Les maladies inflammatoires de l’intestin (MII), incluant la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse, sont des maladies chroniques qui résultent d’un dérèglement de la réponse immunitaire aux microorganismes de la lumière intestinale. Des études de séquençages réalisées par le laboratoire du Dr. Rioux, avec ses collègues du International IBD Genetics Consortium ont identifié quatre variants rares, indépendants et causals pour les MII, dans le gène IFIH1. La protéine d’IFIH1 (MDA5) interagit avec certains virus à ARN, afin de déclencher une réponse antivirale de l’immunité innée. Nous avions émis l’hypothèse que ces variants dans IFIH1 diminuaient la réponse antivirale de l’épithélium intestinal, suite à une infection. Nous avons d’abord travaillé avec des lignées cellulaires lymphoblastoïdes (LCLs) obtenues à partir d’individus atteints de MII et qui sont homozygotes ou hétérozygotes composés pour ces variants, ainsi qu’à partir d’individus contrôles (IFIH1 wt). Ces LCLs ont été reprogrammées en cellules souches pluripotentes induites humaines, avant d’être différenciées en cultures épithéliales intestinales. Nos résultats ont d’abord confirmé l’impact des variants sur la structure génique et protéique (IFIH1/MDA5), dans ces modèles cellulaires. Puis, la réponse antivirale a été induite, grâce à la stimulation avec des agents (moléculaire et viral) connus pour stimulés la protéine MDA5. Nous avons démontré que ces variants dans IFIH1 induisaient effectivement une moins grande réponse antivirale, caractérisée par une plus faible expression d’IFNs, comparativement aux contrôles. Finalement, la modulation des IFNs constituerait une avenue potentiellement intéressante pour le traitement des patients atteints des MII et porteurs des variants causals. / Inflammatory Bowel Disease (IBD), including Cronh’s disease and ulcerative colitis, are chronic inflammatory diseases of the gastro-intestinal tract. IBD is associated with a disturbance of the immune response to the microorganisms of the intestinal lumen. Sequencing studies conducted by the laboratory of Dr. John Rioux, in collaboration with his colleagues of the International IBD Genetics Consortium, identified four rare and independent variants in IFIH1, associated to IBD. The protein of IFIH1 (MDA5) interacts with certain RNA viruses to trigger the innate mechanism of antiviral defense. Our hypothesis was that these IFIH1 variants decreased the intestinal epithelial antiviral response, following an infection. We first worked with lymphoblastoid cell lines (LCLs) obtained from IBD patients who are homozygotes or compound heterozygotes for the different variants, as well as from control individuals (IFIH1 wt). These LCLs were reprogrammed into human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs), before being differentiated into intestinal epithelial cultures. Our results first confirmed the impact the variants on the genetic and protein structure for these models. Then, the antiviral response was triggered by the stimulation of LCLs and intestinal epithelial cells, with agents (molecular and viral) known to stimulate MDA5. We have demonstrated that these IFIH1 variants did indeed induce a lower antiviral response, characterized by lower IFNs expression, compared to control cell lines. Finally, modulation of IFNs could be an interesting avenue for the treatment of IBD patients with the causal variants.

Hantaviren sind wichtige menschliche Krankheitserreger und können das Hämorrhagische Fieber mit renalem Syndrome (HFRS) auslösen, welches sich durch endotheliale Dysfunktion kennzeichnet. Pathogene und nicht-pathogene Hantaviren replizieren sich in Endothelzellen, ohne zytopathische Effekte auszulösen. Dies legt nahe, dass immunpathologische Mechanismen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese spielen. Wir haben die antivirale Antwort nach Infektion mit dem pathogenen Hantaan Virus (HTNV) sowie mit dem weniger pathogenen Tula Virus (TULV) in humanen Endothelzellen (HUVEC) verglichen. Die mit HTNV und auch die mit TULV infizierten Zellen zeigten eine erhöhte Expression von Antigen-präsentierenden Molekülen. Hierbei induzierte TULV die Expression von HLA Klasse I-Molekülen noch effizienter. HTNV sorgte für die Induktion von Interferon (IFN)-???während dieses Zytokin im Überstand von TULV-infizierten HUVEC kaum nachzuweisen war. Trotzdem konnte die Hochregulation von HLA Klasse I-Molekülen auf HTNV- und TULV-infizierten Zellen durch anti-IFN-?-Antikörper blockiert werden. Interessanterweise wurde das antiviral wirksame MxA-Protein, welches die virale Replikation hemmt, bereits 16 Stunden nach einer Infektion mit TULV induziert. Im Gegensatz dazu war MxA in HTNV-infizierten Zellen erst nach 48 Stunden der Infektion nachzuweisen. Der Kinetik der MxA-Expression entsprechend, replizierte sich TULV nur sehr schwach in HUVEC, wohingegen HTNV-infizierte Zellen hohe Virustiter aufwiesen, die nach 48 Stunden der Infektion wieder zurückgingen. Beide Hantavirus-Spezies waren jedoch gleichermaßen effizient in der Lage, sich in Vero E6-Zellen zu replizieren, denen die IFN-induzierte MxA-Antwort fehlt. Die verzögerte Induktion des MxA nach einer Infektion der HUVEC mit HTNV, könnte die Virusausbreitung ermöglichen und mit zur Pathogenese des HFRS beitragen. Das Risiko, sich während der Arbeit im Forschungslabor versehentlich mit Hantaviren zu infizieren, macht spezielle Sicherheitsmaßnahmen zwingend erforderlich. Die Wirkung von chemischen oder physikalischen Inaktivierungsmethoden wurde an HTNV-infizierten Proben untersucht. Die beschriebenen Maßnahmen zur Virus-Desinfektion sind geeignet, eine sichere Handhabung der Proben zu gewährleisten. / Hantaviruses represent important human pathogens and can induce hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS), which is characterised by endothelial dysfunction. Both pathogenic and nonpathogenic hantaviruses replicate without causing any apparent cytopathic effect suggesting that immunopathological mechanisms play an important role in pathogenesis. We compared the antiviral response triggered by Hantaan virus (HTNV), a pathogenic hantavirus associated with HFRS, and Tula virus (TULV), a rather nonpathogenic hantavirus, in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Both HTNV- and TULV-infected cells showed increased levels of molecules involved in antigen presentation. However, TULV-infected HUVEC more rapidly upregulated HLA class I molecules. Interestingly, HTNV clearly induced the production of interferon (IFN)-( whereas expression of this cytokine was barely detectable in the supernatant or in extracts from TULV-infected HUVEC. Nevertheless, upregulation of HLA class I on both TULV- and HTNV-infected cells could be blocked by neutralising anti-IFN-( antibodies. Most strikingly, antiviral MxA protein, which interferes with hantavirus replication, was induced already 16 h after infection with TULV. In contrast, HTNV-infected HUVEC showed no expression of MxA until 48 h postinfection. In accordance with the kinetics of MxA expression TULV only inefficiently replicated in HUVEC whereas HTNV-infected cells produced high titers of virus particles that decreased 48 h postinfection. Both hantavirus species, however, could replicate equally well in Vero E6 cells which lack an IFN-induced MxA response. Thus, a delayed induction of antiviral MxA in endothelial cells after infection with HTNV could allow viral dissemination and contribute to the pathogenesis leading to HFRS. The potential risk of accidental infection by hantaviruses in a clinical or research laboratory necessitates special precautionary measures. To study the elimination of hantavirus infectivity, the effects of different chemical and physical inactivation and depletion procedures were investigated on HTNV-containing materials. The virus inactivation and depletion methods described herein are suitable to prepare non-infectious samples for further use in immunological, virological and cell biological assays.

Introduction: le Virus Respiratoire Syncytial humain (RSV) induit un taux élevé de morbidité et de mortalité chez les enfants, les personnes immunodéprimées et les personnes âgées. Il existe un besoin urgent d'un nouveau traitement antiviral et d'un vaccin efficaces. Les cellules épithéliales des voies aériennes (AEC) sont la cible principale de RSV et constituent la première ligne de défense grâce à des mécanismes distincts, qui incluent une réponse antivirale autonome cellulaire. La protéine p62/SQSTM1 a de multiples fonctions cellulaires, y compris la séquestration spécifique de la cargaison ubiquitinée (c'est-à-dire, les protéines/organelles et les bactéries intracellulaires) pour leur clairance par autophagie. Des données publiées ont mis en évidence un rôle important de p62 dans la régulation de plusieurs virus (par exemple, le virus de la grippe et la dengue), favorisant ou restreignant sa réplication en fonction du virus. L'objectif de notre étude est de déterminer le rôle de p62 dans la régulation du cycle infectieux de RSV. Méthodes et résultats: L'analyse de l'expression de p62 dans les cellules A549 a montré que p62 est induit et phosphorylé au début de l'infection par RSV. Il est ensuite dégradé plus tardivement durant l’infection. La déplétion des niveaux de p62 a diminué l'accumulation intracellulaire des protéines virales, tandis que la relâche des virions infectieux a été augmentée. De plus, nous avons observé que la réplication de recRSV-GFP est diminuée dans des cellules exprimant de façon stable la protéine associée aux microtubules 1A/1B, chaîne légère 3 (LC3). LC3 recrute p62 et ses cargaisons à l'autophagosome pour qu'ils soient dégradés par autophagie. Des études sont actuellement en cours pour déterminer les mécanismes moléculaires, dépendant de p62, impliqués dans la régulation de la réplication de RSV. Conclusion: nos résultats mettent en évidence un rôle clé de p62 dans la réplication et la propagation de RSV. Ces études aideront à définir si p62 pourrait représenter une cible thérapeutique potentielle pour lutter contre l'infection à RSV. / Introduction: Human respiratory syncytial virus (RSV) causes a high rate of morbidity and mortality worldwide in children, immunocompromised and elderly people. There is an urgent need for effective antiviral treatments and vaccines for RSV. Airway epithelial cells (AECs) are the primary target of RSV and constitute the first line of defense through distinct mechanisms, including intrinsic antiviral responses. The p62/SQSTM1 protein has multiple cellular functions including cell signaling and sequestration of specific ubiquitinated cargo (i.e. proteins/organelles and intracellular bacteria) for autophagic degradation. The replication of several viruses has been shown to be sensitive to p62 levels. The goal of our study is to investigate the role of p62 in the regulation of RSV replication. Methods and Results: Analysis of p62 expression in A549 cells showed that p62 is induced and phosphorylated during early stages of RSV infection, followed by degradation at later times. P62 silencing diminished the intracellular accumulation of viral proteins, while causing increased release of infectious virions. Additionally, we observed that the stable expression of Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (LC3), which recruits p62 and its cargos to the autophagosome for autophagy degradation, reduces recRSV-GFP replication. Studies are currently undertaken to determine the molecular mechanisms involved in p62-dependent regulation of RSV replication. Conclusion: Our results highlight a key role of p62 in the replication of RSV. These studies will help to define whether p62 might represent a potential therapeutic target to fight RSV infection.