Im Rahmen einer prospektiven Studie wurde die Inzidenz der Reaktivierung des Humanen Cytomegalievirus (HCMV) bei stillenden Müttern, sowie die Virusübertragung auf ihre Frühgeborenen untersucht. Mit In vitro Experimenten wurde der Einfluss von Muttermilch auf die Reaktivierung und Replikation vom HCMV untersucht. Die Muttermilch von 73 Müttern, sowie Urin- und Trachealproben ihrer 89 Frühgeborenen wurden über 2 Monate post partum wöchentlich auf HCMV DNA untersucht. Eine Reaktivierung des Virus wurde bei 95% der latent infizierten Mütter beobachtet. Zu einer Virusübertragung kam es bei 42% der HCMV-positiven Müttern auf ihre gestillten Kinder. Insgesamt infizierten sich 22 der 89 Frühgeborenen im Untersuchungszeitraum, in zwei Fällen kam es zu schweren symptomatischen Krankheitsverläufen. Infizierte Frühgeborene zeigten im Vergleich zu Nicht-Infizierten höhere Inzidenzen von Amnioninfektionssyndrom, respiratory distress syndrome und Bronchopulmonarer Dysplasie. Die Studie bestätigt ein signifikant hohes Risiko einer Übertragung von HCMV durch Muttermilch auf Frühgeborene mit teils schwerwiegendem Verlauf und eine hohe Reaktivierungsrate von HCMV in der laktierenden Brust. Daher wurde ein möglicher Einfluss von Muttermilch auf die Reaktivierung bzw. Replikation von HCMV konstatiert und der Effekt von Muttermilch auf die Aktivität des HCMV Immediate Early (IE)1/2 Enhancer/Promotors, die Virusreplikation und IE Protein Synthese in monozytären Zellen und humanen Lungenfibroblasten untersucht. Sämtliche Milchproben stimulierten den HCMV Immediate Early (IE)1/2 Enhancer/Promotor und die IE Protein Synthese in einer charakteristischen Kinetik, mit höchsten Stimulationsraten durch Molkeproben der 1.-2. Woche post partum, 2-3 Wochen vor dem Zeitpunkt der höchsten Viruslast in der Muttermilch. Durch Promotermutanten und inhibitorische Substanzen wurde gezeigt, dass die Stimulation des IE1/2 Enhancer/Promotors ein multifaktorieller Prozeß ist, an dem Glukokortikoide eine signifikante Rolle spielen. / In a clinical trial, the incidence of human cytomegalovirus (HCMV) reactivation in breastfeeding mothers, virus transmission to their breastfed preterm infants and the effects of breast milk on HCMV reactivation and replication were studied. Breast milk from 73 mothers as well as urine and tracheal aspirates of their 89 infants were screened weekly for HCMV-DNA during 2 months after delivery. HCMV reactivation and virus shedding could be confirmed in 95% of latently infected mothers. Mother-to-child transmission was concluded for 42% HCMV DNA positive mothers. 22 breastfed infants acquired HCMV infection, two of them with severe symptomatic HCMV infection. The infected infants demonstrated higher incidences of amniotic infection, respiratory distress syndrome and bronchopulmonary dysplasia compared to noninfected infants. We could therefore confirm a high incidence of HCMV reactivation in lactating mothers and a significant risk of transmission to preterm infants by breastfeeding with the possibility of severe disease. The high rates of virus reactivation in mothers led us to focus on the effect of human milk on HCMV reactivation and replication in vitro: Breast milk from 12 breastfeeding mothers was tested for their effects on HCMV Immediate Early (IE)1/2 enhancer/promoter activity, viral replication and IE protein expression in monocytic cell lines and human embryonal lung fibroblasts. All milk samples stimulated HCMV IE1/2 enhancer/promoter activity und IE protein synthesis in these cell lines. The effects followed a characteristic kinetics over time: highest stimulation rates were seen with milk whey collected during the first and second week after delivery preceding the peak in viral load for 2-3 weeks. By using promoter mutants and inhibitors it could be demonstrated that stimulation of the IE1/2 enhancer/promoter is a multifactorial effect in which glucocorticoids play a significant role.

Hantaviren sind wichtige menschliche Krankheitserreger und können das Hämorrhagische Fieber mit renalem Syndrome (HFRS) auslösen, welches sich durch endotheliale Dysfunktion kennzeichnet. Pathogene und nicht-pathogene Hantaviren replizieren sich in Endothelzellen, ohne zytopathische Effekte auszulösen. Dies legt nahe, dass immunpathologische Mechanismen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese spielen. Wir haben die antivirale Antwort nach Infektion mit dem pathogenen Hantaan Virus (HTNV) sowie mit dem weniger pathogenen Tula Virus (TULV) in humanen Endothelzellen (HUVEC) verglichen. Die mit HTNV und auch die mit TULV infizierten Zellen zeigten eine erhöhte Expression von Antigen-präsentierenden Molekülen. Hierbei induzierte TULV die Expression von HLA Klasse I-Molekülen noch effizienter. HTNV sorgte für die Induktion von Interferon (IFN)-???während dieses Zytokin im Überstand von TULV-infizierten HUVEC kaum nachzuweisen war. Trotzdem konnte die Hochregulation von HLA Klasse I-Molekülen auf HTNV- und TULV-infizierten Zellen durch anti-IFN-?-Antikörper blockiert werden. Interessanterweise wurde das antiviral wirksame MxA-Protein, welches die virale Replikation hemmt, bereits 16 Stunden nach einer Infektion mit TULV induziert. Im Gegensatz dazu war MxA in HTNV-infizierten Zellen erst nach 48 Stunden der Infektion nachzuweisen. Der Kinetik der MxA-Expression entsprechend, replizierte sich TULV nur sehr schwach in HUVEC, wohingegen HTNV-infizierte Zellen hohe Virustiter aufwiesen, die nach 48 Stunden der Infektion wieder zurückgingen. Beide Hantavirus-Spezies waren jedoch gleichermaßen effizient in der Lage, sich in Vero E6-Zellen zu replizieren, denen die IFN-induzierte MxA-Antwort fehlt. Die verzögerte Induktion des MxA nach einer Infektion der HUVEC mit HTNV, könnte die Virusausbreitung ermöglichen und mit zur Pathogenese des HFRS beitragen. Das Risiko, sich während der Arbeit im Forschungslabor versehentlich mit Hantaviren zu infizieren, macht spezielle Sicherheitsmaßnahmen zwingend erforderlich. Die Wirkung von chemischen oder physikalischen Inaktivierungsmethoden wurde an HTNV-infizierten Proben untersucht. Die beschriebenen Maßnahmen zur Virus-Desinfektion sind geeignet, eine sichere Handhabung der Proben zu gewährleisten. / Hantaviruses represent important human pathogens and can induce hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS), which is characterised by endothelial dysfunction. Both pathogenic and nonpathogenic hantaviruses replicate without causing any apparent cytopathic effect suggesting that immunopathological mechanisms play an important role in pathogenesis. We compared the antiviral response triggered by Hantaan virus (HTNV), a pathogenic hantavirus associated with HFRS, and Tula virus (TULV), a rather nonpathogenic hantavirus, in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Both HTNV- and TULV-infected cells showed increased levels of molecules involved in antigen presentation. However, TULV-infected HUVEC more rapidly upregulated HLA class I molecules. Interestingly, HTNV clearly induced the production of interferon (IFN)-( whereas expression of this cytokine was barely detectable in the supernatant or in extracts from TULV-infected HUVEC. Nevertheless, upregulation of HLA class I on both TULV- and HTNV-infected cells could be blocked by neutralising anti-IFN-( antibodies. Most strikingly, antiviral MxA protein, which interferes with hantavirus replication, was induced already 16 h after infection with TULV. In contrast, HTNV-infected HUVEC showed no expression of MxA until 48 h postinfection. In accordance with the kinetics of MxA expression TULV only inefficiently replicated in HUVEC whereas HTNV-infected cells produced high titers of virus particles that decreased 48 h postinfection. Both hantavirus species, however, could replicate equally well in Vero E6 cells which lack an IFN-induced MxA response. Thus, a delayed induction of antiviral MxA in endothelial cells after infection with HTNV could allow viral dissemination and contribute to the pathogenesis leading to HFRS. The potential risk of accidental infection by hantaviruses in a clinical or research laboratory necessitates special precautionary measures. To study the elimination of hantavirus infectivity, the effects of different chemical and physical inactivation and depletion procedures were investigated on HTNV-containing materials. The virus inactivation and depletion methods described herein are suitable to prepare non-infectious samples for further use in immunological, virological and cell biological assays.

Hantaviren (Familie Bunyaviridae) sind Erreger, die von Nagetieren auf den Menschen übertragen werden und Hämorrhagische Fieber mit Renalem Syndrom (HFRS) auslösen. Die vorgelegte Arbeit beinhaltet derartige Ergebnisse zu zwei europäischen Hantaviren, dem Dobravavirus (DOBV) und dem Tulavirus (TULV). DOBV ist ein wichtiger HFRS-Erreger in Europa. DOBV Stämme kommen in mindestens zwei Nagerspecies, der Gelbhalsmaus (Apodemus flavicollis) und der Brandmaus (A. agrarius) vor. In Übereinstimmung mit diesen natürlichen Wirten bilden die Virusstämme zwei genetische Linien: DOBV-Af und DOBV-Aa. Die phylogenetischen Analysen von den Nukleotidsequenzen der S-, M- und L-Segmente von sympatrisch vorkommenden DOBV-Af und DOBV-Aa Stämmen aus Mitteleuropa zeigten das Vorkommen von Reassortmentprozessen der Genomsegmente während der Evolution der Virusspecies. Ausserdem, wurde die virale Nukleotidsequenz aus einem DOBV-seropositiven HFRS-Patienten aus Detschland amplifiziert. Damit wurde erstmalig der molekulare Beweis erbracht, dass DOBV in Mitteleuropa HFRS auslöst und dass die DOBV-Aa Linie humanpathogen ist. Aus einer in der Slowakei gefangenen A. agrarius Maus haben wir ein neues Virusisolat gewonnen, welches "Slovakia (SK/Aa)" genannt wurde. SK/Aa ist das bisher einzige Virusisolat, das die DOBV-Aa Linie repräsentiert. Es wurde gemeinsam mit einem Isolat der DOBV-Af Linie zur vergleichenden Typisierung der Antikörper von mitteleuropäischen HFRS-Patienten mittels Fokusreduktionsneutralisationstest eingesetzt. Die Seren der meisten Patienten zeigten die höchsten neutralisierenden Antikörpertiter gegenüber SK/Aa, was die Schlussfolgerung zulässt, dass DOBV-Aa Stämme für die meisten DOBV-Infektionen in Mitteleuropa verantwortlich sind. TULV wird durch die Feldmaus (Microtus arvalis) beherbergt. Die Fähigkeit zur Auslösung von HFRS war bisher wenig bekannt. Wir haben den ersten Fall von HFRS gefunden, der mit einer TULV Infektion assoziiert ist. Aus demselben geographischen Gebiet in Nordostdeutschland konnten aus Feldmäusen TULV Nukleotidsequenzen amplifiziert werden. In phylogenetischen Analysen clustern sie mit Stämmen aus Polen und bilden mit diesen gemeinsam eine eigene, neue genetische Linie. Ausser dem hier untersuchten DOBV und dem länger bekannten Puumalavirus ist TULV offenbar das dritte Hantavirus, das in Mitteleuropa HFRS hervorruft. / Hantaviruses (Bunyaviridae family) are rodent-borne bunyaviruses that cause hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) in Eurasia. This thesis presents novel data about two European hantaviruses, Dobrava virus (DOBV) and Tula virus (TULV). DOBV is an important etiologic agent of HFRS in Europe. DOBV strains were found to be hosted by at least two different rodent species, yellow-necked mouse (Apodemus flavicollis) and striped field mouse (A. agrarius). According to their natural hosts they form the distinct genetic lineages DOBV-Af and DOBV-Aa, respectively. We have determined and analysed the complete S and M, and partial L segment nucleotide sequences of sympatrically occurring DOBV-Af and DOBV-Aa strains from Central Europe. Molecular phylogenetic analyses gave evidence for genetic reassortment in the evolution of the virus species. Moreover, we amplified a DOBV-Aa nucleotide sequence from a DOBV-seropositive HFRS patient from Germany. This is the first molecular identification of human infection by DOBV in Central Europe and the first direct proof that a virus strain related to the DOBV-Aa lineage, carried by A. agrarius rodents, is able to cause HFRS. Under biosafety level 3 conditions, we have established a DOBV isolate named Slovakia (SK/Aa) from an A. agrarius animal captured in Slovakia. SK/Aa, as the only isolate clearly belonging to the DOBV-Aa lineage, can be taken as the representative of this virus lineage. The new virus isolate, in comparison to a DOBV-Af strain, was used for serotyping neutralising antibodies of HFRS patients in Central Europe by the use of a focus reduction neutralisation assay. Most patients'' sera exhibited a higher end-point titer towards SK/Aa suggesting that DOBV-Aa strains are responsible for most of the DOBV HFRS cases in this region. TULV is carried by European common voles (Microtus sp.). Its pathogenic potential for humans was rather unknown. We have described the first case of HFRS which can be associated with TULV infection. Moreover, TULV strains detected in M. arvalis near the home village of the patient in North-East Germany clustered with strains from Poland and represent a new, well-supported genetic lineage within the TULV species. In addition to DOBV and longer known Puumala virus, TULV is most likely an additional causative agent of HFRS in Central Europe.

In Anbetracht der enormen Verbesserung der HCV-Therapie durch die Entwicklung hochwirksamer und direkt wirkender Virostatika (DAA) dient diese Studie der Analyse von HCV-Koinfektionen unter den gemeldeten HIV-Neudiagnosen in Deutschland. Zunächst wurde die Eignung zweier kommerzieller HCV Ag/Ab ELISAs, dem Murex (Abbott) und dem Monolisa (Bio-Rad), zum Nachweis von HCV in getrockneten Serumspots (DSS) verglichen. Der Murex-ELISA zeigte sich sensitiver bei Antigen-positiven Plasma-HCV-Serokonversionsproben während der Monolisa eine höhere Sensitivität bei HCV-Antikörper-positiven DSS-Eluaten. Des Weiteren wurde ein Aviditätstest zur Unterscheidung von neuen und bereits länger bestehenden Infektionen bei einem Aviditätsindex Cut-off von 40% und einem Zeitraum von 364 Tagen etabliert. Von den insgesamt 6.097 untersuchten Proben der Jahre 2015-2017 waren 396 HCV-ELISA-reaktiv (6,5%). Von diesen wurden 256 (64,6%) als aktive und 140 (35,4%) als ausgeheilte Infektionen identifiziert. Ein hoher Anteil der HCV-Koinfektionen wurde bei intra-venösen Drogenkonsumenten (77,8%, n=168/216), in der Altersgruppe der 30-39 Jährigen (9%, n=179/1.978) und bei Menschen osteuropäischer Herkunft (38,3%, n=124/324) beobachtet. Im Vergleich zum Jahr 2016 hat sich der Anteil der ausgeheilten Infektionen im Jahr 2017 bei der Gesamtzahl der Patienten (p<0,01) sowie insbesondere bei Personen ausländischer (p<0,01) und osteuropäischer (p<0,05) Herkunft erhöht. Die HCV Subtypen (St)-1a, St-3a und St-1b waren mit 33,9% (n=79/233), 33,5% (n=78/233) und 23,3% (n=52/233) vorherrschend. Der Anteil der St-1a- und St-1b-Proben, deren HCV-Sequenz gegen DAAs resistent ist, war in allen untersuchten Jahren hoch (25%-42,9%). Der beobachtete Anstieg des Anteils der ausgeheilten HCV-Koinfektionen kann auf die DAA-Therapie zurückgeführt werden. Es sind jedoch weitere Anstrengungen erforderlich, damit Gruppen mit weiterhin hoher HCV-Prävalenz von dieser Behandlung profitieren. / In light of the major shift in HCV therapy resulting from the availability of highly potent direct acting antivirals (DAA), this study performed a surveillance of HCV coinfections among reported HIV new diagnoses in Germany. First the suitability of two HCV Ag/Ab ELISAs, Murex (Abbott) and Monolisa (Bio-Rad) for dried serum spots (DSS) was compared. The Murex was more sensitive in antigen positive plasma HCV seroconversion samples while the Monolisa showed a higher sensitivity in HCV antibody positive DSS eluates. Furthermore, an avidity test was established to distinguish between new and already longer existing infections at an avidity index cut-off of 40% and a period of 364 days. Of the total of 6,097 samples examined for the years 2015-2017, 396 were HCV ELISA reactive (6.5%). Of these, 256 (64.6%) were identified as active and 140 (35.4%) as resolved infections. A high proportion of HCV coinfections were observed in intravenous drug users (77.8%, n=168/216), in the age group 30-39 years (9%, n=179/1,978) and in people of Eastern European origin (38.3%, n=124/324). Compared to 2016, the proportion of resolved infections in 2017 has increased in the total number of patients (p<0.01) and especially in people of foreign (p<0.01) and Eastern European (p<0.05) origin. HCV subtypes (St)-1a, St-3a, and St-1b were predominant with 33.9% (n=79/233), 33.5% (n=78/233) and 23.3% (n=52/233), respectively. The proportion of St-1a and St-1b samples whose HCV sequence has resistance to DAAs was high in all diagnoses years (25%-42.9%). The observed increase in the proportion of resolved HCV coinfections can be attributed to DAA therapy. However, further efforts are needed to ensure that groups with continued high HCV prevalence benefit from this treatment.

Obwohl der Wildtyp des Hepatitis-B-Virus (HBV) nicht zytopathogen und die Pathogenese der Hepatitis B generell immunvermittelt ist, können in immunsupprimierten Nierentransplantatempfängern mit chronischer Hepatitis B schwere Leberschäden bis hin zu Leberzirrhose und Leberversagen entstehen. Die Entwicklung von Leberzirrhose in den Nierentransplantierten ist assoziiert mit der Akkumulation und Persistenz von komplexen HBV-Varianten mit Mutationen im Core-Promotor / X-Gen, Deletionen im Core (C)-Gen und teilweise zusätzlichen Deletionen im präS-Bereich. Dies lässt eine Rolle der Varianten in der speziellen Pathogenese bei Immunsupprimierten vermuten. In der vorliegenden Arbeit wurden funktionelle Analysen der komplexen Varianten im Vergleich zu Referenz-Wildtypgenomen und Wildtyp-ähnlichen Genomen der Patienten aus der frühen Infektionsphase durchgeführt, um Hinweise auf den potentiellen Beitrag der Varianten zur Pathogenese zu erlangen. Die Analysen erfolgten durch transiente Transfektion der humanen Hepatomazelllinie HuH7 mit repräsentativen HBV-Gesamtgenomen, die aus 2 Patienten während des Krankheitsverlaufs von einer asymptomatischen Infektion hin zur Leberzirrhose isoliert und kloniert worden waren. Trotz einiger Unterschiede im Detail wiesen die komplexen Varianten einen gemeinsamen, drastisch vom Wildtyp abweichenden Phänotyp auf. Dieser war gekennzeichnet durch eine veränderte Transkription mit reduzierten präC- und Oberflächen-mRNAs und verstärkter Expression der prägenomischen RNA, eine starke Reduktion des häufigsten Spleißprodukts der prägenomischen RNA, SP1, eine extrem reduzierte oder fehlende Expression und/oder Sekretion aller Oberflächenproteine und des HBeAg, ein verändertes intrazelluläres Verteilungsmuster des schwach exprimierten Core-Proteins und teilweise der Oberflächenproteine sowie eine erhöhte Replikation und Anreicherung gegenüber Wildtyp-HBV aufgrund einer verstärkten reversen Transkription der prägenomischen RNA. Dieser Phänotyp basierte zum Teil auf den Mutationen in Core-Promotor und C-Gen, wurde jedoch deutlich durch zusätzliche Mutationen in den übrigen Genomabschnitten beeinflusst. Die vielfältigen Veränderungen der Varianten unterstützen ihren vermuteten Beitrag zur Pathogenese. / Although wild-type hepatitis B virus is not cytopathogenic and the pathogenesis of hepatitis B is generally immune mediated, also immuno-suppressed patients, such as renal transplant recipients, with chronic hepatitis B may develop liver cirrhosis and end-stage liver disease. In renal transplant recipients, the development of liver cirrhosis is associated with the accumulation and persistence of complex HBV variants with mutations in core promoter / X gene, deletions in core (C) gene and sometimes additional deletions in the preS region. This suggests a role of these variants in the special pathogenesis in immuno-suppressed patients. In the present work, the complex variants were functionally analyzed in comparison to reference wild-type genomes and wild-type-like HBV genomes from the early asymptomatic phase of infection. For the analyses, representative cloned full-length HBV genomes isolated from 2 patients before and during liver cirrhosis were transiently transfected into the human hepatoma cell line HuH7. In spite of some variations, the complex variants showed a common phenotype, which was drastically altered compared to wild-type. It was characterized by reduced preC and surface mRNAs and increased expression of pregenomic RNA, by a strong reduction of the major spliced pregenomic RNA, SP1, by a partial or complete defect in expression and/or secretion of surface proteins and HBeAg, by an aberrant intracellular localization of the weakly expressed core protein and in some cases of the surface proteins, and by an enhanced replication and enrichment over wild-type HBV due to an enhanced reverse transcription of variant pregenomic RNA. The phenotypic alterations were often based on the mutations in core promoter and C gene but were considerably influenced by the additional mutations in other genomic regions. The multiple functional changes of the variants support their assumed contribution to pathogenesis.