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L‘arsenic et l‘antimoine bien que n‘étant pas recensés parmi les polluants majeurs de l‘environnement sont souvent retrouvés associés à d‘autres contaminants. En France, et plus particulièrement dans la région Auvergne, de nombreux sites miniers où s‘effectuait l‘extraction de l‘antimoine sont désormais à l‘abandon. Pouvant présenter des risques pour les populations avoisinantes, leur réhabilitation est donc une mission d‘intérêt public. L‘idée de ce travail de doctorat est de tester l‘effet d‘un catalyseur : le ver de terre sur l‘efficacité des processus de phytoremédiation. En tant qu‘« ingénieurs du sol », ils sont à la base des processus de pédogénèse et peuvent donc assurer la restructuration du sol. De plus, de nombreuses études ont montré leurs effets positifs sur la production de biomasse végétale. Cependant, les mécanismes moléculaires responsables de cette acroissement de production demeurent méconnus. Un système expérimental novateur, jamais utilisé en Ecologie des Sols et couplant la plante modèle Arabidopsis thaliana (L.) Heynh et Aporrectodea caliginosa (Savigny), un ver de terre endogé commun des régions tempérées, a été mis en place afin de 1) identifier les principales voies métaboliques modifiées en réponse aux vers de terre et pouvant expliquer leurs effets positifs sur la croissance et le développement des végétaux, 2) étudier la nutrition minérale en fer et en phosphate, notamment au niveau des variations d‘expression des transporteurs de ces deux éléments, 3) tester ce système pour la phytoextraction de sédiments, issus d‘un ancien site minier, contaminés à l‘arsenic et à l‘antimoine. Les résultats montrent que l‘amélioration des processus de minéralisation est déterminante dans l‘accroissement de la biomasse d‘Arabidopsis thaliana qui se traduit aussi par une élévation des teneurs en azote dans les parties aériennes. Cependant, la présence de phytohormones, produites par des bactéries activées par leur transit dans le ver de terre semble également impliquée dans le renforcement de l‘absorption d‘azote. A l‘échelle moléculaire, les vers entraînent une surexpression du gène HBT, impliqué dans la division cellulaire et semblent diminuer le stress oxydant puisque la quantité de transcrits SOD Cu/Zn diminue. Les résultats montrent de plus que les vers de terre augmentent de façon significative l‘absorption et l‘accumulation de fer, de phosphate et d‘autres minéraux essentiels à la croissance du végétal. Moléculairement, l‘augmentation de l‘absorption des nutriments se traduit par une augmentation de la transcription de certains gènes codant des transporteurs tels que PHT1.3, qui est un transporteur de haute affinité pour le phosphate. Une augmentation de la transcription et également de l‘activité de la protéine FRO2, qui est à l‘origine de la chélation et de la réduction du fer a été observée. Dans les feuilles, les vers de terre induisent de manière systémique la surexpression d‘un transporteur de phosphate localisé dans les chloroplastes, PHT2.1 et la surexpression de transporteurs du fer appartenant à la famille des NRAMPs, notamment NRAMP1,2 et 6. Dans le contexte d‘une problématique de phytoremédiation, l‘effet des vers de terre sur la capacité de phytoextraction d‘Arabidopsis a été testé et, il ressort clairement de cette étude que les vers de terre permettent une meilleure absorption d‘antimoine et d‘arsenic. Cependant, ces deux métalloïdes tendent à rester dans les racines et ne sont que faiblement transferrés vers les parties aériennes. Cette formidable augmentation des concentrations en polluants dans les racines entraîne un retard de croissance considérable et affecte, dans une moindre mesure cependant, l‘activité photosynthétique et les échanges gazeux d‘Arabidopsis. Ainsi, ce travail de thèse a donc tout d‘abord démontré la sensibilité aux vers de terre de la plante modèle Arabidopsis thaliana. Ce système expérimental novateur offre de nouvelles possibilités de recherches dans le domaine des études des interactions entre les vers de terre et les plantes, notamment en raison de la grande diversité de mutants d‘Arabidopsis. De plus, ce travail a également permis de démontrer le rôle crucial de catalyseur que peuvent jouer les vers de terre en vue d‘optimisation des processus de phytoextraction. / Arsenic and antimony do not belong to the major pollutants of the environment but are offen foun associated with other contaminants. In France, more specifically in Auvergne region, a large number of old mining site where antimony was extracted are currently abandoned. As they present several risks for the neighbourhood populations, their habilitaion appears to be essential. The main idea if this PhD work is to test a catalysor: the earthworms in order to increase phytoremédiation efficacity. As ―soils ingeniors‖, they are involved in pedogenesis process and can lead to soil reorganization. Moreover, several studies have presented their positive effects on plant biomass. Nevertheless, the molecular mechanisms responsible of this production enhancement remain still unknown. An innovative experimental system, never used in Soil Ecology, using the model plant Arabidopsis thaliana (L.) Heynh and the endogeic temperate earthworms Aporrectodea caliginosa (Savigny) has been set up. This research work has three goals. First, identify the main metabolic pathway affected by earthworm presence and able to explain their positive effects on plant growth and development. Then, this research work focused on phosphorus and iron nutrition particularly by studing the molecular variation of several transporters of these elements. Lastly this system has been tested for phytoextraction of wastes from an old mining site polluted by arsenic and antimony. In the first part of this study, the mineralization process improvement appears to be a determining factor in Arabidopsis growth enhancement due to nitrogen increase in the shoots. Nevertheless, phytohormones producted by bacteria activated during their transit into earthworm gut seem to be involved in nitrate assimilation. At the molecular scale, earthworms enhance an overaccumulation of HBT transcripts involved in cell division and they seem to decrease the oxidative stress as SOD transcripts are underexpressed. The second part of this study focused on mineral nutrition. Results show that earthworms enhance significantly the uptake and accumulation of phosphorus, iron and other growth essential minerals. At the molecular scale, the nutrient uptake increase result in an increase of several transporters such as Pht1.3, which is a high affinity phosphate transporter and also an overexpression and an increase in enzymatic activity of the ferric chelate reductase protein FRO2. In the leaves, this experiment also show the overaccumulation of a phosphate chloroplastic transporter Pht2.1 and over expression of iron transporter belonging to the NRAMPS family, especially NRAMP1,2 and 6. Then, this system has been transposed to the phytoremédiation and earthworm effects have been tested on the phytoextraction properties of Arabidopsis. Earthworms allow a better uptake of arsenic and antimony. Nevertheless the pollutants tend to remain in the root system and are not translocated in the aerial part. This incredible increase in pollutant tissue concentration leads to a growth and development delay and affect the Arabidopsis photosynthetic activity. To conclude, this PhD work has first shown earthworm sensitivity of Arabidopsis. This innovative system offers new investigation possibilities in the interaction between earthworms and plant area, especially due to the large range of Arabidopsis mutants. Moreover, this work has also demonstrated the key role as catalysor that can play earthworms in order to optimize phytoremédiation process.

Les pesticides utilisés pour protéger les plantes des insectes nuisibles constituent une menace pour les organismes non cibles tels que les vers de terre. En raison de leur activité de bioturbation de sol, les vers de terre sont en contact direct avec les particules et les micro-organismes du sol, ainsi qu'avec les polluants, notamment les pesticides. L‘objectif de ce travail est d‘étudier (1) l‘effet d‘un organophosphoré (OP) «éthyl-parathion» sur la sensibilité de deux espèces de vers de terre endogés, Aporrectodea caliginosa et Allolobophora chlorotica; et (2) le rôle du microbiote intestinal, en synergie avec les voies de détoxification du ver de terre, dans la tolérance ou la détoxification des pesticides. Dans la première partie, les réponses biochimiques et comportementales ont montré que A. caliginosa est plus sensible à l'exposition à «l‘éthyl-parathion» que A. Chlorotica. Les résultats portent sur l‘analyse de biomarqueurs physiologiques (poids), biochimiques (AChE, CbEs, GST) et comportementaux (production de turricules et activité de creusement). Nous avons montré que la sensibilité de A. caliginosa semble liée à la sensibilité intrinsèque de l‘AChE à «l‘éthyl-parathion». De plus, le rôle des carboxylestérases, capables de piéger les insecticides OP, ainsi que le rôle de détoxification des GST notamment, ne semblaient pas être des mécanismes efficaces impliqués dans la tolérance de A. chlorotica. Dans la deuxième partie, nous avons caractérisé, en présence ou non d‘insecticide, le microbiote dans le sol ingéré, les turricules et les intestins des 2 vers de terre. Nos résultats ont montré des différences dans la composition microbienne de ces compartiments. A cet égard, nous avons suggéré que chacune de ces espèces hébergent un microbiote spécifique de l‘espèce dans leur intestin. Nos résultats ont notamment montré que l‘intestin du ver de terre agit comme un «filtre biologique» pour les communautés microbiennes ingérées lors du passage dans l‘intestin. A ce niveau, nous avons identifié, au niveau bactérien, quatre genres dominants dans l'intestin de A. caliginosa et deux genres dominants dans l'intestin de A. chlorotica. Nous avons notamment identifié une souche de Rhodococcus, très abondante dans l'intestin de A. chlorotica. Des études ont montré que des souches de Rhodococcus peuvent dégrader certains groupes de pesticides. Nous suggérons que la présence de cette souche pourrait contribuer à la tolérance de A. chlorotica. Enfin, nous avons montré que l‘effet de l‘éthyl-parathion sur les activités enzymatiques du sol dépend principalement de la texture du sol et non pas de la présence et/ou de l‘espèce de ver de terre.Selon nos conclusions, il est extrêmement important d'inclure plus d'une espèce pour évaluer la toxicité des insecticides organophosphorés, en raison des différences interspécifiques pouvant se produire au sein d'une même catégorie écologique. De plus, l'identification et l'analyse fonctionnelle des micro-organismes présents au niveau de l‘intestin et susceptibles d'intervenir dans la détoxication des pesticides permettraient d‘améliorer nos connaissances sur le devenir du pesticide dans l'organisme et pourraient constituer un outil important dans les programmes de bioremédiation. / Pesticides used to protect plants from pests, threat grievously non-target organisms such as earthworms. Due to their feeding and burrowing activities, earthworms are in direct contact with soil particles and microorganisms, as well as pollutants including pesticides. This work investigated (1) the effect of an organophosphate “ethyl-parathion” on the sensitivity of two endogeic earthworms’ species, Aporrectodea caliginosa and Allolobophora chlorotica; and (2) the role of the gut-microbiota, in synergy with the earthworm’s detoxification pathways, in pesticide tolerance or detoxification. In the first part, biochemical and behavioral responses showed that A. caliginosa is more sensitive to “ethyl-parathion” exposure than A. chlorotica. The endpoints measured ranged from physiological (weight), biochemical (AChE, CbEs, GST) to behavioral biomarkers (cast production and burrowing activity). Our findings showed that the sensitivity of A. caliginosa could be mainly due to the intrinsic sensitivity of its AChE to “ethyl-parathion”. The role of the carboxylesterases, acting as bioscavenger of OP, and the role of the detoxifying enzymes GST did not appear to be efficient mechanisms involved in A. chlorotica tolerance. In the second part, we aimed to characterize the microbiome within the ingested soil, the cast and the gut tissue of A. caliginosa and A. chlorotica in control or polluted soils. Our results showed differences in the microbial composition between these compartments. In this line, we suggested that these two earthworms’ species harbor a species-specific microbiome in their gut. In particular, our findings showed that the earthworm’s gut acts as a “biological filter” for ingested microbial communities during the gut passage. At the level of the gut, we identified four dominated genus within the gut of A. caliginosa versus two dominated genus in the gut of A. chlorotica. Notably, we identified a Rhodococcus strain, which is highly abundant in the gut of A. chlorotica. Previous studies reported Rhodococcus strains for their ability to degrade some group of pesticides. We suggest that the presence of this strain could contribute to the tolerance of A. chlorotica. Finally, we showed that the effect of ethyl-parathion on soil enzyme activities mainly depend on soil texture rather than the presence and/or the species of earthworms. According to our findings, it is of considerable importance to include more than one species to assess toxicity from organophosphorus insecticides, due to the interspecific differences that can occur within the same ecological category. Moreover, the identification and the functional analysis of the microorganisms found in the earthworm’s gut and able to intervene in pesticide detoxification could enhance our knowledge about the fate of the pesticide inside the organism, and could be an important tool for bioremediation program.

L'arsenic et l'antimoine bien que n'étant pas recensés parmi les polluants majeurs de l'environnement sont souvent retrouvés associés à d'autres contaminants. En France, et plus particulièrement dans la région Auvergne, de nombreux sites miniers où s'effectuait l'extraction de l'antimoine sont désormais à l'abandon. Pouvant présenter des risques pour les populations avoisinantes, leur réhabilitation est donc une mission d'intérêt public. L'idée de ce travail de doctorat est de tester l'effet d'un catalyseur : le ver de terre sur l'efficacité des processus de phytoremédiation. En tant qu'" ingénieurs du sol ", ils sont à la base des processus de pédogénèse et peuvent donc assurer la restructuration du sol. De plus, de nombreuses études ont montré leurs effets positifs sur la production de biomasse végétale. Cependant, les mécanismes moléculaires responsables de cette acroissement de production demeurent méconnus. Un système expérimental novateur, jamais utilisé en Ecologie des Sols et couplant la plante modèle Arabidopsis thaliana (L.) Heynh et Aporrectodea caliginosa (Savigny), un ver de terre endogé commun des régions tempérées, a été mis en place afin de 1) identifier les principales voies métaboliques modifiées en réponse aux vers de terre et pouvant expliquer leurs effets positifs sur la croissance et le développement des végétaux, 2) étudier la nutrition minérale en fer et en phosphate, notamment au niveau des variations d'expression des transporteurs de ces deux éléments, 3) tester ce système pour la phytoextraction de sédiments, issus d'un ancien site minier, contaminés à l'arsenic et à l'antimoine. Les résultats montrent que l'amélioration des processus de minéralisation est déterminante dans l'accroissement de la biomasse d'Arabidopsis thaliana qui se traduit aussi par une élévation des teneurs en azote dans les parties aériennes. Cependant, la présence de phytohormones, produites par des bactéries activées par leur transit dans le ver de terre semble également impliquée dans le renforcement de l'absorption d'azote. A l'échelle moléculaire, les vers entraînent une surexpression du gène HBT, impliqué dans la division cellulaire et semblent diminuer le stress oxydant puisque la quantité de transcrits SOD Cu/Zn diminue. Les résultats montrent de plus que les vers de terre augmentent de façon significative l'absorption et l'accumulation de fer, de phosphate et d'autres minéraux essentiels à la croissance du végétal. Moléculairement, l'augmentation de l'absorption des nutriments se traduit par une augmentation de la transcription de certains gènes codant des transporteurs tels que PHT1.3, qui est un transporteur de haute affinité pour le phosphate. Une augmentation de la transcription et également de l'activité de la protéine FRO2, qui est à l'origine de la chélation et de la réduction du fer a été observée. Dans les feuilles, les vers de terre induisent de manière systémique la surexpression d'un transporteur de phosphate localisé dans les chloroplastes, PHT2.1 et la surexpression de transporteurs du fer appartenant à la famille des NRAMPs, notamment NRAMP1,2 et 6. Dans le contexte d'une problématique de phytoremédiation, l'effet des vers de terre sur la capacité de phytoextraction d'Arabidopsis a été testé et, il ressort clairement de cette étude que les vers de terre permettent une meilleure absorption d'antimoine et d'arsenic. Cependant, ces deux métalloïdes tendent à rester dans les racines et ne sont que faiblement transferrés vers les parties aériennes. Cette formidable augmentation des concentrations en polluants dans les racines entraîne un retard de croissance considérable et affecte, dans une moindre mesure cependant, l'activité photosynthétique et les échanges gazeux d'Arabidopsis. Ainsi, ce travail de thèse a donc tout d'abord démontré la sensibilité aux vers de terre de la plante modèle Arabidopsis thaliana. Ce système expérimental novateur offre de nouvelles possibilités de recherches dans le domaine des études des interactions entre les vers de terre et les plantes, notamment en raison de la grande diversité de mutants d'Arabidopsis. De plus, ce travail a également permis de démontrer le rôle crucial de catalyseur que peuvent jouer les vers de terre en vue d'optimisation des processus de phytoextraction

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Ce travail de thèse a cherché à déterminer si la contamination résiduelle à long terme des sols agricoles par les pesticides induit le développement de mécanismes d’adaptation aux pesticides chez les vers de terre. Il a aussi visé à identifier les coûts potentiels de l’adaptation de l’échelle de l’individu à celle de la population, et les conséquences pour l’écosystème sol. Une contamination résiduelle du sol par les pesticides est mesurée et comparée dans trois champs cultivés en agriculture conventionnelle (classés en fonction de l’historique cultural comme « haut », « moyen » et « bas » niveaux d’intrants), un champ cultivé en agriculture biologique et une prairie permanente biologique, tous dans ce type de management agricole depuis plus de 20 ans. En utilisant une méthode d’extraction des pesticides en milieu aqueux (représentant la fraction « biodisponible » des pesticides), 6, 8 et 4 résidus de pesticides sont détectés dans les champs à « haut », « moyen », et « bas » niveaux d’applications, respectivement, et un seul pesticide dans le sol du champ biologique (un résidu d’atrazine potentiellement vieux de plus de 20 ans). Les deux espèces endogées Allolobophora chlorotica et Aporrectodea caliginosa , communnes dans les sols des 5 champs,- mis à part A. chlorotica qui est absente du champ cultivé en agriculture biologique-, ont servi de modèles biologiques d’étude. Les stratégies d’adaptation aux pesticides sont étudiées en comparant les réponses de ces populations de vers de terre sur le terrain et après des expositions aux pesticides en laboratoire. Les réponses mesurées s’étendent de l’échelle moléculaire (enzymes de biotransformation et du stress oxidatif), biochimique (ressources énergétiques), métabolique (taux de respiration, métabolomique) à l’échelle de l’individu (biomasse, longueur) et de la population (traits de vie des cocons et des juvéniles), et aux possibles conséquences pour l’écosystème sol en termes de bioturbation (creusement et ingestion de sol) et de dissipation des pesticides comme service ecosystémique. Une capacité de détoxification augmentée et un plus grand potentiel anti-oxidant sont observés le long du gradient de contamination du sol et en laboratoire après exposition des vers de terre des champs conventionnel (population « pré-exposée ») et biologique (« naïve) à des pesticides. Des demandes énergétiques et des réarrangements métaboliques différents sont observés dans les deux populations, et sont plus prononcés chez la population pré-exposée. Une adaptation physiologique est démontrée chez les animaux pré-exposés, qui est associée à une ’augmentation de la bioturbation, et en cascade à une dissipation du pesticide dans le sol. Les conséquences au niveau de la population sont étudiées en termes de traits d’histoire de vie des deux populations pré-exposées et naïves. Le management en conventionnel incluant l’utilisation de pesticides semble diminuer le poids des adultes au champ, et implique potentiellement la réallocation des ressources énergétiques, des mécanismes reproductifs vers les processus métaboliques. Ceci aboutit à une diminution de la fécondité et du pourcentage d’éclosion et pourrait être un facteur participant à la diminution des populations de vers de terre dans les champs cultivés avec utilisation de produits phytosanitaires. / This work investigated if long-term residual contamination of agricultural soils leads to adaptation of earthworm populations to pesticides. It also aimed at identifying the costs of adaptation from the individual to the population level, and the consequences for the ecosystem. Residual contamination by pesticides was assessed and compared in three fields under conventional management (classified after evaluation of pesticide applications as ''high-'', ''medium-'', and ''low-''pesticide input), one field under organic agriculture requirements and one organic permanent pasture, all in this type of management for more than 20 years. Using a water extraction method, as indicative of the amount of bioavailable pesticides 6, 8 and 4 residues of pesticides were recovered in the ''high-'', ''medium-'', and ''low-input'' fields, respectively, and almost no pesticides were detected in the soil of the organic field except for low levels of residual (possibly 20 years old) atrazine. The endogeic species Aporrectodea caliginosa and Allolobophora chlorotica were found in common to the five fields, -except A. chlorotica which was absent from the organic field-, and were used as biological models. Adaptation strategies were investigated by comparing the populations of these earthworms between the different fields according to several endpoints in field and laboratory assessments. The endpoints measured ranged from the molecular (biotransformation and anti-oxidant enzymes), biochemical (main energy resources), and metabolic (respiration rate, metabolomics) levels, to individual (weight, length) and population-related parameters (cocoon and juvenile life traits), and to the possible consequences for the ecosystem in terms of bioturbation (earthworm burrowing behaviour) and pesticide disappearance as an crucial ecosystem service. Enhanced detoxification and anti-oxidant potential was demonstrated along the gradient of contamination in the fields, and in particular comparing the response to an experimental pesticide exposure between the pre-exposed, thus possibly adapted earthworms from the ''high-input'' field-, and the naïve population from the organic field. Distinct energetic demands and metabolic rearrangements were observed between the populations, more pronounced in the pre-exposed earthworms. Physiological adaptation was demonstrated in pre-exposed animals, and this was associated with an increase in burrowing behaviour and pesticide disappearance in the soil. Population-level consequences were assessed in life traits of the two populations. The conventional farming including the use of pesticides decreased the weight of adult worms in the field and resulted in reallocation of energy resources, possibly from reproductive to metabolic function. This led to lower fecundity and hatching success and could partly explain lower earthworm densities in pesticide-impacted soils. / I dette arbejde blev der forsket i om langsigtet residualforurening af landbrugsjord fører til pesticidadaptation hos regnorme. Forskningen sigtede også efter at identificere adaptations-omkostningerne fra individ- til populationsniveau, og konsekvenserne for økosystemet. Pesticiders residualforurening blev vurderet og sammenlignet i; tre konventionelt styrede marker (klassificeret efter evaluering af pesticid-anvendelser som ”højt-”, ”medium-”, og ”lav-input”), en mark styret ud fra økologiske betingelser, og et økologisk permanent græsningsareal, alle havde været styret på denne måde i mere end 20 år. Ved hjælp af en vand-ekstraktionsmetode blev 6,8 og 4 pesticidresiduums udvundet i henholdsvis ”høj-”, ”medium-”, og ”lav-input” markerne, og næsten ingen pesticider blev detekteret i jorden fra den økologiske mark bortset fra lave niveauer af resterende (højst sandsynligt 20 år gammelt) atrazin. Regnorms-populationerne Aporrectodea caliginosa og Allolobophora chlorotica blev fundet i alle fem marker, bortset fra A. chlorotica som ikke var til stede i den økologiske mark. Adaptationsstrategier blev undersøgt ved at sammenligne populationerne af disse regnorme de forskellige marker imellem ifølge flere parametre i felt- og laboratoriebedømmelserne. De målte parametre rangerede fra molekylære- (biotransformation og antioxiderende enzymer), biokemiske- (primære energiressourcer), og metaboliske- (respirationsrate, metabolomics) niveauer, til individuelle- (vægt, længde) og populations-relaterede parametre (puppe og juvenile livskarakterer), og til de mulige konsekvenser for økosystemet med hensyn til bioturbation (regnormes grave-adfærd) og nedgang i koncentrationen af ekstraherbare pesticider. Forbedret afgiftnings- og antioxiderende potentiale blev demonstreret langs gradienten af pesticid forurening i felten. Forbedret afgiftning i den pre-eksponerede population var særdeles tydeliggjort ved eksponeringen til pesticider i laboratoriet sammenliget med den økologiske population. Der blev observeret distinkte energibehov og metabolisk omgruppering populationerne imellem, dette var mere udtalt hos de pre-eksponerede regnorme. Der blev detekteret fysiologiske adaptationer hos de pre-eksponerede dyr, og dette hang sammen med en kompensatorisk øgning i grave-adfærd og nedgang i koncentrationen af ekstraherbare pesticider i jorden. Konsekvenser, på populationsniveau, blev bedømt ud fra de to populationers livskarakterer. Brug af pesticider resulterede i vægtnedgang hos de voksne orme i felten og omfordeling af energiressourcer, formodentlig fra reproduktiv til metabolisk funktion. Dette førte til lavere frugtbarhed og udklæknings-succes og kunne til dels forklare de lavere regnorme-densiteter i den pesticid-påvirkede jord.