Submitted by Automação e Estatística (sst@bczm.ufrn.br) on 2018-08-01T21:41:21Z No. of bitstreams: 1 LuanTalesCostaDePaivaVasconcelos_DISSERT.pdf: 4667942 bytes, checksum: f1d92bcd962e6d65e62dd7943ddbeeca (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2018-08-03T20:28:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 LuanTalesCostaDePaivaVasconcelos_DISSERT.pdf: 4667942 bytes, checksum: f1d92bcd962e6d65e62dd7943ddbeeca (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-03T20:28:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LuanTalesCostaDePaivaVasconcelos_DISSERT.pdf: 4667942 bytes, checksum: f1d92bcd962e6d65e62dd7943ddbeeca (MD5) Previous issue date: 2018-02-23 / Com cerca de 900.000 a 1,3 milhões de novos casos anualmente, a Leishmaniose é um complexo de doenças que pode ser fatal se não dada a devida atenção. Apesar de sua relevância na saúde pública, ainda não existe uma vacina capaz de prevenir a doença em humanos, e seu tratamento é caro e agressivo à saúde. O presente estudo tem como objetivo otimizar os parâmetros de indução do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi expresso em Escherichia coli recombinante. Dessa forma, para a indução foi utilizada a lactose nas concentrações de 0,1; 1,0 e 10 g/L, e o isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) nas concentrações de 20,0; 100,0; 500,0 e 1000,0 M como moléculas indutoras em diferentes densidades celulares (densidade óptica a 600 nm de 0,5 e 1,0) de modo a analisar a influência do instante de indução no rendimento da proteína de interesse. Os resultados mostraram que a concentração de IPTG de 100,0 M foi a que mais favoreceu a produção do antígeno (0,087 g/L), sendo esta concentração de IPTG 10 vezes menor do que utilizada em trabalhos anteriores para esse tipo de sistema, e para a lactose foi a de 1,0 g/L (0,016 g/L). Dessa forma, a indução com 100,0 M de IPTG permitiu obter o antígeno 503 com uma concentração 5,6 vezes maior que a máxima obtida quando a lactose foi usada como indutor. / With nearly 900,000 to 1.3 million new cases annually, Leishmaniosis is a complex of diseases that can be fatal if not given proper attention. Despite its relevance in the public health system, there is no vaccine capable of preventing disease in humans so far, and its treatment is expensive and aggressive to human health. Vaccination remains the most practical and realistic way of fight against the disease, thus, the production of recombinant antigens as a pathway towards a vaccine acquisition is necessary. In addition, the optimization of the strategy of the recombinant antigen’s production is of interest so it can make the process viable. Therefore, the present study aims to optimize the induction parameters of the 503 Leishmania i. chagasi antigen expressed in recombinant Escherichia coli. Hence, the induction at different cell densities (optical density at 600 nm of 0.5 and 1.0) was evaluated in order to analyse the influence of the induction time on the yield of the protein of interest. In this segment, lactose and isopropyl-β-Dthiogalactopyranoside (IPTG) were used as inducer molecules, using various concentrations: 0.1 g/L, 1.0 g/L and 10 g/L for lactose and 20 μM, 100 μM, 500 μM and 1000 μM for IPTG. The results presented that the concentration of IPTG that obtained the higher antigen levels was that of 100 μM (0.087 g/L), a 10-fold lower concentration than was being previously used in this type of system, and for lactose it was 1 g/L (0.016 g/L). Thus, the induction with 100 μM allowed to obtain the antigen with a concentration 5.6 times higher than the lactose induction maximum concentration.

Submitted by Automação e Estatística (sst@bczm.ufrn.br) on 2018-05-02T23:09:42Z No. of bitstreams: 1 VitorTroccoliRibeiro_DISSERT.pdf: 3222596 bytes, checksum: 3c00f5a502043e131a9b815409cc4fc9 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2018-05-07T23:08:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 VitorTroccoliRibeiro_DISSERT.pdf: 3222596 bytes, checksum: 3c00f5a502043e131a9b815409cc4fc9 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-07T23:08:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 VitorTroccoliRibeiro_DISSERT.pdf: 3222596 bytes, checksum: 3c00f5a502043e131a9b815409cc4fc9 (MD5) Previous issue date: 2018-02-23 / A leishmaniose visceral é uma doença infecto-parasitária causada por protozoários do gênero Leishmania, podendo ser letal quando não há tratamento adequado. Estima-se que existem 12 milhões de pessoas infectadas pela doença, mas infelizmente não há nenhuma vacina capaz de prevenir a doença. Ademais, o tratamento da doença apresenta alto custo e elevada toxicidade. Diante disso, deve-se destacar a pesquisa de componentes antigênicos purificados que possam ser utilizados como ferramenta para obtenção de vacinas ou testes para diagnóstico específico. Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo avaliar a influência da concentração de IPTG durante a indução e a influência da temperatura de cultivo na expressão do antígeno 503 e na estabilidade do plasmídeo pQE-30 em Escherichia coli. Todos os ensaios foram realizados em incubador rotativo e feitos em duplicata. Primeiramente foram realizados cultivos induzidos com IPTG nas concentrações de: 0,01 mM; 0,1 mM; 0,5 mM; 1,0 mM e 1,5 mM na temperatura de 37 °C. A concentração de indutor não afetou a estabilidade do plasmídeo e quando induzido com 1,0 mM, a expressão de antígeno 503 máxima foi de 0,101 ± 0,004 g/L. Foi possível verificar que a menor concentração de IPTG utilizada foi o suficiente para conseguir a expressão da proteína recombinante. Em seguida, a concentração de IPTG foi fixada em 1,0 mM e avaliadas as temperaturas de cultivo de 27, 32 e 42 °C. Estes ensaios foram comparados com o ensaio realizado anterior a 37 °C. A temperatura influenciou a estabilidade do plasmídeo, sendo que quanto menor a temperatura de cultivo, maior estabilidade. De acordo com os resultados, foi possível verificar que a temperatura de 37 °C obteve maior expressão do antígeno 503, sendo considerada portanto, as condições ótimas para produção de antígeno 503 em incubador rotativo. / Visceral leishmaniasis is an infectious-parasitic disease caused by protozoa of the genus Leishmania, which can be lethal when there is no adequate treatment. It is estimated that there are 12 million people infected by the disease, but unfortunately there is no vaccine capable of preventing the disease. In addition, the treatment of the disease presents high cost and high toxicity. Therefore, we must highlight the research of purified antigenic components that can be used as a tool to obtain vaccines or tests for specific diagnosis. In this context, the present work aims to evaluate the influence of the concentration of IPTG during the induction and the influence of culture temperature on 503 antigen expression and on the stability of plasmid pQE-30 in Escherichia coli. All assays were performed in a rotary incubator and made in duplicate. First, IPTG induced cultures were carried out at concentrations of: 0.01 mM; 0.1 mM; 0.5 mM; 1.0 mM and 1.5 mM at 37 °C. The concentration of the inducer did not affect the stability of the plasmid and when induced with 1.0 mM, the 503 antigen expression was maximal 0.101 ± 0.004 g / L. It was possible to verify that the lowest concentration of IPTG used was enough to achieve expression of the recombinant protein. Thereafter, the concentration of IPTG was fixed at 1.0 mM and the cultivation temperatures of 27, 32 and 42 °C were evaluated. These assays were compared with the previous assay performed at 37 °C. Temperature influenced the stability of the plasmid, and the lower the culture temperature, the greater the stability. According to the results, the temperature of 37 °C obtained the highest expression of 503 antigen, being considered therefore, the optimal conditions for 503 antigen production in a rotary incubator.