Cette thèse recouvre une période de 15 ans de lutte contre la diffusion hospitalière des bactéries multi-résistantes aux antibiotiques (BMR) au sein d’un CHU parisien pilote. Elle intègre plusieurs études axées sur les outils informatiques de surveillance, la maîtrise de la transmission croisée, et le bon usage des antibiotiques. La configuration d'une base de données dédiée, concentrant l'ensemble des données de la résistance, doit intégrer des critères de requêtes épidémiologique précis, normalisés, et reproductibles. Des variations significatives du taux de Staphylococcus aureus résistant à la méticilline (SARM) ont été observées en fonction de la méthode d'élimination des doublons utilisée (de 27,6% à 33,8%), et l’extrapolation des résultats annuels à partir de données colligées sur des unités de temps plus courtes, mésestime la valeur annuelle de l’incidence du SARM (de -42% à +30%). Ces variations peuvent influer sur l'interprétation des indicateurs relatifs au SARM. L'alerte électronique BMR, en avertissant les soignants de la réadmission d'un patient porteur au sein de leur unité, a permis d'optimiser la compliance aux mesures de précautions contact complémentaires (15% avant vs 90,2% après), et de participer à la diminution de l’incidence du SARM (1,07 en 2002 vs 0,37 en 2012). Elle a également mis en évidence la forte pression de colonisation due aux patients SARM réadmis, 46% des patients porteurs étant réadmis au moins une fois dont les 2/3, moins de trois mois après leur sortie. En réanimation, 1/5 des patients sont porteurs d’Entérobactéries productrices de béta-lactamase à spectre étendu (EBLSE) et/ou hyperproductrices de céphalosporinase (HP-CASE), les taux de portage à l’admission étant respectivement de 79,2% et 48,1% rapportés à l’ensemble des patients porteurs. Aucune stratégie de dépistage n’assure une identification de 100% des patients porteurs, la discontinuité de portage au cours du séjour concernant la majorité des patients. Le remplacement de la ceftriaxone par le cefotaxime a permis de ralentir la progression de l'incidence des HP-CASE. Enfin, l’optimisation du dépistage des EBLSE par l'évaluation puis l'utilisation de robots et de milieux de culture dédiés, a permis de gérer l’inflation des échantillons de dépistage / This work describes 15 years of fight against the spread of multi-drug resistant bacteria (MRB) in a tertiary care hospital, and includes several published studies focused on monitoring systems, cross-transmission control, and antibiotics policy. Data processing plays a crucial role in monitoring MRB. The configuration of a dedicated database, concentrating all resistance data, has to include accurate, standardized, and reproducible epidemiological settings. Significant changes in the methicillin-resistant staphylococcus aureus (MRSA) rate were observed, according to the method used to remove duplicates (27.6% to 33.8%), and the extrapolation of annual results from data collected from shorter period length, underestimates the annual value of MRSA incidence (from -42% to + 30%). These variations may affect the interpretation of MRSA official indicators. The MRB electronic alert, used to warn the staff of the readmission of a previously known colonized patient, conducted to increase the compliance for implementation of infection control measures (15% before vs 90.2% after), and participated in reducing the MRSA incidence (1.07 in 2002 vs. 0.37 in 2012). It also highlighted the strong colonization pressure due to readmitted MRSA colonized patients, since 46% of them were readmitted at least once, readmissions occurring less than three months after discharge in 2/3 cases. In intensive care units, 1/5 patient are colonized by Enterobacteriaceae producing broad spectrum beta-lactamase (ESBL) and/or high level cephalosporinase (HL-CASE), rates at admission being respectively 79.2% and 48.1% when considering all colonized patients. No screening strategy is able to detect 100% of colonization situations, the discontinuity of colonization during the hospital stay concerning a majority of patients. A significant inflexion in the slope in the HL-CASE incidence curve occurred after the substitution of ceftriaxone by cefotaxime. Finally, the optimization of ESBL screening by the assessment and then the use of a robot and dedicated culture media, allowed managing the increased number of screening specimens

Ce travail avait pour objectif principal l’étude par spectroscopie vibrationnelle Raman et IR, couplée à l’analyse statistique de type ACP, la détection des changements moléculaires induits par différentesclasses d’antibiotiques (ampicilline, céfotaxime,tétracycline et ciprofloxacine) vis-à-vis de deux bactéries modèles (E. coli et V. parahaemolyticus). Dans le cas d’E. coli, l’ampicilline et le céfotaxime ont provoqué une baisse des bandes protéiques en Raman et IR, une augmentation des carbohydrates en IR.L’addition de la tétracycline a entraîné une augmentation des acides nucléiques, une forte baisse de la phénylalanine en Raman, une diminution des bandes protéiques et une augmentation de l’ADN en Raman et IR. Concernant la ciprofloxacine, une augmentation des acides nucléiques en Raman, une augmentation des bandes protéiques et de l’ADN en IR ont été observées. Chez V. parahaemolyticus, le céfotaxime a provoqué une baisse des protéines en Raman et Infra-rouge, une augmentation des polysaccharides en Infra-rouge. L’addition de la tétracycline a entraîné une baisse de la phénylalanine en Raman, une baisse des protéines en Raman et Infra-rouge, une augmentation des polysaccharides en Infra-rouge. Concernant la ciprofloxacine, une augmentation des polysaccharides et une diminution des bandes protéiques en Raman et IR ont été détectées. Une nette discrimination entre les échantillons traités aux antibiotiques et le témoin a été enregistrée chez E. coli et V. parahaemolyticus. Pour cette dernière, le profil de résistance à l’ampicilline a aussi été observé. Ce travail jette les bases d’une compréhension des mécanismes d’antibio-résistance dans les systèmes bactériens. / The present study aimed to explore Raman and IR in combination with PCA to detect molecularchanges induced by different classes of antibiotics(ampicillin, cefotaxime, tetracycline and ciprofloxacin) against two bacterial models (E.coli and V. parahaemolyticus) In E. coli,ampicillin and cefotaxime treatments led to a decrease of protein bands in both Raman and IR,an increase of carbohydrates in IR. Tetracycline addition caused an increase of nucleic acids, a sharp decrease of phenylalanine in Raman, a decrease of protein bands and an increase of DNA in both Raman and IR. For ciprofloxacin, an increase of nuleic acids in Raman, an increase of protein bands and DNA in IR were observed. In V. parahaemolyticus, cefotaxime resulted in a decrease of protein bands in both Raman and IR,an increase of polysaccharides in IR. Tetracycline increase of polysaccharides and a decrease of proteins in both Raman and Infra-red were noticed. Clear discrimination of antibiotic-treated samples compared to the control was recorded for the three antibiotic classes in both E. coli and V. parahaemolyticus. For the latter, resistance pattern has also been observed for ampicillin. This work lays the foundations for an understanding of the mechanisms of antibiotic resistance in the bacterial systems.

Depuis quelques années, des Toxi-Infections Alimentaires Collectives causées par la contamination de produits frais, comme les laitues, par des bactéries pathogènes entériques (Salmonella, Escherichia coli productrice de shigatoxines -ou STEC-) apparaissent de plus en plus nombreuses. La présence de ces bactéries dans cet environnement inhabituel est un risque sanitaire émergent majeur, d'autant plus que les bactéries entériques, pathogènes ou non, présentent fréquemment des résistances aux antibiotiques. Afin d’étudier la persistance des bactéries antibiorésistantes ou pathogènes sur des laitues, la caractérisation de plasmides de résistance portés par des souches de E. coli issues d’environnements aquatiques contaminés a été réalisé pour, par la suite, étudier leur implication potentielle dans l’adhésion des souches-hôtes sur différentes variétés de laitues. L’étude de la survie et de l’adhésion de souches de E. coli environnementales et de laboratoire, transformées avec les plasmides d’intérêt, sur de jeunes plants de laitues a permis de mettre en évidence trois points : 1) plus le temps de contact entre bactéries et feuilles augmente et moins la survie bactérienne est importante ; 2) il existe une différence de survie et d’adhésion selon les variétés de laitues étudiées ; 3) il existe une différence de survie et d’adhésion entre les souches de laboratoire et les souches environnementales, ces dernières étant en meilleur état métabolique et montrant une adhésion plus importante durant les 11-12 jours d’expérimentation. Après ces constatations de persistance des E. coli antibiorésistantes en conditions contrôlées, des études en champs sur 4 exploitations maraîchères normandes, possédant des itinéraires techniques différents, ont été réalisées. La recherche de pathogènes entériques, Salmonella et STEC, a été effectuée sur les laitues et une recherche de E. coli, témoin de contamination fécale, a été réalisée sur les laitues ainsi que dans l’eau d’irrigation d’un des sites. Les résultats révèlent une qualité microbiologique satisfaisante des parcelles étudiées (selon l’arrêté européen N°2073/2005) bien que des E. coli aient été régulièrement retrouvées au niveau des laitues, dont certaines antibiorésistantes. L’analyse de l’eau d’irrigation a montré la présence continue de E. coli, dont des souches présentant des profils d’antibiorésistance communs à ceux retrouvés sur les laitues, montrant que l’eau d’irrigation est l’une des sources critiques de contamination des végétaux en champs. / In recent years, foodborne diseases caused by fresh products contaminated, such as lettuce, with enteric pathogenic bacteria (Salmonella, Shigatoxin-producing Escherichia coli-or STEC-) increasingly. The presence of these bacteria in this unusual environment is a major emerging health risk, especially since enteric bacteria, whether pathogenic or not, are frequently resistant to antibiotics. To study the persistence of antibiotic-resistant or pathogenic bacteria on lettuce, the characterization of resistance plasmids carried by E. coli strains from contaminated aquatic environments was carried out in order to study their potential involvement in adhesion of host strains on different varieties of lettuce. The study of the survival and adhesion of environmental and laboratory E. coli strains, transformed with the plasmids of interest, on young lettuce plants allowed to highlight three points: 1) more time contact between bacteria and leaves increases and less bacterial survival is important; 2) there is a difference in survival and adhesion depending on the varieties of lettuce studied; 3) there is a difference in survival and adhesion between laboratory strains and environmental strains, the latter being in better metabolic state and showing greater adhesion during the 11-12 days of experimentation. After the persistence of antibiotic-resistant E. coli strains under controlled conditions, field studies on 4 Normandy vegetable farms, with different technical itineraries, were carried out. The search for enteric pathogens, Salmonella and STEC, was carried out on lettuce and a search for E. coli, a control of fecal contamination, was realized on the lettuce as well as in the irrigation water of one of the sites. The results reveal a satisfactory microbiological quality of the agricultural plots studied (according to the European decree N ° 2073/2005) although E. coli strains were regularly found at the lettuce level, including some antibiotic resistant. Analysis of the irrigation water showed the continued presence of E. coli strains, including strains with common antimicrobial resistance profiles to those found on lettuce, showing that irrigation water is one of the critical sources of plant contamination in the field.

Chez les bactéries, l’undécaprényl-phosphate (C55-P) est utilisé comme transporteur lipidique de sous-unités glycanes à travers la membrane plasmique. Après la synthèse de son précurseur (C55-PP) par UppS, ce dernier doit être déphosphorylé. Le transfert final des sous-unités glycanes sur une molécule acceptrice du côté périplasmique libère également du C55-PP qui va être déphosphorylé pour être recyclé. Quatre C55-PP phosphatases membranaires ont été identifiées chez E. coli : trois enzymes appartenant à la famille des PAP2 (PgpB, YbjG et LpxT) et une protéine appartenant à une nouvelle famille de phosphatases (BacA). Au cours de cette étude, nous avons caractérisé les propriétés biochimiques et la topologie membranaire de BacA. Les conditions optimales de son activité (pH, détergent, cations, température) ont été déterminées et une étroite spécificité de substrats, avec une préférence pour le C55-PP, a été observée. Trois résidus essentiels à son activité, Glu21, Ser27 et Arg174, ont été identifiés par mutagénèse, nous permettant de proposer un mécanisme catalytique basé sur l’attaque nucléophile du C55-PP par un résidu sérine. La topologie membranaire de BacA, déterminée expérimentalement à l’aide de fusions de protéines, n’a validé aucun des modèles in silico précédemment proposés. Ainsi, BacA comprend 7 segments transmembranaires et présente deux larges boucles périplasmiques portant les résidus hautement conservés du site actif. Nos résultats démontrent que toutes les C55-PP phosphatases d’E. coli identifiées à ce jour (BacA et PAP2) catalysent la déphosphorylation du C55-PP du même côté de la membrane plasmique (côté périplasmique), nous interrogeant sur l’identité de l’enzyme catalysant la déphosphorylation du C55-PP synthétisé de novo. LpxT est une PAP2 qui possède une activité kinase assurant le transfert du phosphate β du C55-PP sur une molécule de lipide A, pour former du lipide A-1-PP. Nous avons cartographié par mutagénèse dirigée le site actif de LpxT et mis en évidence l’importance d’une triade catalytique caractéristique des PAP2 (His150, His190, Asp194) et d’autres résidus spécifiques à LpxT et ses proches homologues. L’activité de LpxT est inhibée par un petit peptide, PmrR, dont l’expression est sous contrôle du système à deux composants PmrA-PmrB. Notre étude a montré que cette inhibition intervenait via une interaction directe entre ces deux partenaires. Nous montrons que l’induction du système PmrA-PmrB conduit à une résistance à la polymyxine B (peptide antimicrobien cationique) et à une sensibilité au déoxycholate (composant majeur de la bile) et que la modification catalysée par LpxT produit un effet opposé. La résistance à la polymyxine B est corrélée à la force des signaux induisant le système PmrA-PmrB, mais également le système PhoP-PhoQ et nous avons clairement identifié les signaux nécessaires à cette résistance chez E. coli. / In bacteria, the undecaprenyl-phosphate (C55-P) is used as a lipid carrier of glycans subunits across the plasma membrane. After synthesis of its precursor (C55-PP) by UppS, this latter must be dephosphorylated. The transfer of the glycans subunit onto a final acceptor molecule at the periplasmic side also releases C55-PP that will be dephosphorylated to be recycled. Four C55-PP membrane phosphatases have been identified in E. coli : three enzymes belonging to the PAP2 family (PgpB, YbjG and LpxT) and a protein belonging to a new family of phosphatases (BacA).In this study, we characterized the biochemical properties and membrane topology of BacA. The optimal conditions for its activity (pH, detergent, cation, temperature) were determined and narrow substrate specificity, with a preference for the C55-PP, was observed. Three essential residues to its activity, Glu21, Ser27 and Arg174 were identified by mutagenesis, allowing us to propose a catalytic mechanism based on the nucleophilic attack of the C55-PP by a serine residue. The membrane topology of BacA determined experimentally using protein fusions did not validated previous in silico models. Thus, BacA has 7 transmembrane segments and contains in particular two large periplasmic loops carrying the highly-conserved active site residues. Our results demonstrate that all C55-PP phosphatases of E. coli identified to date (BacA and PAP2) catalyze the dephosphorylation of C55-PP on the same side of the plasma membrane (periplasmic side), questioning us about the identity of the enzyme catalyzing the dephosphorylation of C55-PP synthesized de novo. LpxT is a PAP2 enzyme with a specific kinase activity, transferring the β-phosphate group of C55-PP on a molecule of lipid A, to generate lipid A-1-PP. We mapped, by directed mutagenesis, the active site of LpxT and highlighted the importance of a catalytic triad characteristic to the PAP2 enzymes (His150, His190, Asp194) and other specific residues of LpxT and its closer homologues. The activity of LpxT is inhibited by a small membrane peptide, called PmrR, whose expression is under the control of the two-component system PmrA-PmrB. Our study showed that this inhibition occurred via a direct interaction between these two partners. We showed that the induction of PmrA-PmrB system leads to resistance to the polymyxin B (cationic antimicrobial peptide) and sensitivity to deoxycholate (component major bile) and that the modification catalyzed LpxT produces an opposite effect. The robustness of the resistance to the polymyxin B is connected to the force of the signals inducing PmrA-PmrB system, but also the system PhoP-PhoQ and we clearly identified the signals needed to this resistance in E. coli.