In Ratten und Mäusen aktiviert der superagonistische anti-CD28 monoklonale Antikörper (CD28SA) vorzugsweise regulatorische T-Zellen. In niedriger Dosierung führt CD28SA zu einer fast ausschließlichen Aktivierung von regulatorischen T-Zellen (Tregs). Diese Beobachtung konnte inzwischen auch für menschliche Zellen in Zellkultur bestätigt werden. In gesunden und freiwilligen Testpersonen deutet die Zytokin-Antwort nach Applikationen von niedrigen CD28SA-Dosen darauf hin, dass sich diese Beobachtung auch in-vivo bewahrheitet. Eine Gabe von CD28SA in niedriger Dosierung, die zu einer exklusiven Aktivierung von regulatorischen T-Zellen führt, könnte somit in der Behandlung von Autoimmunkrankheiten oder von entzündlichen Erkrankungen eingesetzt werden. Eine mechanistische Erklärung für dieses Phänomen blieb lange Zeit unklar. Die CD28SA-vermittelte T-Zell-Aktivierung ist abhängig von der Verstärkung von basalen tonischen Signalen, die T-Zellen über ihren T-Zell-Rezeptor erhalten. Diese Tatsache führte zu der Hypothese, dass die schwachen, tonischen Signale, die konventionelle CD4+ T-Zellen in Abwesenheit ihrer spezifischen Antigene über den T-Zell-Rezeptor erhalten, ein stärkeres CD28 Signal für ihre Aktivierung benötigen als die selbstreaktiven regulatorischen T-Zellen, die ein stärkeres Selbstpeptid-TCR Signal erhalten. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Blockade von MHC-Klasse-II-Molekülen in Mäusen, in-vitro und in-vivo, den Vorteil der regulatorischen T-Zellen gegenüber den konventionellen T-Zellen bezüglich der Antwort auf niedrige CD28SA Dosierungen, aufhebt. / In rats and mice, CD28 superagonistic mAb (CD28SA) preferentially activate regulatory T-cells, resulting in near exclusive Treg activation at low CD28SA doses. This observation has recently also been extended to cell culture studies in humans, and the cytokine response of healthy volunteers to low-dose CD28SA application suggests that it also holds true in vivo, and thus can be utilized for the treatment of autoimmune and inflammatory diseases. A mechanistic explanation for this phenomenon, however, remained uncertain for a long time. Given that CD28SA-mediated T-cell activation depends on the amplification of basal tonic TCR signals, the hypothesis was tested that the weak tonic TCR signals received by conventional CD4 T-cells in absence of their cognate antigen require more CD28 signalling input than the stronger TCR signals perceived by self-reactive regulatory T-cells. The experiments of this thesis provide strong evidence that in mice, blockade of MHC class II in vitro or in vivo abrogates the advantage of Treg over Tconv in the response to low CD28SA doses.

Zur Aktivierung ruhender T-Zellen sind zwei Signale erforderlich: Eines wird antigen-abhängig über den T-Zellrezeptor (TZR) gegeben, ein zweites erfolgt über kostimulatorische Rezeptoren. Unter den bekannten kostimulatorischen Molekülen ist CD28 das potenteste. Die mitogene Aktivität einiger monoklonaler Antikörper (mAb) spezifisch für CD28 der Ratte, die alle ruhenden primären Ratten-T-Zellen ohne TZR-Ligation zu Proliferation und IL-2-Produktion anregen können, erlaubte, die Signalwege nach dieser direkten CD28-Stimulation und nach Kostimulation zu analysieren und zu vergleichen. Die erzielten Ergebnisse deuten auf unterschiedliche Signalwege nach Kostimulation mit TZR-Beteiligung und direkter CD28-Stimulation hin und zeigen, daß direkte CD28-Stimulation nicht die Signaltransduktion durch den TZR imitiert. Daher unterstützt CD28 als kostimulatorisches Molekül nicht nur TZR-vermittelte Signaltransduktion, sondern fungiert auch als eigenständiges Signalmolekül, das spezifische mitogene Signale generiert. Diese Eigenschaft von CD28 könnte für die Art der induzierten Immunreaktion von Bedeutung sein, da das Verhältnis der Stärke von TZR- und CD28-Signal die funktionelle Differenzierung von T-Zellen in Th1- oder Th2-Zellen bestimmt. / Resting T cells need two signals to become fully activated: one delivered via the T cell receptor (TCR) and a second one provided by costimulatory receptors. Among the known costimulatory molecules CD28 is the most potent one. In the rat system some CD28-specific monoclonal antibodies (mAb) trigger all primary rat T cells to proliferate and produce cytokines without TCR engagement. The signalling pathways elicited by one of these mitogenic CD28-specific mAb were analyzed and compared to the signals given in classical costimulation with TCR contribution. The results suggest that direct CD28 stimulation does not mimic TCR signals but elicits distinct, CD28-specific signals. Thus, CD28 as a costimulatory molecule not only supports TCR mediated signalling but functions as a generator of mitogenic signals. This could be relevant to the type of immune reaction triggered since the relative contribution of TCR and CD28 signals to T cell activation has been shown to influence the functional differentiation of T cells towards the Th1 or Th2 subset.

Trotz zahlreicher Fortschritte im Verständnis der Funktionsweise des kostimulatorischen Rezeptors CD28 in Mensch, Maus, Ratte und Makake ist nach wie vor wenig hierüber in Bezug auf das Tiermodell Schwein bekannt. Die vorliegende Arbeit untersucht die Funktion und Expression von CD28 in Schweine-T-Zellen sowie die Regulierbarkeit der T-Zellaktivierung durch anti-pCD28 mAb. Die Ergebnisse zeigen, dass hierbei vor allem CD4+ und CD8+ T-Zellen differenziert betrachtet werden müssen. Grundsätzlich unterscheiden sich die beiden T-Zellpopulationen in der CD28 mRNA Expression, im Expressionsverhältnis zwischen CD28 mRNA und Protein, sowie im proliferativen Ansprechen auf anti-pCD28mAb. So reagierten CD4+ im Vergleich zu CD8+ T-Zellen auf die kostimulatorische Inkubation mit anti-pCD28 mAb des Klons 3D11 sensibler. In direkt stimulatorischen Ansätzen zeigte sich, dass CD4+ und CD8+ T-Zellen durch unterschiedliche anti-pCD28 mAb differentiell angesprochen werden können. Eine superagonistische Funktion konnte für CD4+ T-Zell aktivierende anti-pCD28 mAb in den bisherigen Versuchen noch nicht beobachtet werden. Letzteres ist hierbei vor allem für den Transfer von vielversprechenden Therapiestrategien vom Kleintier- zum Großtiermodell auf dem Weg zur Entwicklung neuer Therapieoptionen für Autoimmunerkrankungen, Erkrankungen mit starker proinflammatorischer Aktivität und dem Myokardinfarkt von Bedeutung. / Even though tremendous progress has been made in clarifying the function of the costimulatory receptor CD28 in human, mouse, rat, and macaques, concerning pigs, an important large animal model, only little is still known about CD28 expression and function. Therefore, our work aimed at investigating the function and expression of CD28 in porcine T cells as well as the applicability of anti-pCD28 mAb as a tool to regulate T cell activation, specifically. Our results indicate that the two major T cell groups, CD4+ and CD8+, have to be considered separately. These cell populations differ in their level of pCD28 mRNA expression, their ratio of CD28 mRNA and protein expression as well as their proliferative responsiveness towards anti-pCD28 mAb. In costimulatory assays, CD4+ compared to CD8+ T cells showed higher sensitivity toward low concentrations of the anti-pCD28 mAb 3D11. Additionally, in direct stimulatory assays, CD4+ and CD8+ T cells can be specifically targeted by different anti-pCD28 mAb. With these assays, a superagonistic anti-pCD28 mAb could not been detected so far. With anti-pCD28 superagonist, promising therapeutic strategies developed in rodents could be tested in pigs as a large animal model, representing the next step on the way towards new therapeutic options for autoim-mune diseases, diseases with strong proinflammatory activity and myocardial infarction.

Die Effizienz einer Tumortherapie durch einen Transfer von ex vivo aktivierten Tumor-spezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten wird durch zahlreiche Faktoren wie geringe Anzahl der isolierten spezifischen T-Zellen, schnelles Abklingen der Aktivität und kurzzeitige Persistenz der transferierten Effektorzellen im Empfängerorganismus stark limitiert. Eine Möglichkeit zur Überwindung dieser Einschränkungen bietet die Entwicklung einer neuen Strategie zur Armierung der zytotoxischen T-Lymphozyten mit Tumor-spezifischen chimären Rezeptoren. Ziel dieser Arbeit war es, die Grundlagen für eine solche immuntherapeutische Strategie zu erarbeiten. Da das Prostatakarzinom die am meisten diagnostizierte maligne Erkrankung und die dritt häufigste Todesursache des Mannes ist, wurde das auf der Oberfläche von Prostatakarzinomzellen exprimierte PSCA (prostataspezifisches Stammzellantigen) als Zielantigen gewählt. Neben der therapierefraktären Spätstadien des Prostatakarzinoms bedürfen die früh entstehenden Mikrometastasen (minimale Resterkrankung) einer neuen adjuvanten Behandlungsoption. Das PSCA ist ein membranständiges Tumor-assoziiertes Antigen, das in mehr als 80 % der primären Prostatakarzinome überexprimiert wird. PSCA wird als besonders aussichtsreiches Zielantigen einer Immuntherapie bei fortgeschrittenen Prostatakarzinomen angesehen, weil sein Expressionsniveau mit der Tumorprogression und der Entwicklung zum androgenunabhängigen Wachstum ansteigt. In der vorgelegten Arbeit wurde zunächst ein neuer monoklonaler PSCA-spezifischer Antikörper generiert, der als Grundlage für die Konstruktion eines Einzelkettenantikörpers (scFv) verwendet wurde. Aus einem Hybridomklon, der sich durch sehr hohe Bindungsstärke auszeichnete, wurden mittels degenerierter Primer die kodierenden Sequenzen für die variablen VH und VL Domänen des Antikörpers amplifiziert. Durch die Verbindung der beiden VH und VL Domänen mittels eines Linkers wurde der PSCA-spezifische Einzelkettenantikörper generiert. Die mit gereinigtem scFv durchgeführten Bindungsanalysen bestätigten die Funktionalität des rekombinanten Proteins und seine Anwendbarkeit zur Chimerisierung eines membranständigen Rezeptors. Nach dem ?Zwei-Signal-Modell? benötigen T-Zellen für eine effiziente Antigen-spezifische Aktivierung neben dem T-Zell-Rezeptorsignal ein zusätzliches kostimulatorisches Signal. Daher wurden chimäre Rezeptoren auf der Basis der Beta-Kette des T-Zell-Rezeptors und des CD28-Moleküls generiert. Bei der Konstruktion des chimären T-Zell-Rezeptors wurde die konstante Domäne der Beta-Kette mit der CD3 -Kette fusioniert. Neben einer starken Oberflächenexpression des Rezeptors wurde auch die effiziente Bindung von löslichem PSCA nachgewiesen. Die Bindung des Rezeptors an das PSCA führte zur Phosphorylierung der ITAM-Sequenzen der heterodimeren -Kette, was die Funktionalität des chimären Rezeptors bestätigte. Die Stimulation der Zellen über den anti-CD3 Antikörper resultierte ebenfalls in der Phosphorylierung der heterodimeren -Kette, was ein Hinweis auf eine mögliche Interaktion der chimären Kette mit dem endogenen CD3-Komplex lieferte. Um die kostimulatorische Wirkung über das selbe Antigen zu erzielen, wurde das CD28 Molekül N-terminal ebenfalls mit dem Einzelkettenantikörper modifiziert. Die durch Bindung des löslichen Proteins induzierte Phosphorylierung der Akt-Kinase bewies die Funktionalität der chimären CD28 Kette als PSCA-spezifischer Rezeptor. Diese Arbeit demonstriert die Generierung eines hochaffinen PSCA-spezifischen Einzelkettenantikörpers als eine Antigen-erkennende Struktur eines chimären Rezeptors. Die Armierung polyklonaler zytotoxischer T-Lymphozyten mit den funktionsfähigen chimären Rezeptoren stellt den ersten Schritt einer neuen Strategie zur Eliminierung hormon-refrektärer und metastasierender Prostatakarzinomzellen dar.

Die Effizienz einer Tumortherapie durch einen Transfer von ex vivo aktivierten Tumor-spezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten wird durch zahlreiche Faktoren wie geringe Anzahl der isolierten spezifischen T-Zellen, schnelles Abklingen der Aktivität und kurzzeitige Persistenz der transferierten Effektorzellen im Empfängerorganismus stark limitiert. Eine Möglichkeit zur Überwindung dieser Einschränkungen bietet die Entwicklung einer neuen Strategie zur Armierung der zytotoxischen T-Lymphozyten mit Tumor-spezifischen chimären Rezeptoren. Ziel dieser Arbeit war es, die Grundlagen für eine solche immuntherapeutische Strategie zu erarbeiten. Da das Prostatakarzinom die am meisten diagnostizierte maligne Erkrankung und die dritt häufigste Todesursache des Mannes ist, wurde das auf der Oberfläche von Prostatakarzinomzellen exprimierte PSCA (prostataspezifisches Stammzellantigen) als Zielantigen gewählt. Neben der therapierefraktären Spätstadien des Prostatakarzinoms bedürfen die früh entstehenden Mikrometastasen (minimale Resterkrankung) einer neuen adjuvanten Behandlungsoption. Das PSCA ist ein membranständiges Tumor-assoziiertes Antigen, das in mehr als 80 % der primären Prostatakarzinome überexprimiert wird. PSCA wird als besonders aussichtsreiches Zielantigen einer Immuntherapie bei fortgeschrittenen Prostatakarzinomen angesehen, weil sein Expressionsniveau mit der Tumorprogression und der Entwicklung zum androgenunabhängigen Wachstum ansteigt. In der vorgelegten Arbeit wurde zunächst ein neuer monoklonaler PSCA-spezifischer Antikörper generiert, der als Grundlage für die Konstruktion eines Einzelkettenantikörpers (scFv) verwendet wurde. Aus einem Hybridomklon, der sich durch sehr hohe Bindungsstärke auszeichnete, wurden mittels degenerierter Primer die kodierenden Sequenzen für die variablen VH und VL Domänen des Antikörpers amplifiziert. Durch die Verbindung der beiden VH und VL Domänen mittels eines Linkers wurde der PSCA-spezifische Einzelkettenantikörper generiert. Die mit gereinigtem scFv durchgeführten Bindungsanalysen bestätigten die Funktionalität des rekombinanten Proteins und seine Anwendbarkeit zur Chimerisierung eines membranständigen Rezeptors. Nach dem ?Zwei-Signal-Modell? benötigen T-Zellen für eine effiziente Antigen-spezifische Aktivierung neben dem T-Zell-Rezeptorsignal ein zusätzliches kostimulatorisches Signal. Daher wurden chimäre Rezeptoren auf der Basis der Beta-Kette des T-Zell-Rezeptors und des CD28-Moleküls generiert. Bei der Konstruktion des chimären T-Zell-Rezeptors wurde die konstante Domäne der Beta-Kette mit der CD3 -Kette fusioniert. Neben einer starken Oberflächenexpression des Rezeptors wurde auch die effiziente Bindung von löslichem PSCA nachgewiesen. Die Bindung des Rezeptors an das PSCA führte zur Phosphorylierung der ITAM-Sequenzen der heterodimeren -Kette, was die Funktionalität des chimären Rezeptors bestätigte. Die Stimulation der Zellen über den anti-CD3 Antikörper resultierte ebenfalls in der Phosphorylierung der heterodimeren -Kette, was ein Hinweis auf eine mögliche Interaktion der chimären Kette mit dem endogenen CD3-Komplex lieferte. Um die kostimulatorische Wirkung über das selbe Antigen zu erzielen, wurde das CD28 Molekül N-terminal ebenfalls mit dem Einzelkettenantikörper modifiziert. Die durch Bindung des löslichen Proteins induzierte Phosphorylierung der Akt-Kinase bewies die Funktionalität der chimären CD28 Kette als PSCA-spezifischer Rezeptor. Diese Arbeit demonstriert die Generierung eines hochaffinen PSCA-spezifischen Einzelkettenantikörpers als eine Antigen-erkennende Struktur eines chimären Rezeptors. Die Armierung polyklonaler zytotoxischer T-Lymphozyten mit den funktionsfähigen chimären Rezeptoren stellt den ersten Schritt einer neuen Strategie zur Eliminierung hormon-refrektärer und metastasierender Prostatakarzinomzellen dar.