Cancer related fatigue (CRF) is a common phenomenon in patients undergoing chemotherapy and radiotherapy representing a negative impact on functional status and quality of life. Some plants present tonic and antifatiguing properties, as guaraná (Paullinia cupana) and a previous study described positive effect on CRF of breast cancer patients submitted to chemotherapy. Despite the positive results indicating that guaraná improve CRF, this fruit present bioactive molecule as caffeine and catechin which can to influence the effect of antitumor drugs. Therefore, the aim of this study was to evaluate if guaraná changes the viability and antiproliferative effect of seven chemotherapic agents currently used in the breast cancer treatment using as in vitro experimental model MCF-7 breast cancer cell line. The cells were exposed at 1, 5 and 10 μg/mL guaraná concentrations with and without chemotherapics. The main results showed an antiproliferative effect of guaraná at 5 10 μg/mL. The guaraná influence on chemotherapic effects was drug-dependent. The guaraná effect on MCF-7 cells viability was heterogeneous and drug dependent. Different of the results found after 24 hours exposition, the guaraná plus all chemotherapic drugs showed a strong antiproliferative effect ( > 40% of cell inhibition) on MCF-7 cells after 72 hours of exposition of 10 uM gemcitabine, vinorelbine and methotrexate, 2 uM 5-fluoracil, 50 uM paclitaxel, 200 nM doxorubicin, and 5mM cyclophosphamide. Because chemotherapic drugs were affected by guaraná addition most improve the antiproliferative activity, the therapeutic use of guaraná against CRF seems did not affect negatively the chemotherapy. However, in vitro protocols present methodological limitations that need to be considered and complementary in vitro and in vivo investigations need to be performed to evaluate whether chemotherapic plus guaraná administration is safe to breast cancer patients. / A fadiga relacionada ao câncer (CRF) é um fenômeno comum em pacientes submetidos à quimioterapia e à radioterapia representando um impacto negativo sobre o estado funcional e a qualidade de vida. Algumas plantas apresentam propriedades tônicas e antifatigantes, como guaraná (Paullinia cupana) e um estudo anterior descreveu efeito positivo sobre a CRF de pacientes com câncer de mama, submetidas à quimioterapia. Apesar dos resultados positivos, indicando que o guaraná melhora o CRF, este fruto apresenta molécula bioactiva como cafeína e catequina, que podem influenciar no efeito de fármacos antitumorais. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar se o guaraná muda a viabilidade e o efeito antiproliferativo de sete agentes quimioterápicos atualmente utilizados no tratamento do câncer de mama, utilizando como modelo experimental in vitro a linhagem de células de câncer de mama MCF-7. As células foram expostas a concentrações de guaraná de 1, 5 e 10 μg/mL, com e sem quimioterápicos. Os principais resultados demonstraram um efeito antiproliferativo do guaraná em 5 10 μg/mL. A influência do guaraná sobre os efeitos quimioterápicos era dependente de fármacos. O efeito do guaraná na viabilidade de células MCF-7 foi heterogêneo e dependente de drogas. Diferente dos resultados obtidos após 24 horas de exposição, o guaraná mais todos os fármacos quimioterápicos mostraram um forte efeito antiproliferativo (> 40% de inibição de células) em células MCF-7, depois de 72 horas de exposição de 10 uM de gemcitabina, vinorelbina e metotrexato, 2 uM 5-fluoracil, 50 uM de paclitaxel, 200 nM de doxorubicina, e 5 mM de ciclofosfamida. Devido ao fato das drogas quimioterápicas serem afetadas pela adição de guaraná melhorando a atividade antiproliferativa, o uso terapêutico de guaraná contra CRF parece não afetar negativamente a quimioterapia. No entanto, protocolos in vitro apresentam limitações metodológicas que precisam ser consideradas e precisam ser realizadas investigações complementares in vitro e in vivo para avaliar se a administração de quimioterápico com guaraná é segura para pacientes com câncer de mama.

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Este processo pode ser induzido por fatores de crescimento, tais como Fator de Crescimento Transformante beta (TGF-β) e sua alta expressão tem sido implicada na angiogênese tumoral, na migração e invasão celular em muitos tipos de tumores. A expressão de ROCK-1 está associada com a malignidade dos tumores, enquanto a inibição desta molécula resulta em uma supressão significativa de metástases tumorais. A metformina, um fármaco utilizado no tratamento da diabetes, demonstrou inicialmente inibir a EMT e impedir o fenótipo mesenquimal pela repressão transcricional de pontos chave da regulação da EMT (ZEB1, TWIST1, SNAIL2, TGF-β) em células de câncer de mama. Os objetivos foram avaliar a expressão gênica e proteica de marcadores relacionados a metástase, em um estudo in vitro e in vivo, em linhagens de câncer de mama, após o tratamento com metformina, além do silenciamento gênico do TGF-β1 para inibição da transição epitélio-mesenquimal. Foi realizado a transfecção da linhagem celular metastática de tumor mamário canino CF41 de forma estável após a construção de um pequeno RNA de interferência para desenvolver derivados clonais que expressam níveis reduzidos de TGF-β1 (células TGF-β1sh). Este foi subsequentemente combinado com o tratamento com metformina, para analisar os efeitos sobre a migração de células, assim como a expressão dos marcadores de EMT E-caderina e N-caderina, quantificados através de imunofluorescência e do qRT-PCR. As linhagens mamárias humanas MCF-7 (não-metastática) e MDA-MB-231 (metastática) foram tratadas com metformina e inibidor Y27632, após a indução da EMT por TGF-β1 para examinar os efeitos sobre a migração destas células, bem como a expressão proteica dos marcadores ROCK-1, vimentina, E-caderina, CD44 e CD24 por imunocitoquímica. Em um estudo in vivo, as células não modificadas CF41 ou que expressam TGF-β1 shRNA foram injetadas na região inguinal de camundongos fêmea nude atímicos tratados com metformina. Os camundongos foram eutanasiados após o tratamento e os pulmões foram recolhidos para avaliação do número de metástases. As regiões metastáticas foram subsequentemente avaliadas pela expressão de N-caderina, E-caderina, vimentina e claudina-7 através da imuno-histoquímica. Foi possível avaliar que a taxa de migração e invasão foi menor em células TGF-β1sh, em comparação com as células parentais CF41 e esta inibição foi significativa quando combinado com o tratamento com metformina. As análises in vitro demonstraram que o tratamento com metformina reduziu a expressão de N-caderina e aumentou a expressão de E-caderina nas células CF41 e TGF-β1sh. Os resultados demonstram também que após a indução do TGF-β1 nas linhagens MCF-7 e MDA-MB-231 houve menor expressão das proteínas ROCK-1, vimentina, CD44 e CD24 em ambas as linhagens após tratamento com metformina e Y27632. Nas células MDA-MB-231 a expressão de E-caderina foi maior em todos os grupos de tratamento. O tratamento da linhagems MDA-MB-231 com metformina e Y27632 reduziu significativamente a invasão destas células. O estudo in vivo demonstrou que o tratamento com metformina reduziu o número de metástases pulmonares em animais portadores de tumores induzidos com as células TGF-β1sh. Houve diminuição da expressão de marcadores mesenquimais N-caderina e vimentina, e aumento da expressão de marcadores epiteliais E-caderina e claudina-7 nas metástases pulmonares. Assim, concluimos que este estudo confirma os benefícios do silenciamento do TGF-β1, além do tratamento com metformina e Y27632 como potenciais agentes terapêuticos em tumores de mama, bloqueando o processo de EMT e seu potencial metastático. / Epithelial mesenchymal transition (EMT) is the process by which cancer cells from primary tumors pass through a phenotypic conversion to invade and migrate, generating metastases in organs or tissues distant. This process can be induced by growth factors such as transforming growth factor beta (TGF-β) and its overexpression has been implicated in tumor angiogenesis, cell migration and invasion in many cancers. ROCK-1 expression is associated with the malignant character of tumors, while inhibiting this molecule results in a significant suppression of tumor metastasis. Metformin, a drug use for the treatment of diabetes, was previously shown to inhibit EMT by suppressing expression of key transcription factors in breast cancer cells. The aims were to evaluate the gene expression and protein expression of related markers metastasis, in a study in vitro and in vivo in breast cancer cell lines after treatment with metformin in addition to the gene silencing of TGF-β1 for inhibiting epithelial-mesenquimal transition. These aims were contemplated performing transfected of canine metastatic mammary tumor cell line CF41 with small interfering RNA constructs to develop clonal derivatives expressing reduced levels of TGF-β1 (TGF-β1sh cells). This was subsequently combined with metformin treatment, to look at effects on cell migration, as well as the expression of the EMT markers E-cadherin and N-cadherin, which were quantified by immunofluorescence and qRT-PCR. MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines were treated with metformin and Y27632, after induction of EMT by TGF-β1, to examine the effects on cell migration as well as the protein expression of the ROCK-1 markers, vimentin, E-cadherin, CD44 and CD24 by immunocitochemistry. In an in vivo study, unmodified or TGF-β1 shRNA-expressing CF41 cells were injected in the inguinal region of nude athymic female mice that were treated with metformin. Mice were sacrificed after treatment and the lungs were collected to assess the number of metastases. Metastatic nodules were subsequently assessed for, N-cadherin, E-cadherin, vimentin and claudin-7 expression via immunohistochemistry. With the obtained results it was possible to assess the migration and invasion rate was lower in TGF-β1sh cells as compared to parental CF41 cells and this inhibition was significant when combined with metformin treatment. In vitro analyses demonstrated that metformin treatment reduced n-cadherin expression and increased E-cadherin expression in both CF41 and TGF-β1sh cells. After TGF-β1 induction in MDA-MB231 and MCF-7 cell lines, there was a lower protein expression of ROCK-1, vimentin, CD44 and CD24 in both cell lines after treatment with metformin and Y27632. In MDA-MB-231 cells, E-cadherin expression was increased in all treatment groups. Treatment of MDA-MB-231 cell line with metformin and Y27632 significantly reduced the invasion of these cells. In vivo studies demonstrated that metformin treatment reduced the number of lung metastases in animals bearing TGF-β1sh tumors. This paralleled a decreased expression of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin, and increased expression of epithelial markers E-cadherin and claudin-7 in lung metastases.This study confirms the benefits of TGF-β1 silencing in addition to metformin and Y27632 as potential therapeutic agents in mammary tumors, by blocking EMT process and metastatic potential. / FAPESP: 2012/09778-1