Les potentialités liées aux cultures mixtes de micro-organismes sont immenses et ouvrent de vastes possibilités pour l’innovation dans les bioprocédés. Cependant, étant donné la complexité des phénomènes régulant la physiologie d’un seul micro-organisme, leur mise en oeuvre en culture mixte est d’autant plus difficile à maîtriser que des interactions entre ces micro-organismes viennent s’ajouter. Le travail présenté dans ce manuscrit est une étude d'un couple de levures oenologiques constitué de Saccharomyces cerevisiae et de Torulaspora delbrueckii. Son objectif est d'acquérir des informations expérimentales afin d’analyser et in fine modéliser l'évolution des cultures pures et des cultures mixtes. L'analyse des données expérimentales acquises lors des cultures pures de chaque levure a permis de quantifier l'effet favorable de la concentration initiale d'azote assimilable sur la croissance et la vitesse de fermentation des deux levures. Elle a aussi mis en évidence une prolongation de la phase de latence de T. delbrueckii induite par une augmentation des facteurs anaérobies. Les cultures mixtes ont été réalisées en présence et en absence de membrane de séparation permettant ainsi d'observer les effets du contact physique sur l'évolution des cocultures. Le contact physique influence la dynamique des populations. En culture mixte, S. cerevisiae domine T. delbrueckii dans un milieu synthétique classique. Une augmentation de la concentration initiale de facteurs anaérobies inverse complètement cette domination. L'analyse des résultats expérimentaux nous a orienté vers le développement d'un modèle «stoechio-cinétique» structuré dans lequel l'azote assimilé par la levure se répartit en deux compartiments: le compartiment constitutif et le compartiment de stockage. Ce modèle a permis une représentation fidèle des cinétiques observées en culture pure. La prise en compte des interactions s'est faite en intégrant la compétition pour les substrats, les interactions indirectes et les interactions directes. L'ensemble des hypothèses émises lors de ce travail de modélisation souligne la nécessité d'approfondir les connaissances scientifiques concernant le métabolisme deT. delbrueckii en anaérobiose stricte et l'effet des facteurs anaérobies sur les interactions microbiennes.

Les potentialités liées aux cultures mixtes de micro-organismes sont immenses et ouvrent de vastes possibilités pour l’innovation dans les bioprocédés. Cependant, étant donné la complexité des phénomènes régulant la physiologie d’un seul micro-organisme, leur mise en oeuvre en culture mixte est d’autant plus difficile à maîtriser que des interactions entre ces micro-organismes viennent s’ajouter. Le travail présenté dans ce manuscrit est une étude d'un couple de levures oenologiques constitué de Saccharomyces cerevisiae et de Torulaspora delbrueckii. Son objectif est d'acquérir des informations expérimentales afin d’analyser et in fine modéliser l'évolution des cultures pures et des cultures mixtes. L'analyse des données expérimentales acquises lors des cultures pures de chaque levure a permis de quantifier l'effet favorable de la concentration initiale d'azote assimilable sur la croissance et la vitesse de fermentation des deux levures. Elle a aussi mis en évidence une prolongation de la phase de latence de T. delbrueckii induite par une augmentation des facteurs anaérobies. Les cultures mixtes ont été réalisées en présence et en absence de membrane de séparation permettant ainsi d'observer les effets du contact physique sur l'évolution des cocultures. Le contact physique influence la dynamique des populations. En culture mixte, S. cerevisiae domine T. delbrueckii dans un milieu synthétique classique. Une augmentation de la concentration initiale de facteurs anaérobies inverse complètement cette domination. L'analyse des résultats expérimentaux nous a orienté vers le développement d'un modèle «stoechio-cinétique» structuré dans lequel l'azote assimilé par la levure se répartit en deux compartiments: le compartiment constitutif et le compartiment de stockage. Ce modèle a permis une représentation fidèle des cinétiques observées en culture pure. La prise en compte des interactions s'est faite en intégrant la compétition pour les substrats, les interactions indirectes et les interactions directes. L'ensemble des hypothèses émises lors de ce travail de modélisation souligne la nécessité d'approfondir les connaissances scientifiques concernant le métabolisme deT. delbrueckii en anaérobiose stricte et l'effet des facteurs anaérobies sur les interactions microbiennes. / The potentialities associated with cultures of mixed micro-organisms are tremendous and offergreat opportunities for innovation in bioprocesses. The phenomena regulating the physiology of asingle micro-organism are complicated. Furthermore, the eventual additional interactions between two micro-organisms make their implementation in mixed culture difficult to control. The workpresented in this manuscript is a study of a couple of oenological yeasts composed of Saccharomyces cerevisiae and Torulaspora delbrueckii. Its objective is to acquire experimentaldata in order to analyse and ultimately model the evolution of pure and mixed cultures. The analysis of experimental data acquired during the pure cultures of each yeast enable to quantifythe favorable effect of the initial concentration of assimilable nitrogen on the growth and fermentation rate of the two yeasts. It also shows an extended latency phase of T. delbrueckiiinduced by an increase in anaerobic factors. The mixed cultures were carried out in the presenceand absence of separation membrane in order to observe the effects of physical contact on theevolution of cocultures. Physical contact influences population dynamics. In mixed culture, S.cerevisiae dominates T. delbrueckii in a classical synthetic medium. An increase in the initialconcentration of anaerobic factors completely reverses this domination. The analysis of the experimental results has directed us towards the development of a structured stochiometric andkinetic model in which the nitrogen assimilated by the yeast is partitioned into two compartments:the constitutive compartment and the storage compartment. This model faithfully represents thekinetics observed in pure culture. The consideration of interactions was done by integrating competition for substrates, indirect interactions and direct interactions. All the hypotheses emitted during this modelling work underline the need to deepen the scientific knowledge concerning T.delbrueckii metabolism under strict anaerobic conditions and the effect of anaerobic factors onmicrobial interactions

O crescimento do mercado de cervejas artesanais tem demandado inovações. Uma abordagem que se destaca neste contexto é o uso de leveduras não convencionais em processos controlados de fermentação. Para ter melhores resultados neste cenário é fundamental que o produtor conheça as capacidades e limitações das leveduras que serão utilizadas na produção de cervejas. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar características fisiológicas, essenciais e complementares, de uma cepa de Brettanomyces anomalus e uma Torulaspora delbrueckii para a produção de cervejas, comparando-as com duas cepas de Saccharomyces cerevisiae já utilizadas na indústria cervejeira. Avaliou-se o perfil cromossômico das leveduras (cariotipagem), a capacidade de crescimento em diferentes substratos e fontes de carbono, bem como em diferentes concentrações de etanol e compostos de lúpulo, a capacidade de esporulação, floculação, produção de sulfeto de hidrogênio (H2S), formação de espuma e a evolução da fermentação em função do tempo. Foram observadas diferenças entre os padrões cromossômicos das quatro leveduras. A intensidade de produção de H2S foi maior para a B. anomalus (WLP640) quando comparada com T. delbrueckii (WLP603), que foi classificada com a mesma intensidade de produção da S-33 (S. cerevisiae). As duas leveduras não convencionais atenderam às características fisiológicas essenciais para fermentação de cervejas. A B. anomalus foi capaz de metabolizar diversas fontes de carbono, como glicose, frutose, sacarose, maltose, matotriose e celobiose, ao passo que a T. delbrueckii cresceu apenas em glicose, frutose e sacarose, apontando sua potencial aplicação para produção de cervejas com teor alcoólico reduzido ou seu uso em inoculações sequenciais ou co-inoculações com outras leveduras. Ambas apresentaram crescimento em teores alcoólicos de 4% e 8%, ao passo que T. delbrueckii tolerou maior concentração de compostos do lúpulo em relação à B. anomalus, que não foi capaz de crescer em meio com as maiores concentrações combinadas de álcool (8% v/v) e α-ácidos (80 mg/L). Os resultados permitem concluir que as leveduras B. anomalus e T. delbrueckii possuem potencial para a produção de cervejas, desde que seja observada a compatibilidade de suas características fisiológicas com a expectativa acerca das características da cerveja. / The booming in the craft beer market worldwide has demanded innovations to bring up distinctive products. An approach that stands out in this context is the use of non-conventional yeasts in controlled beer fermentation processes. To have better outcomes in this scenario, it is essential that the producer knows the capabilities and limitations of those yeasts. Thus, this study aimed to assess essential and complementary physiological traits of one strain of Brettanomyces anomalus and one of Torulaspora delbrueckii for beer brewing, comparing them with two Saccharomyces cerevisiae strains already used in commercial breweries. The characteristics assessed were chromosome profile (karyotyping technique), growth capacity in different substrates and carbon sources, as well as under different concentrations of ethanol and hop compounds, the capability of sporulation, flocculation, hydrogen sulfide (H2S) production and foam formation and, finally, the fermentation evolution pattern. Differences in the chromosomal profile were observed among the four strains. The potential for H2S production was higher for B. anomalus (WLP640) when compared to T. delbrueckii (WLP603), which had the same potential than S-33 (S. cerevisiae). Both non-conventional yeasts have met the essential physiological traits demanded to carry beer wort fermentation. B. anomalus was able to metabolize many of the assessed carbon sources, as glucose, fructose, sucrose, maltose, maltotriose and cellobiose, while the T. delbrueckii strain was able to grow only in glucose, fructose and sucrose, pointing its potential application for low alcohol beer production, as well as its use in sequential inoculations or co-inoculations with other yeasts. Both showed satisfying growth under alcohol contents of 4% and 8%. T. delbrueckii tolerated higher hop compounds concentration when compared to B. anomalus, that was unable to grow at the highest combined concentrations of ethanol (8% v/v) and α-acids (80 mg/L). The results lead to the conclusion that the yeasts B. anomalus and T. delbrueckii can be explored in beer brewing, provided that an alignment between their physiological traits and the expectations around the beer characteristics are observed.

La caractérisation phénotypique de l’espèce Torulaspora delbrueckii en conditions œnologiques, à partir de l’étude d’un grand nombre de souches, a permis de mettre en évidence une grande variabilité au sein de cette espèce. En effet, les souches de T.delbrueckii présentent des différences au niveau des durées de phase de latence et de fermentation, des capacités biotiques mais aussi des productions d’éthanol (maximum 12% vol.). Cette variabilité se retrouve également pour la production d’acidité volatile, de glycérol et de certains arômes. Ce travail confirme les faibles productions d’acidité volatile et de glycérol de cette espèce et met en évidence une réponse au stress osmotique différente de celle de l’espèce Saccharomyces cerevisiae. Au final, l’espèce T. delbrueckii présente une grande « pureté » de fermentation et produit peu de composés indésirables comme le sulfure d’hydrogène, les phénols volatils, l’acetoïne, l’acétaldéhyde et le diacétyle. La réalisation de co-inoculations T. delbrueckii / S. cerevisiae sur moûts liquoreux, permet une réduction systématique de l’acidité volatile des vins, en comparaison à une fermentation pure de l’espèce S. cerevisiae, quelque soit la souche de T. delbrueckii utilisée. De plus, la souche T. delbrueckii OXT1 1//2 a permis de complexifier la composition aromatique d’un moût sec issu du cépage Sauvignon blanc (esters fermentaires +25%, phényl-2-éthanol +51% et thiols volatils +31%). Enfin, la mise au point d’un fermenteur à double compartiment, avec une séparation physique des levures tout en conservant l’homogénéité du milieu de culture, a permis d’aborder l’étude des interactions entre ces 2 espèces. Des inhibitions de type « cell-cell contact » ont ainsi été mises en évidence. / The phenotypic characterization of Torulaspora delbrueckii species in enological conditions, using a large number of strains, showed up a wide variability within this species. Indeed, the strains of T. delbrueckii present different fermentative capacities for lag phase and fermentation durations, biotic capacities and ethanol production (up to 12 % vol.). This phenotypic variability is also obtained for the production of volatile acidity, glycerol and certain aroma compounds. This work confirms the low productions of volatile acidity and glycerol of this species and reveals an osmotic stress response distinct from that of Saccharomyces cerevisiae. Finally, the T. delbrueckii species presents a high fermentation purity and produces low levels of undesirable compounds like hydrogen sulfide, volatile phenols, acetoin, acetaldehyde and diacetyl. The realization of co-inoculations T. delbrueckii / S. cerevisiae on high sugar must, allows a systematic reduction of the volatile acidity of wines, in comparison to a pure fermentation of S. cerevisiae. Moreover, co-inoculation with the T. delbrueckii strain OXT1 1 // 2 allowed the increase of aromatic complexity of a Sauvignon blanc dry wine (esters + 25%, 2-phenylethanol +51 % and volatile thiols + 31 %). At last, the development of a fermentor with double compartment allowing a physical separation of yeasts and preserving the homogeneity of culture medium, allowed us to approach the study of yeast interactions. Inhibitions of type “cell-cell contact” have been demonstrated.

Thesis (MTech (Chemistry))--Cape Peninsula University of Technology, 2016. / Wines contain a number of phenolic compounds, belonging to non-flavonoid and flavonoid complexes. Phenolic compounds in wine are responsible for wine colour, astringency, and bitterness. Saccharomyces cerevisiae yeast is normally used in winemaking but it has been proved to decrease the phenolic content in wines. Current research on the use of non-Saccharomyces yeast in winemaking has produced better quality wines than S. cerevisiae yeast therefore improving the sensory profile of wine. This study evaluated effect of Torulaspora delbrueckii yeast on the phenolic content of experimental wines derived from Chenin blanc grapes. A reversed phase high-performance liquid chromatographic (RP-HPLC) method was used for the identification and quantitation of the phenolic compounds. The difference test method was used to determine the sensory attributes of wines. The data was subjected to analysis of variance to compare treatment differences between the wines and principal component analysis to establish possible correlation between the data sets. Furthermore, a gas chromatographic-flame ionization detection method (GC-FID) was used for the quantification of volatile compounds in the wines. In this work, wines made with T. delbrueckii strain M2/1 had high concentration of (+)-catechin, caffeic acid, ferulic acid and p-coumaric acid in all studied vintages. Wines made with VIN13 had higher concentrations of flavan-3-ols, compared to wines made with M2/1 and 654. In sensory evaluation, M2/1 wines were prominent in astringency and complexity. Yeast strain M2/1, also attributed to body and complexity of the wine. However, in this study no correlations were observed between the phenolic content and sensory attributes and vice versa. The quality of wine cannot be concluded by chemical or sensory analysis alone, but the data sets are complementary. Although the phenolic concentration of wines made with S. cerevisiae strain (VIN 13) and T. delbrueckii (M2/1) were similar in measured phenolic concentrations, they had different sensory attributes. Wines made during the 2013 vintage indicated the importance of the use of a strain with higher enzyme activity and high fermentation rate. There is minimal to no skin contact in white winemaking. Therefore, the use of a yeast strain with an increased enzyme activity can facilitate the extraction of phenolics from grape, resulting in wine with improved quality.

L'utilisation de souches de levures sélectionnées pour réaliser la FA est une pratique très répandue en œnologie. Après le développement de l'utilisation de levains de souche pure de Saccharomyces, l'innovation est aujourd'hui dans la mise en œuvre de levains mixtes de Saccharomyces et de non-Saccharomyces qui permettent de diversifier les produits finaux obtenus. La problématique réside dans l'existence d'interactions entre les souches rendant difficile la maîtrise de la fermentation. T. delbrueckii présente dans la flore indigène du mout de raisin est une des levures non-Saccharomyces les plus appropriées pour entrer dans la composition de ces levains mixtes. En effet, elle présente une bonne capacité fermentaire et peut permettre d'augmenter la complexité aromatique du vin ou encore de réduire son acidité volatile. L'objectif de ce travail était d'étudier les interactions pendant la FA entre des souches sélectionnées pour l'oenologie : une T. delbrueckii et une S. cerevisiae. Pour cela des expériences ont été réalisées dans des milieux synthétiques simulant le moût de raisins blancs. Le comportement des souches pures a tout d'abord été caractérisé. Il a été montré que la souche S. cerevisiae avait de meilleures performances fermentaires d'un point de vue cinétique que la souche T. delbrueckii. Toutefois, T. delbrueckii a montré des capacités acceptables pour épuiser les sucres et surtout a permis d'obtenir des profils aromatiques différents. Le comportement vis-à-vis de l'oxygénation des moûts de ces deux levures est assez semblable, T. delbrueckii étant cependant beaucoup plus sensible à ce paramètre que S. cerevisiae. L'interaction entre ces deux levures a ensuite était étudiée dans un bioréacteur à membrane sous anaérobie stricte dans différentes conditions : composition en azote assimilable du milieu et stratégie d'inoculation. Il a été clairement mis en évidence que T. delbrueckii était affectée par la présence de S. cerevisiae. Le type d'interaction soupçonné est celui d'amensalisme lié à l'excrétion par S. cerevisiae d'un constituant toxique pour T. delbrueckii. Dans ces conditions, la stratégie d'inoculation recommandée est l'ensemencement séquentiel des levures : T. delbrueckii en début de fermentation, puis l'ajout de S. cerevisiae 48 h après. Ceci permet à T. delbrueckii de se développer et d'exprimer son potentiel aromatique avant que S. cerevisiae ne soit introduit pour assurer une fin rapide de la fermentation. Toutefois, nous avons montré que même dans ces conditions, l'implantation de T. delbrueckii n'était pas garantie car, le moût n'étant pas stérile, une présence, même faible, de S. cerevisiae dans la flore naturelle peut inhiber sa croissance. Par ailleurs, il a été mis en évidence que dans les mouts à faible teneur en azote initial, ce constituant pouvait être épuisé au moment de l'inoculation de S. cerevisiae. Dans ces conditions, S. cerevisiae ne peut se développer et l'achèvement de la fermentation est alors problématique. / The use of the selected yeast strains to realize the alcoholic fermentation is very prevalent practice in vinification. After the development of utilization of the preparation of pure Saccharomyces cerevisiae strain, the innovation is now to apply the mixte starter cultures of Saccharomyces and non-Saccharomyces that allow to diversifying the obtained final products. The problem resides in the existence of interactions between the strains giving the difficulty to controle the fermentation. Torulaspora delbrueckii present in the indigenous flora of the grape must is one of the most appropriate non-Saccharomyces yeasts to enter in the composition of these multistater cultures. In fact, this strain has been presented a good fermentative capacity and could allow to increasing not only the aromatic complexity of wine, but also to reducing its volatile acidity. The objective of our work is to study the interactions during the alcoholic fermentation between the selected strains for enology: one T. delbrueckii and one S. cerevisiae. For this reason, the experiments were realized in the synthetic mediums simulated to the white grape must. The behaviours of the pure strains were firstly characterized. It was shown that the S. cerevisiae strain had the best fermentative performances, a critical point in comparaison with the T. delbrueckii strain. Nevetheless, T. delbrueckii showed the acceptable capacities to exhaust the sugars and especially to allow us to obtain the different aromatic profiles to that of S. cerevisiae. The behaviour via the oxygenation to the musts of these two yeasts is enough close, T. delbrueckii being however much more sensible to that parameter than . cerevisiae. The interactions between these two yeasts were then studied in a membrane bioreacteur under strict anaerobie in different conditions: composition in assimilable nitrogen of the medium and strategy of inoculation. It has been clearly demonstrated that T. delbrueckii has been affected by the presence of S. cerevisiae. The suspected type of this interaction is the amensalism one bound to a toxic compound excreted by S. cerevisiae. In these conditions, the recommended inoculation strategy is the sequential culture of these yeasts: T. delbrueckii at the beginning of the fermentation, then the addition of S. cerevisiae after 48 h. This allows T. delbrueckii to develop and express its potentiel of aromatic production before the S. cerevisiae is introduced to assure a rapid finish of the fermentation. However, we showed that even in these conditions, T. delbrueckii growth has been not guaranteed because of, since the must is not sterilized, a presence even small of S. cerevisiae in the natural flore can inhibite the croissance of the former. It has been also demonstrated that in the must with low intitial nitrogen content, this compound could be exhausted at the moment of the S. cerevisiae inoculation. In these conditions, S. cerevisiae can not develop and the achievement of the fermentation is yet problematic.