Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-05-11T18:26:05Z No. of bitstreams: 1 patriciadealmeidamachado.pdf: 4548121 bytes, checksum: f773fa1c31a3db1b43310dcfaf89e879 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-05-17T15:22:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 patriciadealmeidamachado.pdf: 4548121 bytes, checksum: f773fa1c31a3db1b43310dcfaf89e879 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-17T15:22:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 patriciadealmeidamachado.pdf: 4548121 bytes, checksum: f773fa1c31a3db1b43310dcfaf89e879 (MD5) Previous issue date: 2017-02-20 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As leishmanioses são doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania, causando grande impacto na saúde pública mundial. O tratamento é limitado por uma série de fatores e a necessidade de alternativas para a quimioterapia é urgente. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade leishmanicida de bioisósteros do resveratrol e seus complexos metálicos e estudar o mecanismo de morte do parasito associado ao tratamento. Foram testados doze biosósteros do resveratrol, sendo cinco não complexados a metais, quatro complexados a ouro e três complexados a vanádio, em formas promastigotas e amastigotas de L. amazonensis, L. braziliensis e L. major e em macrófagos peritoneais. Para o teste em promastigotas e em macrófagos peritoneais, a viabilidade celular foi avaliada pelo método colorimétrico do MTT, enquanto no teste em amastigotas, o efeito dos compostos foi avaliado pela contagem das formas intracelulares. Foi ainda avaliada a seletividade e a especificidade dos compostos, através do cálculo do índice de seletividade e do índice de especificidade de cada composto. Os compostos complexados a metais, comparados aos não complexados, apresentaram significante efeito em promastigotas e amastigotas de Leishmania sp., e ainda foram seletivos ao parasito, em comparação com a célula hospedeira. Posteriormente, baseado na síntese, efetividade e seletividade, o composto 11 (VOSalophen), um complexo de vanádio, foi selecionado para estudos sobre mecanismos de morte e atividade em modelo de leishmaniose cutânea murina. Promastigotas de L. amazonensis tratadas com VOSalophen apresentam alterações mitocondriais, observados por meio das marcações com JC-1, Mitotracker® Red CM-H2XROS e rodamina 123 e da microscopia eletrônica de transmissão (MET); aumentam a produção de EROs (utilizando H2DCFDA), acumulam corpos lipídicos (marcação com Nile Red), apresentam alterações morfológicas, mas não alteram a integridade da membrana plasmática, visto não haver marcação com iodeto de propídeo. Além disto, os parasitos apresentam redução no tamanho celular e volume celular; externalização de fosfatidilserina na face externa da membrana plasmática do parasito (usando marcação com anexina V-FITC) e utilizando a técnica do TUNEL foi observada a fragmentação do DNA. Em amastigotas intracelulares de L. amazonensis, também foi verificada fragmentação do DNA (técnica TUNEL). O conjunto destes resultados sugere morte por apoptose-like. Além disso, foi verificado um aumento de formação de vacúolos autofágicos em promastigotas de L. amazonensis tratados com o VOSalophen (marcação com MDC e MET), sugerindo a ocorrência de autofagia. Em macrófagos infectados com L. amazonensis, VOSalophen induz um aumento de produção de ON e EROs, indicando modulação celular do composto em células infectadas. Em modelo de leishmaniose cutânea murina, o tratamento com o VOSalophen causou significativa redução da carga parasitária nas patas de camundongos BALB/c infectados com L. amazonensis, quando comparado ao controle e além disso, não mostrou toxicidade renal e hepática aos animais tratados, o que foi avaliado através das dosagens de AST, ALT, GGT e creatinina. Esses resultados, em conjunto, mostram o significante efeito in vitro e in vivo de bioisósteros do resveratrol complexados a metais. / Leishmaniasis is diseases caused by protozoa of the genus Leishmania, causing significant impact on global public health. The treatment is limited by a number of factors, and the need for alternatives to chemotherapy is urgent. Thus, this study aimed to evaluate the leishmanicidal activity of bioisosters of resveratrol and its metal complexes and to study the mechanism of parasite death associated with the treatment. Twelve biosósteros of resveratrol were tested, five not complexed to metals, four complexed to gold and three complexed to vanadium, in promastigotes and amastigotes of L. amazonensis, L. braziliensis and L. major and in peritoneal macrophages. In promastigotes and peritoneal macrophages, the cell viability was assessed by the MTT colorimetric method, while in amastigotes, the effect of the compounds was evaluated by counting the intracellular forms. It was also assessed the selectivity and specificity of the compounds, by calculating the selectivity index and the specificity index of each compound. The compounds complexed to metals, compared to non-complexed, showed a significant effect on promastigotes and amastigotes of Leishmania sp., and were further selective to the parasite compared to the host cell. Subsequently, based on the synthesis, effectiveness and selectivity, the compound 11 (VOSalophen), a vanadium complex, was selected for studies on the mechanisms of death and activity in the murine model of cutaneous leishmaniasis. L. amazonensis promastigotes treated with VOSalophen exhibit mitochondrial alterations, which was observed by JC-1, Mitotracker® Red CMH2XROS e rhodamina 123 staining and transmission electronic microscopy (TEM); increased ROS production (using H2DCFDA); accumulate lipid bodies (Nile Red staining), exhibit morphological changes, but did not alter the integrity of the plasma membrane since no staining with propidium iodide. In addition, the parasites had a reduction in cell volume and size; phosphatidylserine externalization on the outer face of parasite's plasma membrane (annexin V-FITC staining) and using the TUNEL technique, DNA fragmentation was observed. In L. amazonensis intracellular amastigotes, DNA fragmentation was also observed (TUNEL technique). This set of results suggests death by apoptosis-like. Furthermore, there was an increase of autophagic vacuole formation in L. amazonensis promastigotes treated with VOSalophen (MDC staining and TEM), suggesting the occurrence of autophagy. In macrophages infected with L. amazonensis, VOSalophen induces an increase of nitric oxide and reactive oxygen species production, indicating a modulatory effect in infected cells. In the murine model of cutaneous leishmaniasis, the treatment with VOSalophen caused a significant reduction in the parasite load in the paws of BALB/c mice infected with L. amazonensis, when compared to control and furthermore not showed renal and hepatic toxicity to the treated animals, which was evaluated by the AST, ALT, GGT and creatinine dosages. These results, taken together, show the significant effect of bioisosters of resveratrol complexed to metals.

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-08-17T11:16:52Z No. of bitstreams: 1 lucianamariaribeiroantinarelli.pdf: 16756474 bytes, checksum: 2304892df326fd4997c78bc7f0870bae (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-08-17T11:34:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 lucianamariaribeiroantinarelli.pdf: 16756474 bytes, checksum: 2304892df326fd4997c78bc7f0870bae (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-17T11:34:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lucianamariaribeiroantinarelli.pdf: 16756474 bytes, checksum: 2304892df326fd4997c78bc7f0870bae (MD5) Previous issue date: 2017-02-15 / As leishmanioses representam um grande problema de saúde pública mundial com sérias limitações na quimioterapia atual, como: número limitado de fármacos, baixa eficácia, custo elevado, crescente resistência parasitária e toxicidade. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade de uma série de dez derivados de 4- aminoquinolinas em espécies de Leishmania relacionadas a leishmaniose tegumentar. Avaliar os possíveis mecanismos de ação do composto com atividade antileishmanial promissora, identificando as organelas alvo e os processos de morte celular desencadeados no parasito, bem como a sua eficácia in vivo. Dentre os compostos avaliados, o derivado AMQ-j foi o mais ativo, com atividade expressiva em L. amazonensis e L. braziliensis (CI50 menor que 6.0 μg/mL e 2,5 μg/mL em promastigotas e amastigotas intracelulares, respectivamente) para ambas as espécies avaliadas. O composto AMQ-j apresentou baixa toxicidade para macrófagos murinos (CC50> 40.0 μg/mL), sendo mais tóxico para amastigotas intracelulares (Índice de Seletividade>12,0). Os resultados preliminares acerca do modo de ação apontam que o composto AMQ-j induziu drásticos efeitos na mitocôndria do parasito e caracterizado pelo colapso do potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm), inchaço da organela, aumento na produção de Espécies Reativas do Oxigênio (EROS) e acúmulo de corpúsculos lipídicos (CLs) no citoplasma. O tratamento com AMQ-j induziu nas formas promastigotas uma série de alterações bioquímicas e celulares sugestivas de morte por apoptose-like como redução do volume celular, exposição de fosfatidilserina no folheto externo da membrana plasmática, manutenção da integridade da membrana plasmática e alterações drásticas no núcleo celular evidenciadas por meio da desorganização da cromatina e fragmentação do DNA. O efeito do composto em promastigotas está também associado à indução de morte por autofagia evidenciada pelo aumento de vacúolos autofágicos, presença de corpos multivesiculares dentro de vacúolos, vesículas citoplasmáticas e acúmulo de compartimentos acídicos no citoplasma dos promastigotas. O composto também induziu fragmentação do DNA dos amastigotas intracelulares de modo seletivo, sem induzir fragmentação da célula hospedeira. Estudos in silico sugerem que AMQ-j é um potencial inibidor da tripanotiona redutase (TryR), enzima fundamental na defesa antioxidante do parasito. Estudos in vivo em modelo murino de infecção com L. amazonensis demonstraram a eficácia do AMQ-j pela via intralesional na redução do tamanho da lesão e da carga parasitária, sem indução de toxicidade hepática, cardíaca e renal. Os estudos de predição in silico relacionados a propriedades farmacocinéticas (ADMET) e características físico-químicas (regra de Lipinsky) sugerem que AMQ-j pode ser utilizado pela via oral. O efeito leishmanicida do composto está associado a múltiplos alvos, desencadeando a morte do parasito por diferentes vias, como apoptose e autofagia. O efeito in vivo do composto aponta para a necessidade da continuidade dos estudos no intuito de melhor estabelecer o seu efeito leishmanicida. / Leishmaniasis represents a major global public health problem with serious limitations in current chemotherapy, such as limited number of drugs, low efficacy, high cost, increasing parasitic resistance and toxicity. The objective of the present study was to evaluate a series of ten 4-aminoquinolines derivatives (AMQs) on Leishmania species related to tegumentary leishmaniasis. It was also evaluated the possible mechanisms of action of a compound with promising leishmanicidal activity, identifying the target organelles and the type of death triggered in the parasite, as well as to its leishmanicidal effect in vivo. Among the evaluated compounds, the AMQ-j derivative was the most active, with expressive activity on L. amazonensis and L. braziliensis (IC50 less than 6.0 μg/mL and 2.5 μg/mL against intracellular promastigotes and amastigotes, respectively) for both evaluated species. Furthermore, AMQ-j showed low toxicity for murine macrophages (CC50> 40.0 μg/mL) being more destructive to the intracellular parasites (selectivity index > 12.0). Preliminary studies about the mode of action showed that AMQ-j compound induced marked effects on the parasite mitochondria, characterized by mitochondrial membrane potential collapse (ΔΨm), organelle swelling, increased of Reactive Oxygen Species (ROS) production and lipidic bodies accumulation in the cytoplasm. The treatment with AMQ-j induced in the promastigote forms a series of biochemical and cellular alterations which suggest apoptosis-like death, including reduction of cellular volume, phosphatidylserine exposure on the outer leaflet of the plasma membrane, maintenance of plasma membrane integrity and drastic changes in the cell nucleus evidenced by chromatin disorganization and DNA fragmentation. The effect of AMQ-j in promastigote forms is also associated with the induction of death by autophagy evidenced by the increase of autophagic vacuoles, presence of multivesicular bodies inside vacuoles, cytoplasmic vesicles and accumulation of acidic compartments in the promastigote cytoplasm. The compound also induced DNA fragmentation of intracellular amastigotes selectively, without inducing host cell fragmentation. In silico studies suggest that this compound is a potential inhibitor of key redox enzyme trypanothione reductase (TryR). In vivo studies in murine infection model of L. amazonensis demonstrated the efficacy of AMQ-j by the intralesional route, reducing lesion size and parasite load, without induction of hepatic, cardiac and renal toxicity. The in silico prediction studies on pharmacokinetic properties (ADMET) and physico-chemical characteristics (Lipinsky's rule) suggest that AMQ-j can be used orally. Taken together, the results suggest that the leishmanicidal effect of the compound is associated with multiple targets and triggers parasite death through different pathways, including apoptosis and autophagy. The in vivo effect indicates that studies with this compound should be continued in order to better establish its leishmanicidal effect.

Submitted by Geandra Rodrigues (geandrar@gmail.com) on 2018-04-10T18:23:45Z No. of bitstreams: 1 stephanelimacalixto.pdf: 3753314 bytes, checksum: 81fe7e710d2a4f72d60b8c74e25040de (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-04-11T15:17:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 stephanelimacalixto.pdf: 3753314 bytes, checksum: 81fe7e710d2a4f72d60b8c74e25040de (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-11T15:17:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 stephanelimacalixto.pdf: 3753314 bytes, checksum: 81fe7e710d2a4f72d60b8c74e25040de (MD5) Previous issue date: 2018-02-22 / As leishmanioses são doenças infecciosas, porém não contagiosas, causadas por protozoários do gênero Leishmania. Os fármacos atualmente empregados para o tratamento das leishmanioses apresentam inúmeros problemas, como alta toxicidade, são dispendiosos, além de mostrarem baixa eficácia em áreas endêmicas devido à resistência observada de várias espécies do parasito. Visto derivados de quinolinas apresentarem como uma classe de moléculas promissoras para o tratamento das leishmanioses, este trabalho teve como objetivo analisar o efeito antileishmanial de novos derivados 4-amino-7-cloroquinolina e a toxicidade em macrófagos peritoneais de camundongos. Objetivou-se também avaliar o modo de ação do composto mais efetivo. Dentre os três compostos avaliados, genericamente denominados de derivados de quinolina (DQ), o composto mais promissor foi o DQ3 (CI50 de 43,25 e 39,19 μM para promastigotas de L. amazonensis e L. braziliensis, respectivamente; CC50 de 226,79 μM; e CI50 de 5,62 e 5,48 para amastigotas de L. amazonensis PH8 e GFP, respectivamente), sendo então o escolhido para os estudos dos possíveis mecanismos de morte celular. Promastigotas de L. amazonensis foram tratados com o composto DQ3 e posteriormente as células foram analisadas quanto a vários parâmetros morfológicos, ultraestruturais e bioquímicos. O tratamento dos promastigotas com o composto DQ3 induziu redução do potencial de membrana mitocondrial, observado pelas marcações com JC-1 e rodamina 123, inchaço mitocondrial observado pela MET e aumento da produção de ROS (marcação com H2DCDFA), sugerindo que o composto tem a mitocôndria como um alvo importante. Além disso, induziu externalização de fosfatidilserina (marcação com anexina V), aumento na população de células na fase sub G0/G1, indução de núcleo apoptótico e alterações morfológicas (corpos arredondados e redução do volume celular). Esses dados sugerem que o composto possa induzir apoptose-like em L. amazonensis. Descartou-se a hipótese de morte por necrose e autofagia, visto que a membrana plasmática se manteve íntegra e não foi observado, pela marcação com MDC, a formação de vacúolos autofágicos. O tratamento dos macrófagos infectados com L. amazonensis induziu aumento na produção de ROS, entretanto o mesmo não foi observado em macrófagos não infectados, sugerindo o estresse oxidativo como um modo de ação deste composto. Também, o tratamento induziu alterações morfológicas nos amastigotas intracelulares. Os resultados obtidos, in vitro, mostram que o composto DQ3 apresenta potencial para ser um agente antileishmanial, estimulando a continuidade da pesquisa no modelo in vivo. / Leishmaniasis is an infectious but non-contagious disease caused by protozoa of the genus Leishmania. The drugs currently used for the treatment of leishmaniasis present numerous problems, such as high toxicity, are expensive, and show low efficacy in endemic areas due to the observed resistance of several species of the parasite. Given quinolines derivatives as a class of promising molecules for the treatment of leishmaniasis, this work aimed to analyze the antileishmanial effect of new 4-amino-7-chloroquinoline derivatives and the toxicity in mouse peritoneal macrophages. The objective of this study was also to evaluate the mode of action of the most effective compound. Among the three evaluated compounds, generically denominated quinoline derivatives (DQ), the most promising compound was DQ3 (IC50 of 43.25 and 39.19 μM for L. amazonensis and L. braziliensis promastigotes, respectively, CC50 of 226.79 μM, and IC50 of 5.62 and 5.48 for amastigotes of L. amazonensis PH8 and GFP, respectively), being then chosen for the studies of the possible mechanisms of cell death. Promastigotes of L. amazonensis were treated with the compound DQ3 and later the cells were analyzed for several morphological, ultrastructural and biochemical parameters. Treatment of the promastigotes with the DQ3 compound induced reduction of the mitochondrial membrane potential observed by the JC-1 and rhodamine-123 markers, mitochondrial swelling observed by MET and increased ROS production (H2DCDFA labeling), suggesting that the compound has the mitochondria as an important target. In addition, it induced phosphatidylserine externalization (annexin V labeling), increase in cell population in the sub G0/G1 phase, induction of apoptotic nucleus and morphological changes (rounded bodies and reduction of cell volume). These data suggest that the compound may induce apoptosis-like in L. amazonensis. The hypothesis of death due to necrosis and autophagy was discarded, since the plasma membrane remained intact and the formation of autophagic vacuoles was not observed by MDC labeling. The treatment of macrophages infected with L. amazonensis induced an increase in the production of ROS, but the same was not observed in uninfected macrophages, suggesting oxidative stress as a mode of action of this compound. Also, the treatment induced morphological changes in intracellular amastigotes. The results obtained, in vitro, show that the compound DQ3 presents potential to be an antileishmanial agent, stimulating the continuity of the research in the in vivo model.