Les anticorps catalytiques sont étudiés pour comprendre leur rôle en conditions physiopathologiques. Ils semblent aussi représenter des outils révolutionnaires pour des études à l'interface entre la chimie, la biochimie, la biologie et immunologie. Par conséquent, la connaissance des relations de structure- fonction représente un grand intérêt. Nous avons exploré deux systèmes d'expression pour la production d'un anticorps catalytique modèle présentant une activité bêta-lactamase. Le fragment scFv recombinant a été produit dans le système d'expression procaryote. Les scFv sont souvent décrits comme des protéines difficiles à produire. Une méthode efficace a été développée pour produire de grandes quantités de scFv solubles et correctement repliés. L'anticorps catalytique entier a aussi été produit en exploitant le système d'expression eucaryote. Des cellules de mammifères ont été utilisées car elles peuvent conserver le repliement original des protéines, leur assemblage et les modifications post-traductionnelles. La structure secondaire du scFv catalytique a été analysée par dichroïsme circulaire pour s'assurer que la renaturation du scFv est en accord avec le repliement des scFv natifs. La fonctionnalité du scFv catalytique et de l'anticorps catalytique entier a été validée par deux approches : (1) le développement d'un test immuno-enzymatique (ELISA) et la résonance plasmonique de surface (RPS) et (2) le développement d'un test catalytique sensible utilisant un substrat fluorogénique. Ce travail amène à considérer de potentielles applications biotechnologiques et thérapeutiques des anticorps catalytiques.

Les anticorps sont les molécules effectrices de l'immunité adaptatrice humorale. Ils se lient spécifiquement et neutralisent une large panoplie d'antigènes. Au-delà de leurs fonctions classiques, les anticorps possèdent les propriétés moins explorées que sont l'activité catalytique, qui permet aux anticorps de se comporter comme des enzymes, et la polyréactivité, qui représente la capacité d'une molécule d'anticorps à se lier à plusieurs antigènes structurellement différents. Les anticorps catalytiques sont retrouvés dans plusieurs pathologies chez l'homme, telle que l'hémophilie acquise, une maladie caractérisée par la survenue d'autoanticorps anti-facteur VIII. Dans ce travail, nous décrivons des IgG hydrolysant et activant le facteur IX de la coagulation chez les patients avec hémophilie acquise. Par ailleurs, nous avons effectué une étude longitudinale de deux ans des IgG catalytiques chez les patients subissant une transplantation rénale. Les anticorps polyréactifs représentent une proportion importante du répertoire des immunoglobulines circulantes. De plus, les sites inflammatoires sont abondants en molécules, telles que l'hème libre, capables de rendre polyréactives certaines IgG monoréactives. Nous avons étudié l'influence de la nature des régions constantes de la chaîne lourde des anticorps sur leur susceptibilité à devenir polyréactifs. Ce travail apporte un nouvel éclairage sur l'importance physiopathologique des anticorps catalytiques et polyréactifs.

Les anticorps sont les molécules effectrices de l’immunité adaptatrice humorale. Ils se lient spécifiquement et neutralisent une large panoplie d’antigènes. Au-delà de leurs fonctions classiques, les anticorps possèdent les propriétés moins explorées que sont l’activité catalytique, qui permet aux anticorps de se comporter comme des enzymes, et la polyréactivité, qui représente la capacité d’une molécule d’anticorps à se lier à plusieurs antigènes structurellement différents. Les anticorps catalytiques sont retrouvés dans plusieurs pathologies chez l’homme, telle que l’hémophilie acquise, une maladie caractérisée par la survenue d’autoanticorps anti-facteur VIII. Dans ce travail, nous décrivons des IgG hydrolysant et activant le facteur IX de la coagulation chez les patients avec hémophilie acquise. Par ailleurs, nous avons effectué une étude longitudinale de deux ans des IgG catalytiques chez les patients subissant une transplantation rénale. Les anticorps polyréactifs représentent une proportion importante du répertoire des immunoglobulines circulantes. De plus, les sites inflammatoires sont abondants en molécules, telles que l’hème libre, capables de rendre polyréactives certaines IgG monoréactives. Nous avons étudié l’influence de la nature des régions constantes de la chaîne lourde des anticorps sur leur susceptibilité à devenir polyréactifs. Ce travail apporte un nouvel éclairage sur l’importance physiopathologique des anticorps catalytiques et polyréactifs. / Antibodies are effector molecules of the humoral arm of the adaptive immune system that bind specifically and neutralize diverse array of antigens. Beyond the classical function of antibodies exist the relatively less explored properties, of “catalytic activity” that enable antibodies to act as enzymes and “polyreactivity” that confers the ability to bind to several structurally unrelated antigens. Catalytic antibodies have been associated with several autoimmune, inflammatory and infectious diseases. Acquired hemophilia is an autoimmune disease, reported with the presence of catalytic antibodies against coagulation factor FVIII. In the present work, we have investigated the presence of factor IX (FIX) hydrolyzing IgG in patients with acquired hemophilia. We investigated the molecular mechanism and the physiological relevance of FIX activation upon hydrolysis by patients’ IgG. In addition, a longitudinal follow-up for 2 years was done in patients undergone renal transplant to investigate the evolution of catalytic antibodies in the course of disease. Polyreactive antibodies constitute a major portion of the natural antibody repertoire. Additionally, sites of inflammation are abundant in protein destabilizing agents like free heme that can induce polyreactivity in monoreactive antibodies. We have investigated the effect of the antibody constant domain on heme-induced polyreactivity. The present work has allowed us a better understanding of the physiopathological relevance of catalytic and polyreactive antibodies.

Les anticorps catalytiques sont étudiés pour comprendre leur rôle en conditions physiopathologiques. Ils semblent aussi représenter des outils révolutionnaires pour des études à l'interface entre la chimie, la biochimie, la biologie et immunologie. Par conséquent, la connaissance des relations de structure- fonction représente un grand intérêt. Nous avons exploré deux systèmes d'expression pour la production d'un anticorps catalytique modèle présentant une activité bêta-lactamase. Le fragment scFv recombinant a été produit dans le système d'expression procaryote. Les scFv sont souvent décrits comme des protéines difficiles à produire. Une méthode efficace a été développée pour produire de grandes quantités de scFv solubles et correctement repliés. L'anticorps catalytique entier a aussi été produit en exploitant le système d'expression eucaryote. Des cellules de mammifères ont été utilisées car elles peuvent conserver le repliement original des protéines, leur assemblage et les modifications post-traductionnelles. La structure secondaire du scFv catalytique a été analysée par dichroïsme circulaire pour s’assurer que la renaturation du scFv est en accord avec le repliement des scFv natifs. La fonctionnalité du scFv catalytique et de l'anticorps catalytique entier a été validée par deux approches : (1) le développement d’un test immuno-enzymatique (ELISA) et la résonance plasmonique de surface (RPS) et (2) le développement d'un test catalytique sensible utilisant un substrat fluorogénique. Ce travail amène à considérer de potentielles applications biotechnologiques et thérapeutiques des anticorps catalytiques. / Catalytic antibodies are investigated in order to understand their role under physio-pathological situations. But they also appear to be revolutionary tools to perform studies at the interface between chemistry, biochemistry, biology and immunology. Consequently, the knowledge of structure–function relationships is of great interest. We explored two expression systems for the production of a model catalytic antibody displaying a beta-lactamase activity. The recombinant scFv fragment was produced in the prokaryotic expression system. scFv fragments are often described as proteins being laborious to produce. An efficient method was developed to produce large quantities of refolded soluble catalytic scFv. Whole catalytic antibody was also produced by exploiting eukaryotic expression system. Mammalian cells were used because they are able to retain the original protein folding, assembly and post-translational modifications. The secondary structure of the catalytic scFv has been analyzed by circular dichroism to ensure that the refolded scFv is consistent with a native scFv fold. The functionality of the catalytic scFv and whole catalytic antibody has been validated by two approaches: (1) development of enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) and surface plasmon resonance (SPR) approaches for testing that the binding characteristics of an inhibitory peptide have been retained, and (2) proof of the subtle catalytic properties conservation through the development of a new sensitive catalytic assay using a fluorogenic substrate. This will lead to consider potential biotechnological and therapeutic applications of catalytic antibodies.

Les anticorps catalytiques (ou abzyme) ont fait l’objet de nombreuses recherches et ont été produits pour réaliser de nombreuses réactions. Ces protéines ont été ensuite découvertes dans le sérum d’individus sains ou atteints de pathologies, dont les pathologies autoimmunes. Les études suggèrent que ces abzymes peuvent avoir des effets bénéfiques ou délétères sur la santé des individus. L’origine des anticorps catalytiques et leur rôle restent ambigus et doivent être approfondis. Nous avons développé une nouvelle stratégie visant à étudier les abzymes, basée sur la technologie du phage display. Nous avons construit 4 banques de fragments d’anticorps, chacune présentant un répertoire immun différent (fond génétique et état d’immunitaire) : saine et naïve, saine et immunisée, autoimmune et naïve, et autoimmune et immunisée. Les stratégies d’amplification et de clonage des régions variables des immunoglobulines ont été conçues afin d’optimiser la taille et la diversité des banques. Nous avons rassemblé les 4 banques en une banque unique élargie contenant 2.7×109 séquences. L’analyse des séquences a mis en évidence des différences dans les profils d’expression des sous-groupes de gènes selon la banque. Nous avons ensuite procédé à la sélection d’abzymes à activité β-lactamase en utilisant deux cibles : un peptide cyclique, et un dérivé de sulfone pénam, inhibiteurs de l’enzyme. Nous avons sélectionné 5 abzymes. Chacun de ces immunoglobulines ont des séquences protéiques propres, incluant un potentiel site actif. Ces résultats montrent que différents motifs peuvent assurer la fonction catalytique de la β-lactamase, confirmant la flexibilité moléculaire de cette enzyme. / Catalytic antibodies (or abzymes) have been the focus numerous studies for some decades and have been produced with the ability to catalyze a wide range of reactions. They have also been discovered naturally in normal physiological and pathological conditions, notably on the background of autoimmune disease. Some have beneficial effects and others are detrimental to individual’s health. Hence, the origin of abzymes and their role in the immune response are ambiguous and must be enhanced. We have developed a novel strategy for the study of abzymes based on the phage display technology. We have constructed 4 libraries representing 4 murine immune repertoires with different genetic backgrounds and immunological states : healthy and naïve, healthy and immunized, autoimmune and naïve , and autoimmune and immunized. The strategies for the amplification and cloning of the immunoglobulin (lg) variable regions have been designed to optimize the size and diversity of the libraries. We have been able to pool the four libraries to create a large repertoire of size 2.7x109. After sequence analysis, we have found a number of statistically significant differences between the libraries. We have then used two strategically chosen targets to select for antibodies endowed with β lactamase activity : a cycle peptide and a penam sulfone, both inhibitors of the enzyme. We have selected for a total of 5 lgs endowed with β lactamase activity. The selected abzymes have different amino acid sequences. 3D modeling has provides insights on potential active sites demonstrating the ability of different structures to maintain the β lactamase activity and confirming the flexibility of the active site.