African trypanosomes are a major plague in sub-Saharan Africa. They cause sleeping sickness in humans and nagana in cattle. These parasites are transmitted between their mammalian hosts by tsetse flies. They are adapting to their different environments through differentiation processes. These processes involve, amongst other things, the expression of different surface coats. These coats are made of procyclin protein at the insect midgut procyclic stage and of variant surface glycoprotein (VSG) at the mammalian bloodstream stage. At a given time, one VSG is expressed from a single VSG gene out of a repertoire of more than 1500 VSG genes present in the trypanosomes genome. The expressed VSG gene is always located at one of fifteen telomeric polycistronic transcription units called expression sites (ES). The VSG coat is changed regularly in a process called antigenic variation allowing trypanosomes to escape the immune response. The exact mechanism controlling the selection of the active ES is not yet known and controversies have been raised concerning the ES transcription control. Although several molecular factors involved in the ES monoallelic-expression have been identified, none of them seems to be a critical regulator.<p><p>Thus during my thesis we decided to explore two aspects of ES expression: (A) deciphering the level at which this expression is controlled and (B) fishing for new protein factors controlling this expression.<p>A) It is not even clear at which level the ES transcription control takes place. In particular, there has been debate on whether it is taking place at the transcription initiation or elongation level. Previous experiments generated contradictory conclusions and gave rise to two different models. The first model suggested that transcription initiation takes place in all ESs simultaneously. The second model suggested that transcription is initiated in only two ESs, one being fully active and a second being pre-active. These two models were equally able to account for the finding of transcripts from different ES within a trypanosome population provided the pre-active ES differs between individual cells. In order to decide if a single or multiple ES promoters can initiate transcription in a given cell, single cell RT-PCR targeting the beginning of the ES was required. Thus single cell RT-PCR was performed and an analysis of the obtained transcripts showed that transcription initiation is taking place on many ES while only one VSG is transcribed. This permitted the unambiguous conclusion that the monoallelic expression of VSG is exerted by controls operating downstream from transcription initiation, suggesting transcription elongation or RNA processing as critical control steps. <p>B) We have characterized a new nuclear protein, Tb alba3, involved in the repression of silent VSGs. Its invalidation lead to chromatin opening in the silent expression sites and to a raise in their expression. As this protein is cytoplasmic and binding procyclin mRNAs at the procyclic stage, it could be a new versatile factor, shuttling between the cytoplasm and the nucleus and involved both in the inverse regulation of major surface antigens at different differentiation stages and the control of antigenic variation.<p><p>These results enhance our understanding of ES transcription control and of ES monoallelic expression. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le trypanosome est le parasite responsable de la maladie du sommeil chez l’homme et de la Nagana chez le bétail. Afin d’échapper au système immunitaire de son hôte mammifère, il remplace périodiquement la protéine VSG (Variant Surface Glycoprotein) présente en 10 millions d’exemplaires à sa surface. Ce mécanisme a pour nom la variation antigénique. <p>Pour être exprimé, le gène de VSG (VSG) doit se trouver en fin d’un site d’expression (ES) particulier. Cet ES est polycistronique, télomérique et transcrit par une ARN polymérase de type ribosomique (Pol I). 20 à 40 ESs similaires et un millier de VSGs sont recensés dans le génome du trypanosome. Cependant, un seul ES est totalement transcrit (actif) et un seul VSG est exprimé. La variation antigénique est donc possible par deux mécanismes: soit l’activation d’un autre ES, soit le remplacement du VSG dans l’ES actif. La base de ce système est l’activation d’un seul ES à la fois (contrôle monoallélique).<p>Au laboratoire, un modèle a été proposé où la transcription s’initie au niveau de tous les ESs mais n’aboutit au VSG que dans le cas de l’ES actif (Vanhamme et al. 2000). Dans ce cas uniquement, le transcrit primaire subit une maturation correcte (épissage et polyadénylation) et est exporté dans le cytoplasme. Etant donné que des transcrits Pol I subissent une maturation identique à des transcrits Pol II, la régulation s’effectuerait par recrutement d’une machinerie d’élongation/maturation de l’ARN de type Pol II (Pol II « RNA factory »). Cette dernière serait uniquement localisée au niveau de l’ES actif dans le compartiment nucléaire appelé ES body (Navarro and Gull, 2001).<p>Durant cette thèse, diverses stratégies ont été élaborées pour tester la validité du modèle. La première visait à comparer l’état de maturation d’un ES en fonction de son activité. Nos résultats ont appuyé l’idée que les transcrits d’ESs ayant subi une maturation correcte provenaient préférentiellement de l’ES actif mais le(s) facteur(s) en quantité limitante ne permettant cette maturation qu’au niveau de l’ES actif doivent encore être identifiés. Le seconde stratégie analysait l’acétylation des histones ainsi qu’un éventuel attachement différentiel à la matrice nucléaire de l’ES suivant son activité. Le niveau d’acétylation d’un ES lorsqu’il est actif n’a pu être étudié. Des résultats préliminaires en faveur d’une association préférentielle de l’ES à la matrice nucléaire lorsqu’il est actif ont été obtenus. Enfin, nous avons cloné deux homologues d’un facteur général de la transcription appelé TFIIS. Ce dernier permet à la Pol de redémarrer lorsqu’elle est bloquée par un site de pause. Individuellement chacun de ces facteurs ne semble pas être essentiel au trypanosome. Cependant, un retard de croissance a été observé lorsque les deux facteurs sont invalidés dans la même lignée cellulaire. Ce phénotype particulier doit être caractérisé. En parallèle, nous avons envisagé de caractériser le complexe de la Pol I du trypanosome. Cette stratégie constituait la manière la plus simple de mettre en évidence un éventuel contact physique et/ou fonctionnel entre la Pol I transcrivant l’ES et la machinerie d’élongation/maturation de l’ARN de type Pol II « RNA factory ». 5 sous-unités du complexe ont été identifiées, associées à une protéine de fonction inconnue ainsi qu’à des histones. L’identification d’autres protéines associées au complexe constitue notre perspective principale. La phosphorylation de la plus grande sous-unité du complexe a été démontrée mais son rôle doit encore être élucidé.<p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Trypanosoma brucei est un parasite unicellulaire qui est transmis d’un hôte mammifère à l’autre par l’intermédiaire de la mouche Tsé-tsé. Au cours de son cycle de vie, il est donc confronté à des environnements extrêmement différents auxquels il s’adapte en modifiant, entre autres choses, ses antigènes de surface. Dans la mouche, l’antigène de surface exprimé est la PROCYCLINE alors que dans le sang des mammifères, l’antigène exprimé est le VSG. Ces protéines sont importantes pour l’adaptation du parasite à son environnement. L’objet de ce travail était de trouver des facteurs impliqués dans le contrôle de l’expression de ces antigènes de surface. <p>Nous nous sommes donc intéressés aux mécanismes de transcription, impliqués dans la régulation de l’expression des gènes. Chez les autres eucaryotes, les gènes codant pour des protéines sont toujours transcrits par une ARN polymérase de type II (Pol II). Les ARN codant pour des protéines subissent en effet une maturation particulière (épissage et polyadénylation) et la machinerie enzymatique nécessaire à cette maturation est spécifiquement recrutée par la Pol II. Une particularité étonnante des gènes de PROCYCLINE et de VSG est qu’ils sont transcrits par une ARN polymérase de type I (Pol I) mais les transcrits résultants sont maturés comme s’ils étaient transcrits par la Pol II. L’hypothèse à la base de ce travail est que la régulation de l’expression des gènes codant pour la PROCYCLINE et le VSG s’effectue via le recrutement, au niveau de la Pol I, d’un/de facteurs normalement associé(s) à la Pol II. Nous avons donc tenté de trouver un lien entre les machineries Pol I et Pol II du parasite. Pour ce faire, nous nous sommes intéressés d’une part au facteur de transcription TFIIH et d’autre part à la machinerie de transcription Pol II du trypanosome.<p>Le facteur TFIIH est un facteur de transcription qui interagit avec la Pol II mais aussi avec la Pol I chez d’autres eucaryotes. Il nous semblait donc être un bon facteur potentiel de lien entre les deux machineries de transcription. Nous avons dans un premier temps mis en évidence que six des dix sous-unités humaines de ce complexe ont des homologues chez le parasite et que au moins quatre d’entre elles forment un complexe. Nous avons ensuite montré que la présence de TFIIH est importante pour la transcription des gènes Pol II du parasite. Sa fonction dans la transcription des gènes Pol I devra être confirmée. <p>Par ailleurs, nous avons caractérisé la composition du complexe Pol II du parasite ce qui nous permet de conclure que la composition globale de la Pol II du parasite est conservée par rapport à celle de l’homme et de la levure. Nous avons aussi montré que la sous-unité RPB5 qui interagit avec le complexe Pol II n’est pas la même que celle qui interagit avec le complexe Pol I. Le trypanosome possède en effet deux gènes codant pour deux isoformes de RPB5 (RPB5 et RPB5z) alors que la majorité des eucaryotes ne possèdent qu’un seul variant de cette protéine. Nous avons mis en évidence au cours de ce travail que chaque isoforme était spécifique d’un complexe de polymérase particulier. L’isoforme associée à la Pol II et à la Pol III ressemble à la protéine homologue présente chez l’homme et la levure, tandis que l’isoforme associée à la Pol I diverge de cette isoforme canonique. Le même phénomène a été mis en évidence pour la sous-unité RPB6. La présence d’isoformes divergentes spécifiquement associées à la Pol I du parasite pourraient être liées aux capacités qu’à cette holoenzyme de transcrire des gènes codant pour des protéines. <p>Enfin, au cours de ce travail, nous avons montré que l’inhibition de la transcription Pol II perturbait l’expression spécifique de stade des gènes codant pour les antigènes de surface. Bien que le mécanisme sous-jacent reste inconnu, il est possible que l’inhibition de la transcription Pol II, créee artificiellement dans nos expériences, mime ce qui ce passe naturellement lorsque le parasite s’apprête à changer de stade.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished