Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-07-14T14:18:26Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese de Doutorado - Ana Carolina M.S. Dias.pdf: 7391913 bytes, checksum: 55ab68bd39f956f754684f4b795a7baa (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-14T14:18:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese de Doutorado - Ana Carolina M.S. Dias.pdf: 7391913 bytes, checksum: 55ab68bd39f956f754684f4b795a7baa (MD5) Previous issue date: 2015-05-06 / FACEPE / A infecção pelo vírus dengue (DENV) é uma das doenças tropicais mais negligenciadas e de maior importância de saúde pública no mundo. Novos métodos de diagnóstico da doença têm sido estudados através da detecção da proteína NS1 do DENV. O antígeno NS1 é um importante marcador precoce da fase aguda da dengue, secretado em altas concentrações pelo vírus no sangue de pessoas infectadas logo nos primeiros dias, porém, não é muito utilizado na rotina laboratorial para diagnóstico da doença devido ao alto custo dos ensaios. A presente tese descreve o desenvolvimento de duas plataformas sensoras eletroquímicas baseadas em eletrodos impressos (EIs) modificados com nanomateriais para detecção do antígeno NS1 do DENV. Os EIs foram confeccionados utilizando-se a impressão de tinta de carbono sobre o polietileno tereftalato (PET), suporte para impressão dos moldes. Inicialmente, foram estudados os efeitos de nanotubos de carbono e sua contribuição na transferência de elétrons, condutividade e aumento de área eletroativa da plataforma sensora. O estudo foi baseado na incorporação de nanotubos de carbono funcionalizados com grupos carboxílicos à tinta de carbono. Para detecção do NS1, um imunoensaio do tipo “sanduíche” foi realizado, no qual a captura específica do NS1 pôde ser avaliada através das reações redox da enzima peroxidase conjugada ao anticorpo. Uma faixa linear entre 0,04 g/mL e 2 g/mL de NS1 foi obtida, indicando boa performance analítica do imunossensor, com coeficiente de correlação linear de 0,996 (p<0.0001, n=8) e limite de detecção de 0,012 g/mL de NS1. Posteriormente, foi investigada a contribuição de nanopartículas metálicas no desenvolvimento de sensores eletroquímicos livres de marcação. Foram utilizadas nanopartículas de ouro (NPsAu) funcionalizadas com grupos amina para a imobilização covalente de anticorpos. Na síntese das NPsAu, foi utilizado o polietilenoimina como agente redutor e funcionalizante para promover uma ligação amida com o anticorpo anti-NS1. O imunossensor desenvolvido mostrou curva de calibração com faixa de concentração linear entre 0,1 g/mL e 2 g/mL de NS1 (r = 0,995, p<0.0001, n=7) e limite de detecção de 0,03 g/mL de NS1. A contribuição dos nanomateriais para as plataformas sensoras desenvolvidas mostrou-se efetiva na sensibilidade analítica, devido ao aumento de área eletroativa e maior quantidade de anticorpos imobilizados. A aplicação destes nanomateriais nos imunossensores proporciona novas alternativas de diagnóstico para detecção da proteína NS1 do DENV. / Infection by Dengue Virus (DENV) is one of the most neglected tropical diseases and of higher importance of public health worldwide. New methods of diagnosis of the disease have been studied through the detection of NS1 protein of DENV. NS1 antigen is an important early marker of acute dengue infection secreted in high concentrations by the virus in the blood of infected people in first days, however it is not widely used in the laboratory routine for diagnosis of the disease due to high cost of assays. The present thesis describes the development of two electrochemical sensor platforms based on screen-printed electrodes (SPEs) modified with nanomaterials for detection of NS1 antigen of DENV. SPEs were prepared using carbon ink printing on the polyethylene terephthalate (PET), support for molds printing. Initially, the effects of carbon nanotubes and their contribution to the electron transfer, conductivity and increase of electroactive area of the sensor platform were studied. The study was based on the incorporation of carbon nanotubes functionalized with carboxylic groups to the carbon ink. For NS1 detection, a sandwich-type immunoassay was carried out, wherein the specific capture of NS1 may be assessed by redox reactions of peroxidase enzyme conjugated to the antibody. A linear range between 0.04 g/mL and 2 g/mL NS1 was obtained, indicating good analytical performance of the immunosensor, with linear correlation coefficient of 0.996 (p<0.0001, n=8) and limit of detection of 0.012 g/mL NS1. Subsequently, the contribution of metal nanoparticles in the development of label-free electrochemical sensors was investigated. Gold nanoparticles (AuNPs) functionalized with amine groups were used for covalent immobilization of antibodies. In the synthesis of AuNPs, polyethyleneimine was used as a reducing and functionalizing agent to promote an amide bond with anti-NS1 antibody. The developed immunosensor showed calibration curve with linear concentration range between 0.1 g/mL and 2 g/mL NS1 (r = 0.995, p<0.0001, n = 7) and limit of detection of 0.03 g/mL NS1. The contribution of nanomaterials for the sensor platforms developed proved effective in the analytical sensitivity due to the increase of electroactive area and larger amount of immobilized biomolecules. The application of these nanomaterials in immunosensors provides new alternatives of diagnosis for detection of NS1 protein of DENV.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-11-12T11:15:03Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Vivaldo Gomes da Costa - 2015.pdf: 2069412 bytes, checksum: 8451333c0969ae734748f50c7e57e0f3 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-11-12T11:16:34Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Vivaldo Gomes da Costa - 2015.pdf: 2069412 bytes, checksum: 8451333c0969ae734748f50c7e57e0f3 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-12T11:16:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Vivaldo Gomes da Costa - 2015.pdf: 2069412 bytes, checksum: 8451333c0969ae734748f50c7e57e0f3 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-01-12 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / The diagnosis of dengue virus (DENV) infection still remains a challenge, due to cross-reactivity between serological tests and to traditional methods that capture IgM, which is a late marker of infection. However, NS1 antigen is an early marker. Accordingly, several studies have evaluated the performance of tests that utilize NS1 capture, but the results of individual studies may be limited due to the restricted sample size of the patients recruited. Therefore, our objective was to perform a meta-analysis of the diagnostic accuracy of two commercial NS1 ELISAs (Panbio® and Platelia™). Methods and Results: Studies of interest were found in PubMed, Embase and Google Scholar databases using defined inclusion/exclusion criteria. A total of 30 studies containing 12.105 total enrolled patients were included. The overall estimated sensitivity, specificity, positive and negative likelihood ratios, diagnostic odds ratio were as follows: 66% (95% confidence interval (CI) 61-71), 99% (95% CI 96 -100), 98 (95% CI 20-464) 0.3 (95% CI 0.2-0.4) and 289 (95% CI 59-1412), respectively, for Panbio®, and 74% (95% CI 63-82 ), 99% (95% CI 97-100), 175 (95% CI 28-1099), 0.3 (95% CI 0.2-0.4) and 663 (95% CI 98-4478), respectively, for Platelia™. The lowest sensitivity values were for secondary infections (57% [95% CI 47-67] and 66% [95% CI 53-77] for Panbio® and Platelia™, respectively) and for the detection of DENV4. Regarding clinical manifestations, the sensitivity of Platelia™ was 69% (95% CI 43-86) and 60% (95% CI 48-70) for fever and dengue hemorrhagic fever, respectively. In addition, the sensitivity of both tests was slightly lower for samples from Southeast Asia and Oceania. Conclusion: DENV1 samples gave higher sensitivity results for both tests. We observed that factors negatively influencing the tests, such as the type of infection and viral serotype, require further investigation to optimize the diagnostic accuracy. / O diagnóstico das infecções pelo dengue vírus (DENV) continua um desafio, principalmente devido a ocorrência de reações cruzadas entre os testes sorológicos e devido aos tradicionais métodos para captura de IgM constituírem marcadores tardio da infecção. Todavia, o antígeno NS1 é um marcador precoce. Nesse contexto vários estudos tem avaliado a performance dos testes para a captura do NS1, porém os resultados dos estudos individuais podem ser limitados, por causa do restrito tamanho amostral dos pacientes recrutados. Portanto, nosso objetivo foi realizar uma meta-análise da acurácia diagnóstica de dois ensaios comerciais ELISA NS1 (Panbio® e Platelia™). Métodos e Resultados: Os estudos de interesse foram extraídos das bases de dados PubMed, Embase e Google Acadêmico, com definidos critérios de inclusão e exclusão. Um total de 30 estudos, perfazendo 12.105 pacientes recrutados, foram incluídos na análise estatística. A estimativa global da sensibilidade, especificidade, razão de verossimilhança positiva e negativa, razão de chance diagnóstica foram: 66% (95% intervalo de confiança (CI) 61-71), 99% (95% CI 96-100), 98 (95% CI 20-464), 0.3 (95% CI 0.2-0.4) e 289 (95% CI 59-1412), respectivamente para o kit da Panbio®. Enquanto para o kit da Platelia™, os resultados obtidos foram, respectivamente: 74% (95% CI 63-82), 99% (95% CI 97-100), 175 (95% CI 28-1099), 0.3 (95% CI 0.2-0.4) e 663 (95% CI 98-4478). A menor performance dos testes ocorreram nas infecções secundárias e na detecção do DENV4. Quanto às formas clínicas da dengue, a sensibilidade do Platelia™ foi de 69% (95% CI 43-86) e 60% (95% CI 48-70), para a febre da dengue e febre hemorrágica, respetivamente. A sensibilidade de ambos os testes foram discretamente menores para as amostras provenientes da Ásia e Oceania. Conclusão: As amostras de DENV1 forneceram maior sensibilidade para ambos os testes. Observamos que os fatores influenciando negativamente os testes, tais como o tipo de infecção e o sorotipo viral necessitam de maiores investigações no intuito de melhor aperfeiçoamento da acurácia diagnóstica