une pathologie donnée. Les mutations induisant une perte de fonction de la protéine synthétisée ouune protéine incomplète ont été et sont encore les plus étudiées. Avec l’introduction des technologiesde séquençage à haut-débit, le nombre de variants faux-sens, silencieux ou introniques détectés auniveau des gènes humains augmente de façon continue. Distinguer les variations nucléotidiques quivont modifier significativement un phénotype de celles qui seront neutres est un véritable défi pour larecherche.De nombreuses variations nucléotidiques à signification clinique inconnue ont été identifiéesparmi les près de 2000 mutations décrites au niveau du gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembraneconductance Regulator) responsables de la mucoviscidose. Certaines de ces variations vont avoir unimpact sur les transcrits ARN modifiant leur qualité et leur quantité et par conséquent l’expression dugène CFTR. Elles vont notamment affecter l’épissage de l’ARN pré-messager en altérant des signauxreconnus par la machinerie cellulaire et perturber la fidélité de ce mécanisme. Malgré un recul de plusde 20 ans dans la description de la corrélation génotype-phénotype dans cette maladie, de nombreuxphénotypes inattendus et atypiques sont observés. Ils peuvent être dus à des facteurs autres que desvariations génotypiques, mais sans l’accès direct aux transcrits des individus porteurs de tels variants,il est difficile de mesurer les conséquences de ces variations sur la synthèse et la maturation de l’ARN.L’objectif de ce travail de thèse a été de montrer, par des approches in vitro etbioinformatiques, comment des variations nucléotidiques au sein du gène CFTR peuvent impacter surl’épissage de l’ARN pré-messager. Ce travail a permis dans un premier temps la découverte demécanismes d’épissage inattendus modificateurs de phénotypes sévères attendus pour une mutationnon-sens. En effet, par un épissage alternatif subtil de trois nucléotides au niveau d’un site d’épissageen tandem, le codon stop se retrouve délété et aboutit à des transcrits fonctionnels expliquant lesphénotypes modérés. Dans un second temps, nous avons montré que plusieurs mutations non-sensportées par le même exon 15 impactaient différemment sur l’épissage de l’ARN en modifiantsignificativement le taux d’inclusion de cet exon. La connaissance préalable des ratios de transcritsincluant ou non l’exon peut améliorer l’efficacité des traitements correcteurs de codons stopprématurés en les combinant avec des traitements modulateurs de l’épissage augmentant le taux detranscrits correctibles. Dans un troisième et dernier temps, une combinaison d’analyses in silico et invitro des exons du gène CFTR a permis de détecter des exons porteurs de signaux d’épissage plusfaibles les rendant plus sensibles à des mutations exoniques d’épissage. Des mutations faux-sens auniveau de l’exon 3 ont par exemple été montrées comme favorisant l’exclusion de cet exon, diminuantle taux de transcrits fonctionnels.L’ensemble de ces travaux a contribué à comprendre les conséquences de mutations au niveaude l’épissage du gène CFTR sur les variations du phénotype. La connaissance améliorée des variationspossibles du phénotype rattaché à un génotype donné permettra non seulement de prédire l’évolutionde la maladie, mais également d’ajuster et de proposer des thérapies personnalisées selon la mutationportée par le patient. / Over the past decades, studying the consequences of pathogenic mutations has allowed not only todefine the origin of several genetic diseases, but also to contribute to understand the phenotypicvariability between individuals within a disease. The CFTR gene was extensively analyzed since 1989,but among the over 1,900 mutations identified, the current challenge is to classify them as diseasecausingor neutral. These variants of unknown clinical significance (UVs) can alter multiple processes,from gene transcription to RNA splicing or protein function. The CFTR gene needs to include intactversions of all its 27 exons to be functional, and any mutation affecting its splicing process will reducethe amount of functional full-length transcripts. Previous studies have shown that mutations withinsome CFTR exons increase exon skipping. We hypothesized that a number of UVs occurring in otherCFTR exons could indeed affect splicing. By combining in vitro and bioinformatics approaches, weshowed how nucleotide variations within the CFTR gene could impact on the splicing of its premRNA.This work enabled us to provide the first experimental evidence of a premature terminationcodon removal by alternative splicing at a NAGNAG acceptor splice site. This unexpected phenotypemodifyingmechanism explains the much milder phenotype severity than expected for a nonsensemutation. The correction of premature termination codons (PTCs) by agents that promote readthroughrepresents a promising emerging tool for the treatment of many genetic diseases. Having demonstratedthat nonsense mutation could cause aberrant splicing, we postulated that the efficiency of thereadthrough treatment could be due not only to the stop codon itself but also to the amount ofcorrectible transcripts. We showed that a subset of nonsense mutations within the CFTR exon 15 has adifferent impact on the splicing efficiency by modifying the inclusion rate of this exon anddemonstrated that the total amount of transcripts together with the splicing profile should be assessedto anticipate and improve efficacy of readthrough therapy in CF patients. Finally, in order to anticipatethe occurrence of “splicing-causing” mutations, we used a combination of in silico and in vitroanalyses of all CFTR exons and pinpointed those harboring weak splicing signals, which render themmore sensitive to exonic splicing mutations.All these studies contribute to expand our knowledge on the phenotypic variability due to alternativesplicing of the CFTR gene. These studies will lead not only to predict the evolution of a disease, butalso to adjust therapy according to the mutation of each patient.

Résumé non transmis / Summary not transmitted

Les plasmides sont des fragments d'ADN extrachromosomaux largement utilisés en tant qu'outil en biologie moléculaire. Un plasmide code pour sa propre fréquence de réplication et peut être à copies multiples au sein de son hôte (e.g. la bactérie). Il peut aussi apporter à son hôte un avantage sélectif tel que la résistance à un antibiotique, ce qui confère un caractère symbiotique au système hôte-plasmide. Nous voulons explorer : 1-les variations du nombre de copies de plasmides (PCN) afin de comprendre les interactions que le plasmide peut avoir avec son hôte 2- la manière dont se fait la régulation de ce nombre de copies. Nous nous sommes fixés quelques plasmides modèles dans lesquels nous avons inséré le gène d'une protéine fluorescente (mOrange). Ces plasmides ont été injectés dans une bactérie contenant le gène d'un autre rapporteur fluorescent (eGFP) sur son chromosome ce qui nous permet d'avoir une référence au sein de chaque bactérie. Nous avons ensuite observé ces bactéries transformées à l'aide d'un dispositif microfluidique développé au la- boratoire qui nous permet des observations de bas niveau de fluorescence sur des bactéries isolées. Pour chaque plasmide étudié, nous avons pu mesurer son PCN moyen par bactérie au sein de la population. Nous avons aussi évalué son PCN moyen à l'aide de techniques usuelles de biologie moléculaire, et avons obtenu approximativement les mêmes résultats. Nous avons constaté pour certains plasmides des variations d'expression de la mOrange plus grandes que pour la eGFP. Nous attribuons cette augmentation de la variabilité d'expression à la variabilité du PCN. Cette variabilité soit d'autant plus petite que le PCN moyen est grand. Ensuite, nous avons pu extraire des données la variation du PCN au sein de la population. Par ailleurs, nous donnons aussi à l'aide d'une méthode plus approximative la distribution du PCN par bactérie. Finalement, nous avons fait croître les bactéries dans un milieu contenant plus ou moins d'antibiotique dont la résistance est portée par le plasmide. Nous n'avons pas réussi à changer les caractéristiques des plasmides, mais avons pu regarder le phénomène de perte dans un de nos plasmides.

La bilharziose est une maladie parasitaire humaine qui se trouve au second rang mondial, après la malaria, en termes de morbidité et de mortalité induites par le parasite. Plus de 200 millions de personnes sont infestées dans 74 pays et plus de 200 000 personnes décèdent par an (Chitsulo et al. 2004; Gryseels et al. 2006). Schistosoma mansoni, ici étudié, est responsable de la bilharziose intestinale. Ce parasite possède un cycle de vie complexe, passant obligatoirement à travers deux hôtes : un hôte intermédiaire mollusque d'eau douce et un hôte définitif humain ou murin. Lors du cycle de développement, les différents stades sont exposés à divers environnements. Par exemple, les stades larvaires peuvent être confrontés à plusieurs hôtes intermédiaires (souche de mollusque) ou définitifs (humain ou murin). Mes travaux de thèse concernent l'influence de l'environnement sur l'épigénome de Schistosoma mansoni. L'information épigénétique est une source supplémentaire pour la création de variants phénotypiques, nous proposons que certains de ces variants puissent être hérités et sélectionnés, et ainsi conférer un avantage au parasite.Pour investir cette hypothèse nous avons décidé de modifier l'environnement du parasite de façon biotique et abiotique, lorsqu'il se développe au sein de l'hôte définitif ou lorsqu'il est au contact de l'hôte intermédiaire. En effet, Schistosoma mansoni est un endoparasite donc chaque hôte, dans lequel il va se maintenir, représente son environnement direct. Pour cela nous avons utilisé une drogue anti-helminthe et un hôte intermédiaire allopatrique. La réponse du parasite aux différents changements d'environnements a été analysée de la population (traits d'histoire de vie) à la molécule (génome, épigénome, transcriptome). Les nouvelles techniques de biologie moléculaire et de séquençage massif nous ont permis de réaliser des études globales. Lors de ces travaux de thèse, les différentes évolutions expérimentales ont mené à deux énigmes : (1) " Adaptation rapide de Schistosoma mansoni à une drogue anti-helminthes " et (2) " Adaptation rapide de Schistosoma mansoni à l'Amérique du Sud ". Les résultats obtenus pour cette dernière ont amené une troisième énigme : (3) "Différenciation sexuelle en l'absence de gène W-spécifique dans un système ZW"!

La caractérisation phénotypique de l’espèce Torulaspora delbrueckii en conditions œnologiques, à partir de l’étude d’un grand nombre de souches, a permis de mettre en évidence une grande variabilité au sein de cette espèce. En effet, les souches de T.delbrueckii présentent des différences au niveau des durées de phase de latence et de fermentation, des capacités biotiques mais aussi des productions d’éthanol (maximum 12% vol.). Cette variabilité se retrouve également pour la production d’acidité volatile, de glycérol et de certains arômes. Ce travail confirme les faibles productions d’acidité volatile et de glycérol de cette espèce et met en évidence une réponse au stress osmotique différente de celle de l’espèce Saccharomyces cerevisiae. Au final, l’espèce T. delbrueckii présente une grande « pureté » de fermentation et produit peu de composés indésirables comme le sulfure d’hydrogène, les phénols volatils, l’acetoïne, l’acétaldéhyde et le diacétyle. La réalisation de co-inoculations T. delbrueckii / S. cerevisiae sur moûts liquoreux, permet une réduction systématique de l’acidité volatile des vins, en comparaison à une fermentation pure de l’espèce S. cerevisiae, quelque soit la souche de T. delbrueckii utilisée. De plus, la souche T. delbrueckii OXT1 1//2 a permis de complexifier la composition aromatique d’un moût sec issu du cépage Sauvignon blanc (esters fermentaires +25%, phényl-2-éthanol +51% et thiols volatils +31%). Enfin, la mise au point d’un fermenteur à double compartiment, avec une séparation physique des levures tout en conservant l’homogénéité du milieu de culture, a permis d’aborder l’étude des interactions entre ces 2 espèces. Des inhibitions de type « cell-cell contact » ont ainsi été mises en évidence. / The phenotypic characterization of Torulaspora delbrueckii species in enological conditions, using a large number of strains, showed up a wide variability within this species. Indeed, the strains of T. delbrueckii present different fermentative capacities for lag phase and fermentation durations, biotic capacities and ethanol production (up to 12 % vol.). This phenotypic variability is also obtained for the production of volatile acidity, glycerol and certain aroma compounds. This work confirms the low productions of volatile acidity and glycerol of this species and reveals an osmotic stress response distinct from that of Saccharomyces cerevisiae. Finally, the T. delbrueckii species presents a high fermentation purity and produces low levels of undesirable compounds like hydrogen sulfide, volatile phenols, acetoin, acetaldehyde and diacetyl. The realization of co-inoculations T. delbrueckii / S. cerevisiae on high sugar must, allows a systematic reduction of the volatile acidity of wines, in comparison to a pure fermentation of S. cerevisiae. Moreover, co-inoculation with the T. delbrueckii strain OXT1 1 // 2 allowed the increase of aromatic complexity of a Sauvignon blanc dry wine (esters + 25%, 2-phenylethanol +51 % and volatile thiols + 31 %). At last, the development of a fermentor with double compartment allowing a physical separation of yeasts and preserving the homogeneity of culture medium, allowed us to approach the study of yeast interactions. Inhibitions of type “cell-cell contact” have been demonstrated.

Les différents facteurs que sont l'environnement, l'héritabilité et la stochasticité contribuent au développement d'individus différents à partir d'une information génétique donnée. Cette variabilité phénotypique modifie l'action de la sélection naturelle sur la variabilité génétique. Un fil conducteur de ce travail est l'étude de l'impact de la variabilité phénotypique sur les dynamiques d'adaptation. Le premier chapitre expose la conception d'une expérience d'évolution de Escherichia coli dans un environnement structuré. Le trait sélectionné est la resistance aux hautes températures. En particulier, nous étudions les effets de la température sur le chimiotactisme ainsi que l'impact de l'acclimatation sur la croissance et la survie à haute température. Le deuxième chapitre porte sur la réalisation d'un dispositif de mesure de population microbienne à basse concentration. Cette mesure est continue et non invasive et sa limite de détection varie selon l'espèce. Pour l'espèce modèle Escherichia ecoli, la limite est environ 5000/mL soit une amélioration d'un facteur 100 par rapport à la photométrie classique. Dans le troisième chapitre, nous étudions la distribution de la pyoverdine entre les individus d'une population clonale de Pseudomonas aeruginosa. La variabilité de la concentration de ce sidérophore considéré comme un "bien commun'' est beaucoup plus grande que celle attendue et ne peut être expliquée en terme de répartition spatiale ou d'héritabilité. Après avoir caractérisé des fluctuations rapides de la concentration en pyoverdine, nous proposons un modèle de switch phénotypique dans le métabolisme de la pyoverdine qui est en très bonne adéquation avec les observations.

La réponse des traits à l'environnement a été étudiée essentiellement à travers la moyenne des attributs de trait des espèces et des lignées et a récemment été étendue à la variabilité intraspécifique. Cependant, les traits peuvent également répondre aux contraintes de l‟environnement par (i) une forte détermination mutuelle des traits au sein des individus ou des populations, i.e. une forte intégration phénotypique, et (ii) une faible variation des traits au sein de lignées phylogénétiques entières. Nous avons testé : (i) les effets de l'environnement abiotique et biotique sur l'intégration phénotypique chez des espèces végétales subantarctiques et les conséquences écologiques et biogéographiques d'une forte intégration phénotypique, et (ii) les effets de l‟environnement abiotique et biotique sur la variabilité phénotypique réalisée au sein des genres d'Angiospermes de l'Europe Centrale. Pour le premier aspect, nous avons constaté que l'intégration phénotypique est plus forte en conditions abiotiques stressantes. Le renforcement de l'intégration phénotypique se produit sur de petites échelles spatiales et peut limiter la flexibilité à grande échelle des stratégies de croissance et de reproduction. Nous avons également montré que la forte intégration phénotypique et environnementale peut contribuer à l'endémisme de certaines espèces subantarctiques, probablement par une spécialisation sur le long terme de ces espèces à leur habitat. Pour le second aspect, nous avons observé que la variabilité phénotypique réalisée au sein des genres de l'Europe Centrale est plus élevée dans des conditions abiotiques intermédiaires, ce qui reflète une plus grande indépendance des traits vis-à-vis de l'environnement abiotique. Nous avons également montré que le nombre d'espèces en coexistence est très conservé au sein des genres. Un niveau intermédiaire de coexistence semble coïncider avec à la fois une position intermédiaire des genres le long de gradients abiotiques et une plus grande variabilité de certains traits. Ceci suggère un rôle des interactions biotiques nombreuses, mais toujours prévisibles, pour le maintien (ou l'évolution) de niveaux élevés de variabilité des traits au sein des clades. Finalement, l'ensemble de nos résultats suggèrent que la capacité des espèces à répondre aux variations de l'environnement pourrait être fortement limitée aussi bien au niveau des phénotypes individuels qu'à l'échelle des clades entiers, notamment dans des environnements abiotiques et biotiques extrêmes.

La forte variation climatique, notamment de la température qui est associée à la distribution altitudinale de certains peuplements d'arbres forestiers peut induire des pressions de sélection divergentes favorisant l'expression de phénotypes différents en fonction de l'altitude. Cette thèse a pour objectif de déterminer si des adaptations locales existent et peuvent être mises en évidence dans un peuplement de mélèze (Larix decidua Mill.) distribué le long d'un gradient altitudinal situé dans les Alpes françaises, à proximité de Briançon. Quatre placettes d'environ 200 mélèzes ont été délimitées à 2300 m, 2000 m, 1700 m et 1350 m d'altitude le long de ce gradient. Une variabilité phénotypique significative a été observée entre ces niveaux altitudinaux pour la plupart des caractères étudiés : circonférence, hauteur de l'arbre, pourcentage d'aubier ainsi que pour toutes les variables microdensitométriques de cernes sauf une (la largeur de cerne). Une analyse de génétique des populations utilisant des marqueurs microsatellites a mis en évidence une faible influence de la dérive génétique sur la diversité génétique et une forte intensité de flux de gènes entre les différents niveaux altitudinaux étudiés. La différenciation génétique inter-altitudes a été estimée à l'aide d'une approche in-situ basée sur les données phénotypiques seules (PST) et comparée à la différenciation observée à l'aide des marqueurs microsatellites (FST). Cette analyse indique que l'hypothèse d'adaptations locales avec l'altitude peut être raisonnablement avancée pour les caractères de hauteur, circonférence, pourcentage d'aubier et densité du bois initial. Au contraire, l'adaptation locale n'apparait pas comme une hypothèse acceptable pour les caractères de largeur de cerne, surface de cerne, largeur du bois final et densité du bois final.

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie à transmission autosomale dominante causée par une répétition trinucléotidique CTG située dans la région 3’ non-traduite du gène dystrophia myotonica protein kinase (DMPK). La prévalence mondiale de la DM1 est de 8,26 personnes atteintes par 100 000 habitants : celle-ci est presque 20 fois plus importante au Saguenay-Lac-St-Jean en raison d’un effet fondateur. La présentation clinique de la DM1 peut comprendre divers symptômes dont de la faiblesse musculaire, de la myotonie, des cataractes, de l’insuffisance respiratoire, de l’arythmie cardiaque, de l’hypersomnolence et des troubles cognitifs et endocriniens. Par ailleurs, une grande variation dans la présence et la sévérité de ces symptômes est observée chez les patients et celle-ci n’est qu’en partie expliquée par la longueur des répétitions CTG. Plusieurs mécanismes pourraient expliquer la variabilité inexpliquée dont les défauts d’épissage, la mauvaise régulation des facteurs de transcription, la traduction non-ATG associée aux répétitions et les modifications épigénétiques, en particulier la méthylation de l’ADN. L’objectif de ce projet était donc d’évaluer l’impact de la méthylation de l’ADN au locus DMPK sur la variabilité phénotypique des patients atteints de DM1. Nous rapportons que la méthylation de l’ADN mesurée en amont et en aval de la répétition CTG est respectivement corrélée négativement et positivement avec la longueur de la répétition CTG. La présence d’une interruption de la répétition est associée à un niveau plus élevé de méthylation de l’ADN. À l’aide de modèles de régression linéaire multiple, nous démontrons que la méthylation de l’ADN contribue significativement et indépendamment de la longueur des répétitions CTG, à expliquer la variabilité́ de la force des dorsifléchisseurs de la cheville, de la force de préhension, de la force des pinces, de la capacité́ vitale forcée, du débit expiratoire de pointe, de la pression expiratoire et inspiratoire maximale. La méthylation de l’ADN explique une fraction de la variabilité phénotypique en DM1 et en association avec la longueur de la répétition CTG pourrait aider à améliorer la prédiction de la progression de la maladie chez ces patients. / Abstract : Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is an autosomal dominant disorder caused by a CTG repeat extension in the 3’ untranslated region of the dystrophia myotonica protein kinase (DMPK) gene. Worldwide, the prevalence of DM1 is 8.26 affected persons per 100 000 persons, but it goes up to 158 affected persons per 100 000 in the Saguenay-Lac-St-Jean region of the province of Quebec (Canada) due to a founder effect. Clinical presentation includes muscular weakness, myotonia, cataracts, respiratory insufficiency, cardiac arrhythmia, hypersomnolence and endocrine and cognitive problems. There is a large variability in the presence and severity of these symptoms that is only partially explained by the CTG repeat length. Many mechanisms such as splicing defects, impaired regulation of transcription factors, repeat-associated non-ATG translation and epigenetic modifications, including DNA methylation, may explain this variability. The objective of this study was to assess the impacts of DNA methylation measured at the DMPK gene locus on phenotypic variability in DM1. We report that DNA methylation upstream of the repeat was negatively correlated with CTG repeat length whereas downstream DNA methylation was positively correlated. The presence of a variant repeat within the CTG repeat was associated with a higher level of DNA methylation. Linear multiple regression models support that DNA methylation contributes significantly and independently of the CTG repeat length to the variability of the ankle dorsiflexor, grip and pinch strengths, as well as forced vital capacity, peak expiratory flow and maximal inspiratory and expiratory pressures. DNA methylation could thus explain part of the phenotypic variability in DM1 and, together with CTG repeat length, could help improve the prediction of the progression of the disease.

La forte variation climatique, notamment de la température qui est associée à la distribution altitudinale de certains peuplements d’arbres forestiers peut induire des pressions de sélection divergentes favorisant l’expression de phénotypes différents en fonction de l’altitude. Cette thèse a pour objectif de déterminer si des adaptations locales existent et peuvent être mises en évidence dans un peuplement de mélèze (Larix decidua Mill.) distribué le long d’un gradient altitudinal situé dans les Alpes françaises, à proximité de Briançon. Quatre placettes d’environ 200 mélèzes ont été délimitées à 2300 m, 2000 m, 1700 m et 1350 m d’altitude le long de ce gradient. Une variabilité phénotypique significative a été observée entre ces niveaux altitudinaux pour la plupart des caractères étudiés : circonférence, hauteur de l’arbre, pourcentage d’aubier ainsi que pour toutes les variables microdensitométriques de cernes sauf une (la largeur de cerne). Une analyse de génétique des populations utilisant des marqueurs microsatellites a mis en évidence une faible influence de la dérive génétique sur la diversité génétique et une forte intensité de flux de gènes entre les différents niveaux altitudinaux étudiés. La différenciation génétique inter-altitudes a été estimée à l’aide d’une approche in-situ basée sur les données phénotypiques seules (PST) et comparée à la différenciation observée à l’aide des marqueurs microsatellites (FST). Cette analyse indique que l’hypothèse d’adaptations locales avec l’altitude peut être raisonnablement avancée pour les caractères de hauteur, circonférence, pourcentage d’aubier et densité du bois initial. Au contraire, l’adaptation locale n’apparait pas comme une hypothèse acceptable pour les caractères de largeur de cerne, surface de cerne, largeur du bois final et densité du bois final. / The strong climatic variation, in particular the temperature variation, which is associated with the altitudinal distribution of certain stands of forest trees, can induce different divergent selection pressure favoring altitude-dependent phenotype expression. The aim of the present thesis is to determine if local adaptation exists and can be identified in an European larch stand (Larix decidua Mill.) distributed along an altitudinal gradient located in the French Alps near Briançon. four plots of about 200 larches were delimited at 2300 m, 2000 m, 1700 m and 1350 m along this altitudinal gradient. A significant phenotypic variability was observed between these altitudinal levels for most characters studied: circumference, tree height, percentage of sapwood and for all the annual-ring microdensity variables except one (ring width). A population genetics analysis using microsatellite markers showed a small effect of genetic drift on the genetic diversity but an intensive gene flow between the altitudinal levels studied. The inter-altitudinal genetic differentiation was estimated using an in-situ approach based on phenotypic data only (PST) and compared with the differentiation observed by means of microsatellite markers (FST). This analysis indicates that the assumption of local adaptation with altitude can be reasonably proposed for the characters of height, circumference, percentage of sapwood and earlywood density. On the contrary, the local adaptation does not appear to be an acceptable assumption concerning characters such as ring width, ring surface area, latewood width and latewood density.